Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cây cỏ seo gà

1 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN HẢI ĐƢỜNG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ CÂY CỎ SEO GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2014 2 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN HẢI ĐƢỜNG XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ CÂY CỎ SEO GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu NCS.ThS. Nguyễn Duy Chí Nơi thực hiện: Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dƣợc và trang thiết bị y tế Quân đội HÀ NỘI – 2014 3 MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật 2 1.1.2. Thành phần hóa học 2 1.1.3. Tác dụng dƣợc lý 4 1.1.4. Công dụng 6 1.2. MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ CỎ SEO GÀ 6 1.2.1. Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid 6 1.2.2. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid 7 1.2.3. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β- D-glucopyranosid] 9 1.2.4. 3,4-dihydroxybenzandehyd 10 1.2.5. Kaempferitrin 11 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 12 1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao 12 1.3.2. Máy HPLC 13 1.3.3. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký 13 1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC 15 1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) 17 4 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 19 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 19 2.1.2. Dung môi, hóa chất 19 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị 19 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 20 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử 21 2.3.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu 22 2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 22 2.3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 23 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 26 CHƢƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 27 3.1. ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN 27 3.1.1. Độ ẩm của dƣợc liệu 27 3.1.2. Chiết xuất 27 3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 28 3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký 29 3.2.2. Lựa chọn pha động 30 3.2.3. Lựa chọn tốc độ dòng 30 3.2.4. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện 30 3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ CỎ SEO GÀ 34 3.4. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ SEO GÀ 37 5 3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký 37 3.4.2. Độ lặp lại của phƣơng pháp 39 3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính 41 3.4.4. Độ đúng 45 3.4.5. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) 48 3.5. ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ SEO GÀ 49 3.5.1. Phân tích các phân đoạn thu đƣợc trong quá trình chiết xuất cây Cỏ Seo gà 49 3.5.2. Xác định hàm lƣợng các chất có trong cây Cỏ Seo gà 52 CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN 54 4.1. VỀ PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU 54 4.2. VỀ VIỆC TẠM DÙNG CÁC CHẤT ĐỐI CHIẾU ĐỂ XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP 54 4.3. VỀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 55 4.4. VỀ THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP 56 4.5. VỀ KẾT QUẢ ĐỊNH LƢỢNG CÁC CHẤT VÀ SO SÁNH THÀNH PHẦN CÁC PHÂN ĐOẠN 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 59 KẾT LUẬN 59 ĐỀ XUẤT 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 6 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AEPM: Dịch chiết Cỏ Seo gà (aqueous extracts of Pretis multifida Poiret) DAD: Detector mảng diod (Diod Array Detector) DMSO: Dimethyl sulfoxid HDL – cholesterol:Lipoprotein tỷ trọng cao mang Cholesterol (High Density Lipoprotein Cholesterol) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid Chromatography) HPLC – MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High- Performance Liquid Chromatography – Mass Spectrometry) IR: Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) LDL – cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng thấp mang Cholesterol (Low Density Lipoprotein Cholesterol) LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lƣợng (Limit of Qualification) NMR: Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) RSD: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation) S/N: Tín hiệu/nhiễu đƣờng nền (Signal/Noise) SKĐ: Sắc ký đồ STT: Số thứ tự UV – Vis: Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet Visible) 7 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm bột dƣợc liệu 27 Bảng 3.2. Hiệu suất chiết cắn các phân đoạn chiết xuất từ cây Cỏ Seo gà 28 Bảng 3.3. Một số thông số trên phổ UV-Vis của các chất nghiên cứu. 32 Bảng 3.4. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về thời gian lƣu. 37 Bảng 3.5. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về diện tích pic. 38 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM3. 39 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM12. 40 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM18. 40 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM15. 41 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM9. 41 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM3. 42 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM12. 42 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM18. 43 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM15. 44 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM9. 44 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng với PM3. 45 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng với PM12. 46 Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng với PM18. 46 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đúng với PM15. 47 Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ đúng với PM9. 47 Bảng 3.21. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 5 hợp chất phân tích. 48 Bảng 3.22. Kết quả khảo sát LOD và LOQ 48 Bảng 3.23. Kết quả xác định nồng độ các chất trong phân đoạn cloroform 50 8 Bảng 3.24. Hàm lƣợng trung bình các chất nghiên cứu trong cắn cloroform 51 Bảng 3.25.Kết quả xác định nồng độ các chất phân tích trong cắn ethyl acetat 52 Bảng 3.26. Hàm lƣợng trung bình các chất phân tích trong cắn ethyl acetat . 52 Bảng 3.27. Kết quả xác định nồng độ chất phân tích trong các dung dịch thử. 53 Bảng 3.28. Kết quả xác định hàm lƣợng các chất có trong cây Cỏ Seo gà. 53 9 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC. 13 Hình 1.2. Cấu tạo detector mảng diod (DAD). 17 Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu trên cột C18 dài 15 cm với các hệ dung môi khác nhau. 29 Hình 3.2. Phổ UV – Vis với detector DAD của các chất nghiên cứu 31 Hình 3.3. Phổ UV – Vis của hợp chất PM18 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 31 Hình 3.4. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu. 33 Hình 3.5. SKĐ của dịch chiết toàn phần cây Cỏ Seo gà. 33 Hình 3.6. SKĐ của hợp chất PM3 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 34 Hình 3.7. SKĐ của hợp chất PM12 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 34 Hình 3.8. SKĐ của hợp chất PM18 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 35 Hình 3.9. SKĐ của hợp chất PM15 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 35 Hình 3.10. SKĐ của hợp chất PM9 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 35 Hình 3.11. Phổ UV – Vis với detector DAD của pic tƣơng ứng 36 Hình 3.12. Chồng phổ UV – Vis với detector DAD của pic tƣơng ứng 36 Hình 3.13. SKĐ của mẫu trắng. 38 Hình 3.14. SKĐ của dung dịch thử chuẩn bị từ cắn cloroform 50 Hình 3.15. SKĐ của dung dịch thử chuẩn bị từ cắn ethyl acetat. 51 10 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cây Cỏ Seo gà”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự khích lệ từ phía thầy cô, gia đình, bạn bè và nhà trƣờng. Trƣớc hết, tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS .TS Thái Nguyễn Hùng Thu PGS .TS Nguyễn Thái An ngƣời đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: NCS .ThS Nguyễn Duy Chí đã cho tôi những đóng góp quý giá về đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị kỹ thuật viên Khoa kiểm nghiệm Hóa học, Khoa kiểm nghiệm Vật lý, Khoa nghiên cứu kiểm nghiệm Dƣợc liệu và ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dƣợc và trang thiết bị y tế Quân đội. Đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn thầy cô Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên về mọi mặt và giúp đỡ tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà nội, tháng 8 năm 2014 Nguyễn Hải Đƣờng [...]