TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr 902 - 903 Pham Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXBTrẻ,tr 798-799 Đỏ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y hoc, tr 852-853 Viên Dươc liêu (2004), Những thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa hoc kỹ thuật, tr 976-978 Flora of China (2003), Vol 5, pp 271 - 325 5, Mohammed Rahmatullah et al (2010), « Effect of Cuscuta reflexa stem and Calotropis procera leaf extracts on glucose tolerance in glucose-induced hyperglycemic rats and mice », Afr J.Tradit Complement Altern, Med 7(2), pp 109 -112 M Nisa, S Akbar, M Tariq and z Husain (1986), "Effect of Cuscuta chinensis water extract on 7,12-dimethylbenzo[a]anthraceneinduced skin f5apillomasand carcinomas in mice", J Ethnopharmacol 18, pp 21 - 31 ■ Wiley Periodical (2008),« Effect of Cuscuta reflexa Roxb on androgen - induced alopecia ", Inc Journal of cosmetic dermatology 7, pp 199-204 Xiao J, et al (1990)," Effect of alcohol extract from Polygonatum odoratum (Mill) Druce and Cuscuta australis R.Br on immunological function of mice injured by burn », zhonggue Zhong Yao Za zhi 15 (9), pp 557 - 559,578 10 http://www.Kew.org 11 http://www.IPNI.org Xây dựng phương pháp định lượng ba kháng sinh carbapenem huyết tương HPLC Trấn Mạnh Thông*, Pham Thị Thanh Hà*, Nguyễn Thị Kiểu Anh*, Nguyễn Thanh Hiển**, Nguyễn Quốc Kính**, Nguyễn Hoàng Anh* * Trường Đai hoc Dươc Hà Nội, ** Bênh viên Hữu nghị Việt Đức Từ khóa: carbapenem, imipenem, meropenem, ertapenem, HPLQ simultaneous assay SUM M ARY A simple, precise HPLC m ethod with uv detection has been developed for simultaneous determination o f three carbapenem antibiotics: imipenem, meropenem and ertapenem in hum an plasma After precipitation of protein with acetonitril, separations were performed on a Eclipsse, XDB-C8 column and peaks were eluted by a mobile phase com posed o f phosphate buffer 0,1 M (pH 7,4) and methanol/water in gradient elution mode Detection was by uv at 298 nm Calibration curves were linear from 0,5 ụg to 80 fjg/m lwith imipenem VỜ meropenem and from 0,5 ụg to 160 fjg/ml with ertapenem Accuracy ranged from -5,08% to 5% and precision below 6,4% This m ethod is suitable for therapeutic drug monitoring (TDM) o f carbapenerns in critically ill patients hospitalized in ICUs Đặt vấn đề Carbapenem nhóm kháng sinh có vị trí quan trọng điểu tri nhiễm khuẩn vi khuẩn kháng thuốc khoa Điểu trị tích cực (ICU) Tương tự beta-lactem khác, carbapenem nhóm kháng sinh phụ thilộc thời gian, hiệu phụ thuộc vào thời gian khoảng đưa liều mà nóng độ thuốc 12 Nghỉencúudưọc Thòng tlnthuõc dạng tự trì nổng độ ức chế tối thiểu (MIC) [1], Với nhiều yếu tố ảnh hưởng làm thay đổi dược động học kháng sinh bệnh nhân nặng với tượng giảm nhạy cảm, xuất lây lan nhanh chóng chủng vi khuẩn đề kháng Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae ICU, nhiểu nghiên cứu đá chế độ liều khuyến cáo carbapenem không đảm bảo đạt mục tiêu PK/PD [2] Do vậy, vai trò giám sát trị liệu (TDM) dựa vào nổng độ thuốc huyết tương để cá thể hóa điểu