LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ vỏ thân cây Gạo”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, sự cố gắn
Trang 1- 2013
C HÀ NỘ
NG PH LƯỢN ĐƯỢ GẠO DƯỢC S
Ừ
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác
định hàm lượng một số chất phân lập được từ vỏ thân cây Gạo”, ngoài sự làm việc
nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự khích lệ từ phía nhà trường, thày cô, gia đình và bè bạn
Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Thái Nguyễn
Hùng Thu – Trưởng Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, người đã dành nhiều thời gian
và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thái An – Bộ môn Dược Liệu,
người đã rất nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài
Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Hồ Thị Thanh Huyền và DS Phạm
Lê Minh - Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất cùng toàn thể các cán bộ Bộ môn Hóa
phân tích-Độc chất, cán bộ Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ phẩm Hà Nội
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận này
Tôi xin chân thành cảm ơn quý thày cô Trường Đại học Dược Hà nội, đặc biệt
là những thày cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại Trường
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt
và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, tháng 05 năm 2013
Lục Tuấn Tú
Trang 4MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO 2
1.1.1. Đặc điểm thực vật 2
1.1.2. Tính vị và công năng của cây Gạo 2
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 3
1.2. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VỎ THÂN CÂY GẠO 3
Hoạt động antiangiogenic của Lupeol 4
Tác dụng hạ huyết áp 4
Tác dụng chống viêm 4
Tác dụng bảo vệ gan 4
Tác dụng ức chế sự hình thành các tế bào tĩnh mạch trung tâm rốn của con người ………4
Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 5
1.3. CÔNG DỤNG CỦA VỎ THÂN CÂY GẠO 5
1.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ THÂN CÂY GẠO 5
1.4.1. Công thức hoá học, tính chất vật lý, tác dụng dược lý của một số chất phân lập từ vỏ thân cây Gạo 6
1.5. MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 12
1.5.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao 12
Trang 51.5.2. Các thông số đặc trưng 13
1.5.3. Hệ thống máy HPLC 15
1.5.4. Các phương pháp định lượng bằng kỹ thuật HPLC 16
1.5.5. Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) 17
CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21
2.2. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 21
2.2.1 Hóa chất 21
2.2.2 Dụng cụ thiết bị 21
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.4.1 Chuẩn bị mẫu thử 22
2.4.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu 23
2.4.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 23
2.4.4. Thẩm định phương pháp phân tích 24
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu 26
CHƯƠNG III - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 27
3.1 HÀM ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN 27
3.1.1 Hàm ẩm của dược liệu: 27
3.1.2 Hiệu suất chiết 27
3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 27
3.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU 30
3.4 ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ 33
Trang 63.5 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG VỎ
THÂN CÂY GẠO BẰNG HPLC 36
3.5.1 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký: 36