... học Từ mẫu cây Cỏ Seo gà thu hái tại Ba Vì, Hà Nội, NCS Nguyễn Duy Chí đã nghiên cứu phân lập đƣợc một số hợp chất Các hợp chất phân lập đƣợc sau khi tinh chế đã đƣợc xác định và khẳng định cấu trúc bằng phổ khối lƣợng và phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Để đánh giá tiềm năng và góp phần tiêu chuẩn hóa dƣợc liệu, đề tài Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cây Cỏ Seo gà ... hiện với các mục tiêu sau: 1- Xây dựng được các quy trình cho phép định lượng đồng thời một số hợp chất đã được phân lập tư cây Cỏ Seo gà bằng HPLC ̀ 2- Ứng dụng phương pháp xây d ựng được để so sánh thành phần các phân đoạn thu được trong quá trình chiết xuất và sơ bộ xác định hàm lượng các hợp chất trên trong cây Cỏ Seo gà 1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ 1.1.1 Đặc điểm thực vật... để xác định tốc độ dòng phù hợp cho một thời gian lƣu tối ƣu 2.3.3.4 Chọn bước sóng phát hiện Quét phổ UV – Vis của các hợp chất nghiên cứu để xác định cực đại hấp thụ của chúng, từ đó chọn bƣớc sóng thích hợp nhất mà tại đó các chất phân tích đều có độ hấp thụ đủ lớn 2.3.4 Thẩm định phƣơng pháp phân tích Phép định lƣợng các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Cỏ Seo gà bằng phƣơng pháp HPLC đƣợc thẩm định. .. Thẩm định các điều kiện định lƣợng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là các chất phân lập đƣợc đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích  Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lƣợng các hợp chất trên có trong các phân đoạn thu đƣợc trong quá trình chiết xuất và mẫu cây Cỏ Seo gà đã thu hái đƣợc 20 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 2.3.1.1 Xác. .. khiết của các hợp chất nghiên cứu đƣợc đánh giá qua tổng tạp có trong chúng sau khi đƣợc phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc Tổng tạp của các hợp chất đƣợc đánh giá theo phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích Nếu chất phân lập không bị lẫn các tạp chất khác, tạm bỏ qua hàm ẩm (vì khối lƣợng chất phân lập đƣợc rất ít) để coi hàm lƣợng của các chất phân lập là 100% trong xây dựng phƣơng pháp định lƣợng 2.3.2.2... kiện sắc ký 2.3.3.1 Chọn cột sắc ký Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến với nhiều tính ƣu việt Dựa trên tính chất của các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Cỏ Seo gà, đồng thời qua tham khảo tài liệu nghiên cứu về phƣơng pháp 22 tách chiết, định lƣợng một số thành phần trong cây Cỏ Seo gà, chúng tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này Tiến hành khảo... tinh chế đƣợc bằng phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích để kiểm tra khả năng sử dụng chúng nhƣ các chất đối chiếu  Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp chất trong hỗn hợp các chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong dịch chiết cây Cỏ Seo gà  Định tính các chất dựa vào thời gian lƣu trên sắc ký đồ, kết hợp với chồng phổ UV của chất đối chiếu và thử bằng... học và Công nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học là: Pteris multifida Poir., họ Cỏ luồng (Pteridaceae) 2.1.2 Dung môi, hóa chất  Hóa chất tinh khiết phân tích: acid formic  Dung môi loại dùng cho HPLC: acetonitril, methanol (Merck – Đức)  Nƣớc cất hai lần dùng cho HPLC  Các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Cỏ Seo gà đã đƣợc tinh chế và nhận dạng cấu trúc bằng phƣơng pháp phổ NMR là: +) PM3 (Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid),... phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ LOD là lƣợng chất thấp nhất của chất cần phân tích có thể phát hiện đƣợc về mặt định tính LOQ là lƣợng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện đƣợc về mặt định lƣợng với độ đúng và độ chính xác thích hợp Cách xác định: xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đƣờng nền (S/N) Pha loãng dung dịch đối chiếu từ nồng độ ban đầu đến... tiêu:  Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký  Độ lặp lại của phƣơng pháp  Độ tuyến tính và khoảng xác định  Độ đúng  Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lƣợng LOQ 23 2.3.4.1 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký Độ chính xác của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, đƣợc xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã đƣợc xử lý xong Cách xác định: tiến hành tiêm lặp . 3.7. SKĐ của hợp chất PM12 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 34 Hình 3.8. SKĐ của hợp chất PM18 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 35 Hình 3.9. SKĐ của hợp chất PM15 phân lập đƣợc từ Cỏ Seo gà. 35 Hình. đề tài Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cây Cỏ Seo gà đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: 1- Xây dư ̣ ng được các quy trình cho phép định lượng đồng. DỤNG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ SEO GÀ 49 3.5.1. Phân tích các phân đoạn thu đƣợc trong quá trình chiết xuất cây Cỏ Seo gà 49 3.5.2. Xác định hàm lƣợng các chất có trong cây