XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT s ố HỢP CHÁT PHÂN LẬP TỪ CÂY GẠO (Bombax Malabaricum DC.) Phạm Lê Minh* HDKH: PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu^ PGS.TS Nguyễn Thái An^ ' môn Hoá Phân tích Độc chất; ^Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia; ^Phòng Quản lý Sinh viên - Trường Đại học Dược Hà Nội Từkhoả: Bombax malabarỉcum, Gạo, HPLC Tóm tắt Từ mẫu vỏ thân Gạo dùng nghiên cứu xác định hàm lượng chất nghiên cứu cỏ 100 g dược liệu sau: epỉcatechin 12,3 mg; catechỉn 6,7 mg; daucosteroỉ 1,8 mg; lupeol 9,4 mg; stigmasteroỉ 1,9 mg friedelin 7,6 mg Từ mẫu Gạo dùng nghiên cứu chủng xác định hàm lượng chất nghiên cứu có 100 g Gạo khô sau mangiferin 8,1 mg, daucosterol 1,1 mg, 7ahydroxysitosterol 0,9 mg, lupeol 5,7 mg, taraxeryl acetat 4,1 mg, stigmasteroỉ 0,9 mg taraxerol 5,1 mg Đặt vấn đề Cây Gạo (Bombax malabaricum DC.) gỗ cao đến 15 m, có hoa màu đỏ tươi, biết đến thuốc dân gian nước Pakistan, Ắn Độ, Trung Quốc, Việt Nam Châu Phi Nghiên cứu với vỏ thân Gạo thu hái Hà Nội, tác giả phân lập số thành phần epicatechin [1], catechin, momor-cerebroside I [2], lupeol, stigmasterol [3], friedelin daucosterol Với Gạo thu hái Hà Nội, phân lập số thành phần như: mangiferin, lupeol, taraxerol, taraxeryl acetat, stigmasterol, 7a-hydroxysitosterol daucosterol [4], Trong khuôn khổ báo cáo này, tiếp tục mô tả trình nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng họp chất phân lập vỏ thân Gạo Nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu Hóa chất thiết bị - Máy sắc kí lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS 8030 có kết nối thêm detector SPD-20A (có khả phân tích UV-VIS vùng 190-700 nm) Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm mỹ phẩm Hà Nội - Cột sắc kí Zorbax C18 (250 mm; 4,6 mm, ^m) kết hợp bảo vệ cột Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15 X 30 mm ID) - Cân phân tích Mettler Toledo độ xác 0,01 mg - Hóa chất tinh khiết phân tích; acid formic - Dung môi loại dùng cho HPLC: methanol, acetonitril - Các họp chất phân lập từ Gạo mangiferin, lupeol, taraxerol, taraxeryl acetat, stigmasterol, 7a-hydroxysitosterol daucosterol nhận dạng cấu trúc phương pháp phổ MS NMR - Các hợp chất phân lập từ vỏ thân Gạo epicatechin, catechin, lupeol, stigmasterol, friedelin daucosterol nhận dạng cấu trúc phương pháp phổ MS NMR Mấu nghiên cứu Mau nghiên cứu vỏ thân Gạo (được làm khô tự nhiên) thu hái Hương Sơn (Mỹ Đức, Hà Nội) TS Trần Huy Thái (Viện Sinh thái Tài nguyên sinh học) giám định tên khoa học là: Bombax malabaricum DC., họ Gạo (Bombacaceae) Phương pháp nghiên cứu - Đánh giá tổng tạp có mẫu hợp chất phân lập tinh chế phương pháp chuẩn hóa diện tích - Khảo sát điều kiện sắc ký với HPLC để tách hoàn toàn hợp chất hỗn họp hợp chất nghiên cứu với với họp chất khác cao lỏng vỏ thân Gạo - Định tính pic sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu kết hợp với MS kết nối - Thẩm định điều kiện định lượng số hợp chất với chất đối chiếu chất phân lập qua nhận dạng cấu trúc xác định tổng tạp chất phương pháp chuẩn hóa diện tích - Áp dụng để sơ xác định hàm lượng hợp chất có mẫu vỏ thân Gạo thu hái Kết bàn luận Chuẩn bị mẫu thử Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chọn phương pháp xử lý mẫu tương đối phù họp sau; cân khoảng 500 g dược liệu vỏ thân Gạo (đã xác định độ ẩm trước) làm nhỏ, ngâm lạnh lần với methanol 24 giờ, 