3.5.2 Tính đặc hiệu 36
3.5.3 Độ lặp lại 37
3.5.4 Khoảng nồng độ tuyến tính 37
3.5.5 Độ đúng 41
3.5.6 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 41
3.6 ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG VỎ THÂN CÂY GẠO 42 3.7. BÀN LUẬN 42
3.7.1. Về phương pháp xử lý mẫu 42
3.7.2. Về khảo sát điều kiện sắc ký HPLC 43
3.7.3. Về kết quả định lượng các chất trong vỏ thân cây Gạo 43
3.7.4. Về thẩm định phương pháp định lượng 43
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45
KẾT LUẬN 45
ĐỀ XUẤT 46
TÀI LIỆU THAM KHÁO
PHỤ LỤC
Trang 7DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT C: Nồng độ (µg/mL)
ESI: Ion hóa bằng phun điện tử (Electronspray ionization)
HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LC-MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry)
LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quatification)
MeCN: Acetonitril
MS: Khối phổ (Mass Spectrometry)
RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
S/N: Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)
SD: Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)
S: Diện tích pic sắc ký (mAu.s)
TP: Thành phần
t R : Thời gian lưu
UV-VIS: Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible)
Trang 8
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1 Độ ẩm bột dược liệu 27
Bảng 3.2 Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn 36
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại với các chất phân tích 37
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tuyến tính với epicatechin 38
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tuyến tính với catechin 38
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tuyến tính với daucosterol 39
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát tuyến tính với Lupeol 39
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tuyến tính với Stigmasterol 40
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát tuyến tính với friedelin 40
Bàng 3.10 Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 6 chất 41
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/mL) 41
Bảng 3.12 Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong mẫu vỏ thân cây Gạo nghiên cứu 42
Bảng phụ lục Kết quả khảo sát độ đúng của 6 chất trong vỏ thân cây Gạo
Trang 9DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Hệ thống máy HPLC 15
Hình 1.2 Sơ đồ khối của máy khối phổ 18
Hình 1.3 Sơ đồ bộ tứ cực chập ba 19
Hình 3.3 Sắc ký đồ của epicatechin phân lập được từ vỏ thân cây Gạo 31
Hình 3.4 Sắc ký đồ của catechin phân lập được từ vỏ thân cây Gạo 31
Hình 3.5 Sắc ký đồ của daucosterol phân lập được từ vỏ thân cây Gạo 31
Hình 3.6 Sắc ký đồ của lupeol phân lập được từ vỏ thân cây Gạo 32
Hình 3.7 Sắc ký đồ của stigmasterol phân lập được từ vỏ thân cây Gạo 32
Hình 3.8 Sắc ký đồ của friedelin phân lập được từ vỏ thân cây Gạo 32
Hình 3.9 Phổ khối lượng ứng với các pic của epicatechin trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu 33
Hình 3.10 Phổ khối lượng ứng với các pic của catechin trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu 34
Hình 3.11 Phổ khối lượng ứng với các pic của daucosterol trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu 34
Hình 3.12 Phổ khối lượng ứng với các pic của lupeol trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu 34
Hình 3.13 Phổ khối lượng ứng với các pic của stigmasterol trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu 35