trị phác đổ dùng carbapenem công cụ hửu hiệu để tối ưu hiệu điểu trị, ngăn ngừa độc tính xuất kháng thuốc bệnh nhân nặng ICU [3], Để triển khai giám sát trị liệu, việc xây dựng phương pháp định lượng thuốc dịch sinh học khâu then chốt, đóng vai trò định Phương pháp định lượng cẩn đảm bảo xác định nhanh, xác thời nhiểu kháng sinh sửdụng Khoa ICU với trang thiết bị không phức tạp Phương pháp định lượng thời kháng sinh dịch sinh học cho phép tiết kiệm thời gian, dung môi, phù hợp với triển khai thường qui phục vụ công tác TDM [4] Trên giới, nhiều phương pháp HPLC xây dựng để định lượng kháng sinh carbapenem dịch sinh học, nhiên phương pháp xây dựng để định lượng carbapenem đơn độc đòi hỏi trang thiết bị không phổ biến điểu kiện phòng thí nghiệm Việt Nam [5, 6, 7] Trong báo trình bày phương pháp định lượng IMl Scarbapenem đượcsửdụng lâm sàng imipenem (IMI), meropenem (MER) ertapenem (ERT) huyết tương bệnh nhân HPLC với detector u v mẫu xử lý huyết tương xử lý qui trình đơn giản trước tiêm vào hệ thống sắc ký Hóa chất, thiết bi phương pháp nghiên cứu Hóa chát, chát chuẩn - Imipenem, meropenem ertapenem sử dụng dạng biệt dược nhà phát minh tương ứng Tienam® (Merck), Meronem® (Astrazeneca) INVANZ® (Merck) - Chất ổn định 3-morpholinopropanesulfonic (MOPS) (Sigma-Aldrich) - Các hóa chất, dung môi thuộc loại dùng cho HPLC tinh khiết phân tích (Merck, Đức) - Huyết tương trắng (Viện huyết học truyển máu Trung ương) Hệ thống sắc ký - Hệ thống HPLC detector uv Agilent 1200 Phương pháp nghiên cứu - Dung dịch chuẩn gốc carbapenem: cân xác lượng carbapenem rổi hòa tan dung dịch ổn định (MOPS 2,64%; pH 6,8) đê’ thu dung dịch chuẩn gốc IMI, MER, ERT có nồng độ mg/ml Pha loãng dung dịch gốc dung dịch ổn định để thu dung dịch chuẩn thứ cấp có nổng độ carbapenem nằm khoảng 0,5 đến 80,0 Ịjg/ml (riêng ERT: 0,5 đến 160,0 Ịjg/ml) - Dung dịch chuẩn nội (dùng định lượng với mẫu huyết tương bệnh nhân): MER 10 |jg/ml pha dung dịch ổn định (khi đinh lượng IMI); IM I10 |jg/ml pha dung dịch ổn định (khi định lượng MERhoặcERT) - Xây dựng phương pháp định lượng: + Điểu kiện sắc ký: lựa chọn thành phẩn pH pha động, ảnh hưởng có mặt đối ion, chương trình gradient dung môi, tốc độ dòng, cho kết tách tốt carbapenem sắc đổ bước sóng cho đáp ứng thích hợp + Khảo sát lựa chọn tác nhân kết tủa protein (acid peclorid, acetonitril) để xử lý mẫu huyết tương chứa carbapenem Tính hiệu suất chiết carbapenem từ mẫu huyết tương phương pháp xử lý mẫu lựa chọn - Thẩm định phương pháp định lượng xây dựng theo hướng dẫn FDA tiêu chí: tính chọn lọc, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ ổn định, xác định giới hạn định lượng (LOQ) Kết bàn luận Khảo sát lựa chọn phương pháp xử lý mấu huyết tương chương trình sắc ký Sau tham khảo phương pháp định lượng carbapenem dịch sinh học đà công bố, chúng tòi định sử dụng phương pháp Legrand cộng [5] làm điéu kiện ban đẩu để triển khai sắc ký Để thích ứng với hệ thống sắc ký Agilent 1200 cột sắc ký lựa chọn (Eclipse, XDB-C8; 4,6 X 150 mm, |am), thành phẩn pha động, pH hệ đệm, ảnh hưởng có mặt chất đối ion (tetrabutyl amoni bromid) đến độ doãng chân pic, chương trình gradient pha động, tốc độ dòng pha động, bước sóng làm việc detector khảo sát Chúng xác định điểu kiện sắc ký để tách kháng sinh carbapenem sau: Điều kiện sác ký: Cột sắc ký: Eclipse, XDB-C8 (4,6 X 150 mm, um) Pha động Kênh A: Dung dịch đệm phophat 0,1 M; pH = 7,4 Kênh B: dung dịch methanol 40% nước (v/v) Chế độ pha động (gradient): - Detector UV: 298 nm Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 50 |jl Thời gian định lượng: 19 phút Xử lý mẫu huyết tương bệnh nhân: Mục tiêu của xây dựng phương pháp xử lý mẫu đơn giản thòng qua kết tủa protein huyết tương trước tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký Hai tác nhân kết tủa protein đả khảo sát acid peclorid (72%) acetonitril Acid peclorid gây phân hủy mạnh kháng sinh carbapenem mẫu huyết tương sử dụng để xử lý mẫu Sửdụng acetonitril đểkếttủa protein huyếttương cho thấy acetonitril có tương tác với ertapenem meropenem làm biến dạng hình dạng pic tương ứng chất Acetonitril tương tác mạnh với imipenem, khiến pic imipenem không tách khỏi pic từ nễn huyết tương Vì D M 01 c S g - Ô , i e R « t = o tt (K O 1_ T H O N o v s 02 00 D ) định loại acetonitril cách bay nhiệt độ phòng tác động dòng khí nitơ thổi bể mặt dung dịch Phương pháp cho hiệu suất chiết carbapenem từ mẫu cao (>98%) Qui trình xử lý huyết tương xác định là: 400 |j| huyết tương có chứa carbapenem (có mặt chất ổn định MOPS) trộn với 100 |jl dung dịch chuẩn nội Thêm 500 |j| acetonitril để kết tủa protein Hỗn hợp lắc rung, để yên phút sau ly tâm tốc độ 6500 vòng 10 phút Hút 500 |jl dịch đem bay hoàn toàn dung môi dòng khí nitơ Cắn thu hòa tan lại 200 |jl dung dịch ổn định MOPS để tiêm vào hệ thống sắc ký Thẩm định phương pháp phán tích Tính chọn lọc phương pháp Mầu huyết tương trắng mẫu huyết tương chứa thời IMI, ERT MER (nổng độ 10 |jg/ml) xử lý phân tích theo phương pháp đả xây dựng Trên sắc ký đổ mẫu huyết tương trắng (hình 1) sắc đổ mẫu trắng cho thấy vị trí tương ứng với thời gian lưu IMI, ERT MER không xuất pic tạp Pic carbapenem tách hoàn toàn khỏi với thời gian lưu imipenem, ertapenem meropenem tương ứng 7,3 phút, 14,1 phút 15,3 phút Tương tự, có mặt thuốc hay sử dụng gây mê hổi sức Ngoại khoa không làm thay đổi hình dạng độ sắc pic carbapenem sắc đồ Do vậy, phương pháp đáp ứng yêu cẩu vể tính chọn lọc theo tiêu chuẩn Khoảng tuyến tính Tiến hành pha mẫu huyết tương chứa chuẩn carbapenem nồng độ khoảng 0,5 - 80 |jg/ml, riêng ERTIà 0,5 -160 |jg/ml phân tích theo quy trình xây dựng Xác định tương quan nổng độ kháng sinh tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/chất chuẩn nội (bảng 1) Các hệ sổ tương quan tuyến tính xấp xỉ nống độ carbapenem với tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/chất chuẩn nội có tương quan tuyến tính chặt chẽ Bảng ì Sự phụ Ihuốí giữũ tỷ lê diện tích pic (châphán tích/chuổn nội) vã ỉìỗng độ arbũpenem phú tionq huỳồ tương Imipenem Ertapenem Meropenem Phương trình hổi qui y = 0,1599x + 0,0118 y = 0,1549x + 0,0714 y = 0,1850x + 0,1054 Hệ số tương quan r = 0,9993 r = 0,9998 