48 72 giờ, thu dịch chiết, lọc, cất thu hồi dung môi áp suất giảm Cân cắn toàn phần thu bảo quản cắn 4°c Hiệu suất chiết 4,28% vỏ thân 5,4% Lấy khoảng 0,5000 g cắn, pha vào bình định mức 25 mL, lọc qua thủy tinh, qua màng lọc 0,45 ịim trước tiêm mẫu vào hệ thống HPLC Chọn điều kiện sắc kỷ Cột sắc kí sử dụng cột Zorbax C18 (250 mm; 4,6 mm, ịxm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15 X 30 mm ID) nhiệt độ 25°c Điều kiện sắc ký với dịch chiết vỏ thân Gạo: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A acid formic 0,1% acetonitril kênh B acid formic 0,1% methanol (B) Tỷ lệ kênh A-B ban đầu (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A-B (40:60) phút thứ 6, thay đổi tuyến tính đạt đến A-B (50:50) phút thứ 23 Thay đổi tuyến tính lại A-B (40:60) phút thứ 27 cuối pha động thay đổi tuyến tính tỷ lệ A-B (30:70) ban đầu phút thứ 30 Tốc độ dòng 0,7 mL/phút Thể tích tiêm mẫu 10 fú Bước sóng phát 280 nm (detector SPD-20A) ị!h „_IuL a„ì , a) ^ ^ b) Hình Sắc ký đồ hỗn hợp chất nghiên cứu (a) mẫu thử chuẩn bị từ vỏ thân Gạo (b) ■ ìi ].• —r -ĩ,—'i— b) ị lỊ cj d) ^ e) ^ Hình Sắc ký đồ chất nghiên cứu epicatechin (a), catechin (b), daucosterol (c), lupeol (d), stigmasterol (e) friedelin (í) Với điều kiện sắc ký phương pháp xử lý mẫu lựa chọn, sắc ký đồ thu cho pic tách rõ ràng Nhiễu thấp thể qua sẳc ký đồ mẫu thử chuẩn bị từ vỏ thân Gạo (hình Ib) hỗn họp chất nghiên cứu (hình la) Trên sắc ký đồ, mẫu thử có thời gian lưu trùng với thời gian lưu pic epicatechin, catechin, daucosterol, lupeol, stigmasterol friedelin 4,370; 5,401; 7,890; 11,380; 17,910 va 21,350 phút (hình 2) Điều kiện sắc ký với dịch chiết Gạo: Sử dụng chế độ gradient dung môi vói kênh A acid formic 0,1% acetonitril kênh B acid formic 0,1% methanol Tỷ lệ kênh A-B ban đầu (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A-B (35:65) phút thứ 10, thay đổi tuyển tính đạt tới A-B (40:60) phút thứ 15, tiếp tục thay đổi tuyến tính tới A-B (45:55) phút thứ 25 Thay đổi tuyến tính ừở pha động A-B (40:60) phút thứ 27 thay đổi tuyến tính lại tỷ lệ A-B (30:70) ban đầu phút tìiứ 30 Tốc độ dòng 1,0 mL/phút Thể tích tiêm mẫu 10 /xL Bước sóng phát 280 nm (detector SPD-20A) i i _,ỉ i l j l M a) ỊỊ , M • b!> ^ Jl -_A u ủ- , Hình Sắc ký đồ hỗn hợp chất nghiên cứu (a) mẫu thử chuẩn bị từ Gạo (b) Với điều kiện sắc ký phương pháp xử lý mẫu lựa chọn, sắc ký đồ thu cho pic tách rõ ràng Nhiễu thấp thể qua sắc ký đồ mẫu thử chuẩn bị từ Gạo (hình 3b) hỗn hợp chất nghiên cứu (hình 3a) Trên sắc ký đồ, mẫu thử chuẩn bị từ Gạo có pic có thời gian lưu ừìing với pic mangiferin, daucosterol, 7a-hydroxysitosterol, lupeol, taraxeryl acetat, stigmasterol taraxerol 4,420; 7,124; 9,501; 12,110; 15,190; 18,001 25,091 phút (hình 4) a) b) c) d) _ s ■ e) Í) Hình Sắc ký đồ chất nghiên cứu mangiferin (a), daucosterol (b), 7a-hydroxysitosterol (c), lupeol (d), taraxeryl acetat (e), stigmasterol (f) taraxerol (g) Xác định độ tinh khiết hợp chất nghiên cứu Các chất nghiên cứu cân xác hòa tan thành dung dịch methanol tiêm vào hệ thống sắc ký Hàm lượng hợp chất nghiên cứu đánh giá qua tổng tạp có chúng sau phân lập tinh chế để xác định cấu trúc Tổng tạp họp chất đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích với cột Zorbax C18 (250 mm; 4,6 mm, 5fim) Pha động sử dụng chế độ gradient xác định Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 /xL Nhận dạng pic phổ khối lượng