Hình 3.14 Phổ khối lượng ứng với các pic của friedelin trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu 35
Hình 3.15 Sắc ký đồ của mẫu trắng (dung môi pha mẫu) 37
Trang 10Hình phụ lục Sắc ký đồ của hỗn hợp mẫu thử
Trang 11ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Gạo (Bombax malabaricum DC.) là cây gỗ cao đến 15m, có hoa màu đỏ
tươi, được biết đến như là một cây thuốc dân gian tại các nước Pakistan, Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam và châu Phi Theo kinh nghiệm dân gian, nhiều bộ phận của cây như vỏ thân, hoa và nhựa được sử dụng để trị các bệnh như viêm loét dạ dày, viêm loét ngoài da, thấp khớp, bó gãy xương, kiết lỵ
Từ vỏ thân cây Gạo, nhóm tác giả Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã nghiên cứu với mẫu thu hái tại Hà Nội, các tác giả đã phân lập được một số thành phần như epicatechin [11], catechin, momor-cerebroside I [12], lupeol, stigmasterol [13], friedelin và daucosterol
Ngày nay, trên thế giới xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng Ở Việt Nam, với lợi thế
về địa hình và khí hậu đã tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú cũng như nguồn dược liệu dồi dào cùng với tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc từ lâu đời Tuy nhiên nhiều loài cây được sử dụng rộng rãi theo kinh nghiệm dân gian mà chưa
có hoặc có rất ít nghiên cứu có giá trị khoa học Cần có các nghiên cứu xác định hàm lượng các hợp chất đã tìm thấy trong dược liệu để đánh giá đúng tiềm năng của nguồn dược liệu và góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu trong quá trình hiện đại
hóa các thuốc có nguồn gốc dược liệu Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ vỏ thân cây Gạo” đã được thực hiện nhằm mục tiêu:
1 Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất đã
được phân lập từ vỏ thân cây Gạo bằng phương pháp HPLC
2 Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng epicatechin, catechin, daucosterol, lupeol, stigmasterol và friedelin có trong một
mẫu vỏ thân cây Gạo thu hái được
Trang 12
Cây gỗ to, cao tới 15m hay hơn Thân cây thẳng, sần sùi, màu xám, có bạnh
vè to ở gốc, lá mọc so le, kép chân vịt, gồm 5-7 lá chét, hình mác hoặc hình trứng, gốc thuôn, đầu nhọn, dài 9-15cm, rộng 4-5cm, hai mặt nhẵn, mép nguyên, cuống chung dài hơn phiến lá, dài từ 20-25cm [2], [4], [7], [8], [9], [10], [18], [19]
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm, 1-3 hoa mọc cùng một cuống Hoa màu đỏ, thỉnh thoảng màu cam, vàng, đường kính 7,5-11cm, dài 5-10cm Hoa nhiều, cuống hoa ngắn, nhỏ, khỏe Hoa to, đều, lưỡng tính Nhị rất nhiều hợp thành
5 bó hoặc 6 bó (không thành ống), ngắn hơn cánh hoa, bó nằm trong 2 cuống cánh khác nhau Bầu thượng 5 ô, một vòi mang 5 đầu nhụy, bầu hình nón, có lông màu trắng nhạt
1.1.2 Tính vị và công năng của cây Gạo
- Hoa Gạo có vị ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, tiêu viêm, thu liễm [3]
- Vỏ thân cây Gạo có vị đắng, tính mát, có tác dụng lợi tiểu, tiêu sưng, gây nôn [17], khu phong, trừ thấp, tiêu thũng [3] Theo tài liệu Ấn Độ, nước sắc vỏ thân
có tác dụng làm dịu viêm, cầm máu [3]
- Rễ có vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích, bổ, cũng có tác dụng gây nôn và giảm đau [17], ngoài ra còn có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, thu liễm, chỉ huyết, tán kết, chỉ thống Ở Indonesia, nước ép rễ có tác dụng hạ sốt [3]