r = 0,9997 Xác định độ đúng, độ lặp lại phương pháp Tiến hành thẩm định độ đúng, lập lại lô mẫu thử có chứa nóng độ thấp, nóng độ trung bình nổng độ cao (LQC, MQC HQC) carbapenem (bảng 2) Nồng độ carbapenem có mẫu xác định phương pháp đường chuẩn từ xác định tỷ lệ % nống độ xác định so với nóng độ thực carnapenem có mẫu để tính độ Tính xác (độ lặp lại) phương pháp xác định từ độ lệch chuẩn tương đổi (RSD) Kết cho thấy ba nống độ (thấp, trung bình cao), phương pháp có độ tốt (-5.08 - 5% lệch so với nổng độ lý thuyết) độ lặp lại cao (RSD < 7%) Bángl K thốm định đỗ đúng, độ lộp lũicủũ phương pháp Im ipe nem LQ C ,5 |ig/ tnl M Q C20M 9/ ml H Q C60|tg/m l Độ -2,6% -5% -3,5% RSD 5,91% 4,73% 6,31% Ertap en em LQ C0,5 pg/ ml M Q C 40|ig/ ml H Q C 20 |ig/m l Độ -3,2% -2,25% -5.08% RSD 2,51% 1,86% 3,93% M eropenem L Q C ,5 n g / ml M Q C20|ig/ ml H Q C 0|ig/m l Độ 3,8% 5% 2,83% RSD 2,75% 2,42% 2,91% Giới hạn định lượng Giới hạn định lượng (LOQ) nóng độ thấp đường chuẩn (0,5 ng/ml với ba carbapenem) nống độ này, độ xác có RSD không 20% độ không lệch 20% Độ ổn định mẫu huyết tương Độ ổn định mẫu huyết tương sau ba chu kỳ đông rã đông, độ ổn định nhiệt độ phòng độ ổn định bảo quản kéo dài nghiên cứu Độ ổn định thuốc xác định sau chu kỳ đông - rã đông nóng độ LQC, MQC, HQC đói với carbapenem, nóng độ xác định mẫu huyết tương Mẫu để đông nhiệt độ -40°c 24 sau mẫu rã đông nhiệt độ phòng Lặp lại chu kỳ đến rã đông lán thứ ba mẫu phân tích định lượng Độ ổn định nhiệt độ phòng xác định nóng độ LQC, MQC, HQC, nồng độ xác định mẫu huyết tương với carbapenem Các mẫu xử lý rói bảo quản nhiệt độ phòng Vào thời điểm 0, 2, 4, 6, tiến hành phân tích mẫu, kết tính theo đường chuẩn ngày Độ ổn định mẫu bảo quản kéo dài xác định nóng độ LQC, MQC, HQC đổi với carbapenem, nóng độ xác định mẫu huyết tương Mẫu bảo quản nhiệt độ -40°c lượng vào ngày 0,7,14 Kết phân tích cho thấy mẫu trải qua chu kỳ đông-rã đông, mẫu định lượng ngày nhiệt độ phòng đểu giữ độ ổn định mẫu, đảm bảo với hàm lượng carbapenem lại mẫu cao 80% so với thời điểm ban đáu Với mẫu huyết tương bảo quản kéo dài -40°c, sau ngày hàm lượng carbapnem lại dao động khoảng 83,7%-90,1% so với mẫu ban đáu Trong carbapenem sau 14 ngày, nóng độ LQC, carbapenem không phát sau 14 ngày Với hai nóng độ lại, hàm lượng carbapenem lại 51,4% - 59,6% so với mẫu ban đấu Do thời gian tối đa bảo quản mẫu huyết tương có chứa carbapenem nhiệt độ -40°c ngày Ăp dụng định lượng mẫu huyết tương từ bệnh nhân Phương pháp định lượng áp dụng với mẫu huyết tương thu từ bệnh nhân điều DAD1 c S I - R * f - o t t (M B _ T H O N O \3 K S O a D ) In ũ p e n c m C huấn nội M e ro p e n e n i 40 i 20 l ẳJ ì Kinh Sổc đỗ cùa ĩĩìâu huyết tương thu đưac từ bênh â íì, tợi thời điỂm két thúc (S Ũ U Ih) ímyễn tĩnh rriũch imipíieĩĩì (1000 íĩìgì trị khoa Gây mê Hổi sức, Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức Bệnh nhân điểu trị Tienam (Imipenem) với phác đỗ 1g truyền tĩnh mạch 60 phút, h lần Máu huyết tương lấy vào ngày thứ sau bắt đẩu điều trị Mẫu máu chống đòng heparin đem ly tâm để thu huyết tương Trộn