Chế độ đo: ESI+ với tốc độ khí phun L/phút, tốc độ khí làm khô 15 L/phút, nhiệt độ mao quản 250°c, nhiệt độ heat block 400°c, vùng quét m/z 100-1000 Thế phá mảnh +4,5 kV Các sắc ký đồ hình hình cho thấy họp chất không xuất pic tạp chất (trong thời gian sắc ký 30 phút) nên sử dụng hợp chất làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu Tuy nhiên lượng họp chất phân lập thời gian chưa cho phép, tạm dùng chúng chất đối chiếu để khảo sát phưong pháp định lượng chúng vỏ thân Gạo Thẩm định phương pháp định lượng chất vỏ thân Gạo Định tính so sánh phổ khối lượng pic thời gian lưu mẫu thử hỗn họp chất đối chiếu Kết hoàn toàn phù hợp Kiểm tra tỉnh thích hợp hệ thống Tính thích hợp hệ thống sắc ký đánh giá qua kết tiêm lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện chọn Kết thu bảng Bảng Kết khảo sát tính thích hợp Sô đĩa lý Hệ sô thuyết trung bất đối tích pic (%) bình trung bình 0,11 0,12 22320 1,11 Catechin 0,13 0,14 23230 1,05 D aucosterol 0,12 0,15 24550 1,10 Lupeol 0,14 0,21 34660 1,07 Stigm asterol 0,16 0,20 35140 1,04 Friedelin 0,15 0,14 32340 1,12 RSD thòi RSD diện gian lưu (%) Epicatechin Hoạt chất Các điêu kiện săc ký lựa chọn hệ thông HPLC sử dụng phù hợp đảm bảo ổn định phép phân tích định lượng hợp chất Khảo sát khoảng nồng độ tuyển tính Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính họp chất bảng Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính H ọp chất Nồng độ C Phưong trình hồi quy (HgỉmL) (Diện tích pic S: mAU.s) Hệ sô tưong q uan r Epicatechin 4,6-45,9 s = 1603,26.C + 0,57 1,0000 Catechin 3,8-38,0 s = 4226,32.C+280.58 0,9999 • Lupeol 4,5-44,8 s = 2126,83.c + 27,08 1,0000 Friedelin 5,3-42,7 s = 1375,7 C -281,07 0,9999 Stigmasterol 2,4-24,0 s = 1456,32.C -3,05 1,0000 Daucosterol 1,7-34,0 s = ,7 c - 231,97 0,9999 Giới hạn phát giới hạn định lượng Giới hạn phát giới hạn định lượng hợp chất xác định epicatechin (0,50 1,25 /xg/mL), catechin (0,50 1,25 /ig/mL), lupeol (0,61 1,43 /ig/mL), friedelin (0,80 1,60 /xg/mL), stigmasterol (0,32 0,91 /xg/mL) daucosterol (0,34 0,80 ịig/mL) Khảo sát độ phương pháp Độ phương pháp kiểm tra phương pháp thêm chuẩn họp chất nghiên cứu vào mẫu thử Tiến hành với mẫu lấy giá trị trung bình Kết thu bảng Bảng Kết kiểm tra độ Họp chất Tỷ lệ thu hôi (%) Nồng độ thêm vào mẫu min-max Trung bình (/íg/mL) Epicatechin 7,34 99,20 7,44- 99,84 Catechin 3,04 99,21 96,58 - 101,26 Lupeol 7,17 100,88 99,82 - 101,74 Friedelin 4,27 99,77 95,33 - 102,68 Stigmasterol 1,92 100,61 99,07 - 102,43 Daucosterol 1,36 101,42 9,97- 102,19 Các kết cho phép tiến hành định tính, định lượng hợp chất vỏ thân Gạo HPLC Thẩm định phương pháp định lượng chất Gạo Định tính so sánh phổ khối lượng pic thời gian lưu mẫu thử hỗn hợp chất đối chiếu Kết hoàn toàn phù hợp Kiểm tra tính thích hợp hệ thống Tính thích họp hệ thống sắc ký đánh giá qua kết tiêm lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký với điều kiện chọn Ket thu bảng Bảng Kết khảo sát tính thích họp Họp chất RSD Ír(%) RSD diện tích pic (%) Sô đĩa lý thuyết Hệ sô bất đối Mangiferin 0,15 0,14 32340 1,12 Daucosterol 0,12 0,16 24550 1,10 a-hydroxysitosterol 0,14 0,11 43260 1,07 Lupeol 0,14 0,21 34660 1,07 Taraxeryl acetat 0,13 0,14 23230 1,05 Stigmasterol 0,16 0,21 35140 1,04 Taraxerol 0,11 0,12 22320 1,11 Các điều kiện sắc ký lựa chọn hệ thổng HPLC sử dụng phù họp đảm bảo ổn định phép phân tích định lượng họp