Trang 13- Vỏ từ 15 – 16g, có thể sắc và ngậm chữa đau răng [15] Vỏ còn được dùng trị thấp khớp, đau giập gãy xương, dùng cầm máu trong các chứng băng huyết (phối hợp với rễ non và hạt cây tươi), liều dùng 15 – 30g [5], dùng đắp chữa tàn nhang, mụn trứng cá, các rối loạn sắc tố da [10]
- Lá Gạo được dùng rất tốt cho đái dắt, phát ban, chữa thiếu máu, chữa lỵ [10]
- Hạt bông Gạo làm tăng tiết sữa ở phụ nữ sau khi sinh [17]
- Nhựa gôm chích từ thân cây Gạo được dùng chữa lậu, kiết lỵ, cầm máu, rong kinh, kích dục [3]
- Rễ Gạo ép lấy nước chữa sốt, chữa kiết lỵ, chữa đau dạ dày mạn tính [3], chữa đau thượng vị, viêm hạch bạch huyết dạng lao và làm thuốc lợi tiểu Ở Ấn Độ, người ta dùng rễ làm thuốc kích dục cho trường hợp bất lực, liều dùng 30 – 50g [17]
1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến
Toàn cây được sử dụng cho các mục đích khác nhau:
- Vỏ thân: thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa xuân [2], [18], [19] nhưng
cũng có tài liệu [6] cho rằng tốt nhất vào mùa hè Vỏ thân mang về cạo bỏ vỏ thô bên ngoài, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô sắc uống, hoặc dùng tươi giã nát để đắp ngoài [15], [4]
- Rễ: thu hái vào mùa xuân hay mùa thu, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô [15],
1.2 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VỎ THÂN CÂY GẠO
Cây Gạo được biết đến với nhiều tác dụng: chống viêm, giảm đau, hạ huyết
áp, hạ đường huyết, chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng
Helicobacter pylori, hạ sốt, cầm máu, tác dụng ức chế trên ống hình thành các tế
Trang 14bào tĩnh mạch rốn của con người, hoạt động antiangiogenic, chống ung thư và HIV Một số tác dụng dược lý liên quan tới vỏ thân cây Gạo như:
Hoạt động antiangiogenic của Lupeol
Năm 2003, Young-Jea You và cộng sự tiến hành sàng lọc một số dược liệu thu hái tại Việt Nam có tác dụng antiangiogenic cho thấy dịch chiết methanol của
vỏ thân cây Gạo có tác động antiangiogenic trên dòng tế bào thuộc màng trong ống dây rốn (HUVEC) Ở nồng độ 30 và 50µg/mL, lupeol có tác dụng ức chế trên ống HUVEC với tỷ lệ tương ứng là 40%-60% và trên 80%, trong khi nó không ảnh hưởng tới sự phát triển của dòng tế bào ung thư độc như SK-MEI-2, B16-F10 [31], [43]
Tác dụng bảo vệ gan
Theo [41], [23], các bộ phận của cây Gạo như vỏ thân, lõi thân, rễ có tác dụng giảm nhẹ tổn thương gan gây ra bởi CCl4 Tác dụng giảm mức độ hoại tử tế bào, giảm thoái hóa cũng được ghi nhận Dịch chiết methanol của một số bộ phận của cây, cao lỏng 1g/mL cũng được chứng minh là có tác dụng làm giảm men gan, giảm sự suy thoái và hoại tử tế bào gan thông qua thử nghiệm gây độc tế bào gan bằng CCl4
Tác dụng ức chế sự hình thành các tế bào tĩnh mạch trung tâm rốn của con
người
Do sự hình thành mạch quá nhiều cũng là một tiến trình bệnh lý thuộc bệnh viêm khớp, thấp khớp nên Nguyễn Hải Nam cùng các nhà khoa học Hàn Quốc đã
Trang 15tiến hành nghiên cứu tác dụng ức chế sự hình thành các tế bào tĩnh mạch trung tâm rốn của một số cây thuốc thu hái tại Việt Nam Trong số 58 cây nghiên cứu thì có 7
cây có tác dụng ức chế trong đó có cây Bombax malabaricum DC [43]
1.3 CÔNG DỤNG CỦA VỎ THÂN CÂY GẠO
Vỏ thân cây Gạo dùng tươi chữa gãy xương, sai khớp, viêm khớp và một số bệnh khác liên quan tới cơ xương khớp Đồng bào ở Tây Nguyên dùng vỏ Gạo và