thể tích huyết tương dung dịch ổn định MOPS bảo quản -40°c Mẫu huyết tương rã đông ngày sau lấy mẫu, xử lý phân tích theo qui trình Sắc mẫu huyết tương thu kết thúc truyền (tương ứng với c ) trình bày hình Tính toán theo đường chuẩn xây dựng, nổng độ imipenem mẫu 18,1 ng/ml Kết luận Đả xây dựng phương pháp định lượng imipenem, ertapenem meropenem huyết tương với độ xác cao, độ tốt, khoảng tuyến tính rộng với tương quan tuyến tính chặt chẽ nóng độ tỷ số diện tích pic chất phân tích/chất chuẩn nội Mầu huyết tương độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã đỏng, nhiệt độ phòng bảo quản kéo dài -40°c ngày sau lấy mẫu Phương pháp ứng dụng để phân tích mẫu huyết tương giám sát điểu trị carbapenem Khoa điểu trị tích cực TÀI LIỆU THAM KHẢO Lod ise TP, Lom aestro BM, D rusan o G L, 2006, "A p p licatio n o f an tim icro b ial p h arm aco d yn am ic c o n ce p ts into clin ical practice: Focu s on [5-lactam antibiotics", Pharmacotherapy, 26, pp 1320-1332 G ian n o n i E, M oreillon p, C o ttin g J et al, 2006, "Pro spective d ete rm in atio n o f p lasm a im ip e n em co n cen tratio n s in critically ill children", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50, pp 2563-2558 Robert JA , U lld e m o lin s M, Roberts M S et al, 2010, 'Th e p e u tic d ru g m o n ito rin g o f p -lactam s in critically III patients: p ro o f o f cepts", International Journal of Antimicrobial Agents, 36, pp 332-339, M cW h in n ey BC, W allis sc, H illister T et al, 2010, "A n alysis o f 12 b eta-lactam an tib io tics in h u m an p lasm a by H P LC w ith ultraviolet detection", Journal of Chromatography B, 878, pp 2039-2043 Legran d T, C h h u n s, Rey E et al, 2008, "Sim u ltan eou s d ete rm in atio n o f three carb ap e n em an tib io tics in p lasm a by H P LC w ith ultraviolet detection", Journal of chromatography B, 875:551 -556 Ta n ig u ch i s, H am ase K, Kino sh ita A et al, 1999, "Sim p le and rapid analytical m eth od for ca rb a p e n e m s u sin g cap illary zo n e electrophoresis", Jo u rn al o f C h ro m a to g p h y B, 727; 219-225 D ailly E, Bo u qu ie R, D e slan d es G, Jo lliet p, Le Floch R, (2011), "A liquid c h ro m a to gra p h y assay for a q u an tificatio n o f rip en e m , ertap en em , im ip e n em , m erop en e m co n cen tratio n s in h u m an plasm a: ap p lica tio n to a clin ical p h arm aco kin etic study", Jo u rn al o f C h ro m a to g p h y B, 879, p p 1137 -1 16 Ighien CỨU duợc Thong tin uoc ... vụ công tác TDM [4] Trên giới, nhiều phương pháp HPLC xây dựng để định lượng kháng sinh carbapenem dịch sinh học, nhiên phương pháp xây dựng để định lượng carbapenem đơn độc đòi hỏi trang thiết... mẫu ban đấu Do thời gian tối đa bảo quản mẫu huyết tương có chứa carbapenem nhiệt độ -40°c ngày Ăp dụng định lượng mẫu huyết tương từ bệnh nhân Phương pháp định lượng áp dụng với mẫu huyết tương. .. hạn định lượng (LOQ) Kết bàn luận Khảo sát lựa chọn phương pháp xử lý mấu huyết tương chương trình sắc ký Sau tham khảo phương pháp định lượng carbapenem dịch sinh học đà công bố, chúng tòi định