chất Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tỉnh Kết khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính họp chất bảng Bảng Kết khảo sát khoảng tuyến tính Họp chất Nông độ C PhưoTig trình hồi quy (Diện tích pic S: mAU.s) (/íg/mL) Hệ số tưoTig quan r Mangiferin 4,0-48,2 s=4347,28.c-1456,28 0,9997 Daucosterol 1,7-34,0 S=2093,72.C-232,08 0,9999 1,7-34,4 s = 836,28.C-25,24 1,0000 Lupeol 4,5-44,8 s = 2129,05.C-31,34 1,0000 Taraxeryl acetat 6,4-50,9 S=1286,10.C+853,84 0,9995 Stigmasterol 3,6-36,4 s = 959,80.c+17,58 Taraxerol 5,5-55,2 S = 1602,88.C-27,29 1,0000 1,0000 7a-hydroxy sitosterol Giới hạn phát giới hạn định lượng Giới hạn phát giới hạn định lượng họp chất xác định mangiferin (1,67 3,35 ịigỉmL), daucosterol (0,34 0,80 j^tg/mL), 7ahydroxysitosterol (0,33 0,96 ịiglmL), lupeol (0,61 1,43 /íg/mL), taraxeryl acetat (1,80 4,07 ỊXglmL), stigmasterol (0,32 0,91 Mg/mL) taraxerol (0,83 2,94 ixg/mL) Khảo sát độ đủng phương pháp Độ phương pháp kiểm tra phưong pháp thêm chuẩn hợp chất nghiên cứu vào mẫu thử Tiến hành với mẫu lấy giá trị trung bình Kết thu bảng Bảng Kết kiểm tra độ Nông độ thêm vào Họp chất mâu (/ig/mL) Tỷ lệ thu hôi (%) Trung bình (min-max) Marigiferin 6,43 100,69 98,34-102,04 Daucosterol 2,72 101,42 100,58-102,19 7a- 2,75 100,75 100,02-101,76 Lupeol 7,17 100,22 99,54-101,48 Taraxeryl acetat 5,09 100,25 98,85-102,61 Stigmasterol 1,92 101,22 100,28-102,27 Taraxerol 4,42 hydroxysitosterol 100,10 X -í chất Gạo HPLC , 99,00-101,84 Kết xác định hàm lượng sơ hợp chất mẫu vỏ thân Gạo Từ mẫu vỏ thân Gạo dùng nghiên cứu xác định hàm lượng chất nghiên cứu có 100 g dược liệu sau: epicatechin 12,3 mg; catechin 6,7 mg; daucosterol 1,8 mg; lupeol 9,4 mg; stigmasterol 1,9 mg friedelin 7,6 mg Từ mẫu Gạo dùng nghiên cứu xác định hàm lượng chất nghiên cứu có 100 g Gạo khô sau mangiferin 8,1 mg, daucosterol 1,1 mg, 7a-hydroxysitosterol 0,9 mg, lupeol 5,7 mg, taraxeryl acetat 4,1 mg, stigmasterol 0,9 mg taraxerol 5,1 mg Cần làm thêm số lượng mẫu đủ lớn để có số liệu xác hàm lượng chất có vỏ thân Gạo Tài liệu tham khảo Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An, Phan Văn Kiệm (2011), Phân lập nhận dạng epicatechin từ vỏ thân Gạo Bombax malabaricum DC., họ Gạo Bombacaceae, Tạp chí Dược học, (422), tr 19-20, 44,57 Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2012), Phân lập catechin momor-cerebrosid I từ vỏ thân gạo (Bombax malabaricum DC), Tạp chí Dược học, 12 (440), tr 49-52 Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2013), Phân lập lupeol stigmasterol từ vỏ thân gạo {Bombax malabarỉcum DC.), Tạp chí Dược học, 3(443), tr.14-18 Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2013), Kết phân lập nhận dạng taraxeryl acetat, taraxerol 7a-hydroxysitosterol từ Gạo {Bombax malabaricum DC.), Tạp Dược học, (444), tr 28-33 ... định tính, định lượng hợp chất vỏ thân Gạo HPLC Thẩm định phương pháp định lượng chất Gạo Định tính so sánh phổ khối lượng pic thời gian lưu mẫu thử hỗn hợp chất đối chiếu Kết hoàn toàn phù hợp. .. 4) a) b) c) d) _ s ■ e) ) Hình Sắc ký đồ chất nghiên cứu mangiferin (a), daucosterol (b), 7a-hydroxysitosterol (c), lupeol (d), taraxeryl acetat (e), stigmasterol (f) taraxerol (g) Xác định. .. hydroxysitosterol 100,10 X -í chất Gạo HPLC , 99,00-101,84 Kết xác định hàm lượng sơ hợp chất mẫu vỏ thân Gạo Từ mẫu vỏ thân Gạo dùng nghiên cứu xác định hàm lượng chất nghiên cứu có 100 g dược