vỏ cây đa quả to, phơi khô, thái nhỏ, sắc uống chữa bệnh đậu mùa Nước sắc đặc của vỏ Gạo được ngậm chữa đau răng [15], [4], [9], [18], [19] Vỏ thân còn dùng để cầm máu trong chứng băng huyết (phối hợp với rễ non và hạt cây tươi) [6], [7] Vỏ Gạo sao vàng sắc uống làm thuốc an thần, lợi tiểu với liều 15-20g/ngày Vỏ khô sắc uống 10-20g/ngày, dùng đồng thời giã đắp để chữa quai bị Nước sắc vỏ hoặc hoa dùng để chữa ỉa chảy, kiết lỵ Vỏ thân được sử dụng bên ngoài như miếng dán cho viêm nhiễm và phát ban ngoài da [15], [4], [9], [18]
1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỎ THÂN CÂY GẠO
Hồ Thị Thanh Huyền đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của vỏ thân cho thấy:
Vỏ thân có chứa: Glycosid Tim, saponin, flavonoid, coumarin, alkaloid, tanin, acid hữu cơ, đường khử, sterol Không có anthranoid, acid amin, polysaccharid, chất béo, caroten [11], [12], [13], [34], [43] Cũng từ vỏ thân cây Gạo, tác giả sử dụng sắc ký cột với chất hấp thụ là silicagel có cỡ hạt 40-63 µm đã phân lập được 2 chất: epicatechin và bis (2-ethylhexyl) adipate [11]
Trang 16Vỏ thân chứa chất nhầy Năm 2003, các nhà khoa học Hàn Quốc đã phân lập được một chất từ phân đoạn dicloromethan là lupeol [33], [43] Năm 1971, β-sitosterol cũng được phân lập từ vỏ thân [32] Ngoài ra, từ vỏ thân cây Gạo còn phân lập được shamimicin [33], shamimin [28], 5-isopropyl-3-methyl-2,4,7 trimethoxy-8,1-naphtalen carbolacton và một naphthoquinon là 8-formyl-7-hydroxy-5-isopropyl-2-methoxy-3-methyl-1,4-naphthoquinon [32]
1.4.1 Công thức hoá học, tính chất vật lý, tác dụng dược lý của một số chất phân lập từ vỏ thân cây Gạo
1.4.1.1 Lupeol
• Nguồn gốc
Năm 2013: Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được lupeol [13] từ
vỏ thân cây Gạo với hàm lượng khoảng 20mg trong 700g vỏ thân khô
• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (1R, 3aR, 5aR, 5bR, 7aR, 9S, 11aR, 11bR, 13aR, 13bR)-3a,
5a, 5b, 8, 8, 11a-hexamethyl-1-prop-1-en-2-yl-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7a, 9, 10, 11, 11b, 12,13,13a, 13b-hexadecahydrocyclopenta [a]chrysene-9-ol
- Tổng hợp: Năm 2009 Surendra và Corey đã báo cáo một con đường để tổng hợp Lupeol từ (1E,5E)-8-[(2S)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-2,6-dimethylocta-1,5- dienyl acetate [38]
Trang 17• Tác dụng dược lý
- Năm 2003, Young-Jea You và cộng sự tiến hành sàng lọc một số dược
liệu thu hái tại Việt Nam có tác dụng antiangiogenic cho thấy dịch chiết methanol của vỏ thân cây Gạo (cụ thể là lupeol) có tác động antiangiogenic trên dòng tế bào thuộc màng trong ống dây rốn (HUVEC) [31], [43]
- Cũng theo [41], [43], [23], lupeol còn có tác dụng giảm nhẹ tổn thương gan gây ra bởi CCl4 Tác dụng giảm mức độ hoại tử tế bào, giảm thoái hóa cũng được ghi nhận Ngoài ra, lupeol còn có tác dụng dãn mạch, hạ huyết áp
- Một số nghiên cứu khác cũng chứng minh lupeol có tác dụng chống viêm [42], [21], [20], [28], [23] và tác dụng chống oxy hoá, có thể ứng dụng trong điều trị ung thư [20], [40]
Trang 18• Tác dụng dược lý
- Theo Katsuyuki Tanabe và cộng sự tại Đại học Kyoto, Nhật bản, đã
chứng minh được rằng epicatechin có tác dụng hạn chế tổn thương thận do tác dụng bảo vệ tế bào ty thể của thận [39]
- Ngoài ra, trong nghiên cứu [34], Parmvir Bahia và cộng sự đã đưa ra rằng
epicatechin có tác dụng kích thích các yếu tố đáp ứng ERK thông qua AMP vòng để điều chỉnh GluR2 trong tế bào thần kinh vỏ não, qua đó có tác dụng cải thiện dẫn
truyền thần kinh, cải thiện trí nhớ
- Cải thiện các chức năng về mạch máu [35] Tháng 4 năm 2005, Hagen
Schroeter và cộng sự đưa ra rằng, Epicatechin và chất chuyển hoá của nó là
epicatechin-7-O-glucuronide đều có tác dụng lên cải thiện mạch máu tại động mạch chủ trên thỏ Và cũng chứng minh được rằng thực phẩm giàu flavanol (Epicatechin) phát huy lợi ích trên sức khỏe tim mạch làm giảm rối loạn chức năng nội mô, là một
nguy cơ quan trọng liên quan trong tiên lượng xơ vữa động mạch [35]
1.4.1.3 Catechin
• Nguồn gốc
Là đồng phân quang học của Epicatechin Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền
cũng đã phân lập được catechin từ vỏ thân cây Gạo [12]
Trang 19- λmax1: 209nm; λmax2: 279nm
• Tác dụng dược lý
- Năm 2009, Navindra P Seeram và cộng sự đã thử nghiệm tác dụng của
Catechin và Epicatechin trên ức chế COX-1 và COX–2 và đã cho thấy kết quả ức chế tốt tại nồng độ 80µM và hoạt động ức chế COX tốt nhất trong so sánh với các thuốc ức chế COX ibuprofen thương mại (tại 10μM), naproxen (tại 10µM ), Vioxx
® (tại 1,67ppm) và Celebrex (tại 1,67ppm) Ở nồng độ 50mM, catechin ức chế các
tế bào vú, hiệu quả chống lại các tế bào ruột kết, các tế bào phổi Các tế bào thần kinh trung ương là nhạy cảm nhất trong các dòng tế bào thử nghiệm Nhìn chung
catechin có tác dụng ức chế sự gia tăng của các dòng tế bào ung thư [36]
- Giảm sự hấp thu Aluminum trong trà tại dạ dày và ruột non [37] Ngoài tác dụng ức chế COX và ức chế sự sinh trưởng của tế bào ung thư, catechin còn được chứng minh có thể sử dụng như là một chất làm giảm lượng Aluminum tích luỹ trong cơ thể do uống trà xanh, một trong những nguy cơ gây độc đang được quan tâm tới hiện nay do trà là loại thức uống đang ngày càng phổ biến trên thế giới Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, catechin và các polyphenol có tác dụng giảm sự hấp thu Aluminum tại ruột
Trang 2016,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl) oxane-3,4,5-triol
đó làm giảm sinh trưởng của tế bào nấm men Candida albicans Trong nghiên cứu
này, Lee JH và cộng sự tại đại học Dongduk Women đã đưa ra kết quả daucosterol
giúp bảo vệ tế bào chuột bởi nấm men Candida
1.4.1.5 Stigmasterol
• Nguồn gốc
Stigmasterol được tìm thấy trong vỏ thân cây Gạo [13]
Ngoài ra, Stigmasterol còn được tìm thấy trong dầu đậu nành với nồng độ
khoảng 0,54 µg/mL [24] bằng phương pháp HPLC
• Tính chất vật lý
- Tên khoa học: (3S, 8S, 9S, 10R, 13R, 14S,
17R)-[(E,2R,5S)-5-ethyl-6-methylhept-3-en-2-yl]-10,13-dimethyl-2, 3, 4, 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 16, dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren – 3-ol
17 Công thức phân tử: C29H48O
- Khối lượng phân tử: 412,69 g/mol
- Nhiệt độ nóng chảy: 160 – 164oC
Trang 21- Độ tan: tan tốt trong MeOH
- λmax: 257 nm
• Tác dụng dược lý
- Theo Richard E và cộng sự [25], phytosterols có tác dụng làm giảm
Lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C), là một trong những chỉ số biểu thị mức độ cholesterol máu Một kế quả tương tự cũng được tìm thấy qua nghiên cứu [29] của Padmanabhan P Nair và cộng sự Stigmasterol có tác dụng giảm sự hấp thu
Cholesterol vào màu, do đó làm giảm nguy cơ béo phì và nguy cơ ung thu ruột
- Stigmasterol còn được dùng làm nguyên liệu để tổng hợp progesterol [30] Progesterol là một hormon quan trọng trong cơ thể, progesterol có thể dùng một mình để tránh thai và điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm xuất huyết tử cung bất thường, vô kinh, lạc nội mạc tử cung, ung thư vú, thận, ăn mất ngon và sụt cân do AIDS Do đó, việc tổng hợp ra Progesterol mang tính thực tiễn rất cao
- Nguyên liệu để tổng hợp cortison [27] Cortison cũng là một hormon có tác dụng giảm đau, dùng trong các bệnh lý miễn dịch Cùng với việc tổng hợp ra Progesterol, tổng hợp cortison từ Stigmasterol cũng có rất nhiều ứng dụng trong thực tế
1.4.1.6 Friedelin
• Nguồn gốc
Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được từ vỏ thân cây
Gạo, ngoài ra friedelin còn được tìm thấy trong lá cây Azima tetracantha L [22]
Trang 22Tháng 8/2011, Paulrayer Antonisamy và cộng sự đã chỉ ra rằng friedelin ức
chế tính thấm acid acetic qua thành mạch tại chuột Friedelin có tác dụng giảm đau đáng kể (P<0,05) trong các phản ứng co thắt bụng gây ra bởi acid acetic và formalin gây ra phản ứng chân liếm Điều trị bằng friedelin cho thấy (P<0,05) có ý nghĩa về việc giảm sốt ở chuột Kết quả cho thấy friedelin sở hữu hoạt động chống viêm, giảm đau và hạ sốt mạnh [22]
1.5 MÁY SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
1.5.1 Khái niệm sắc ký lỏng hiệu năng cao [1]
chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố trên Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi
và bộ phận xử lý số liệu thành sắc ký đồ với các thông tin về pic của chất phân tích Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt được tách ra trên sắc đồ
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc
ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học Trong đó sắc ký lỏng phân bố được
sử dụng rộng rãi nhất hiện nay
Trang 231.5.2 Các thông số đặc trưng [1]
Hệ số phân bố K
Hệ số phân bố K của chất phân tích đặc trưng cho tốc độ di chuyển của chất
đó qua pha tĩnh và được xác định bằng:
K = : Nồng độ chất tan trong pha tĩnh
: Nồng độ chất tan trong pha động
Nếu = thì quá trình sắc ký sẽ không tách được hai chất A và B ra khỏi
càng lớn
Thời gian lưu (phút)
Là thời gian từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh của pic (thời gian lưu đặc trưng cho một chất) So sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện sẽ định tính được chất đó
trong pha động
Trang 24 Số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa (H)
Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động
Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức sau:
Trong đó: : thời gian lưu (phút)
W: chiều rộng của pic đo ở đấy pic
: chiều rộng của pic đo ở nữa chiều cao của đỉnh
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là phù hợp, tối thiểu là 1000
Độ phân giải
Là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc
ký đã cho Độ phân giải của 2 pic cạnh nhau được tính theo công thức sau:
Trong đó:
, : thời gian lưu của 2 pic liền kề của 2 chất tan A và B (phút)
, : độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B (phút)
Trong thực tế nếu các pic cân đối (Gauss) thì độ phân giải tối thiểu để 2 pic
có độ lớn bằng nhau tách ra khỏi nhau là R=1,0
Hệ số bất đối
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, được tính theo công thức:
AF =
Trang 25Trong đó:
: chiều rộng pic được đo ở 1/20 chiều cao pic
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước của pic ở 1/20 chiều cao pic
Hệ số chọn lọc
Hệ số chọn lọc đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất A và B
Theo qui ước: < nên < 1
- Bơm cao áp, đẩy pha động qua cột sắc ký (Pump)
- Bộ phận tiêm mẫu (Injector)
Trang 26- Cột tách (Column)
- Detector
- Máy ghi tín hiệu và xử lý số liệu (Data System)
1.5.4 Các phương pháp định lượng bằng kỹ thuật HPLC [1]
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó
Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký là:
- Phương pháp chuẩn ngoại
- Phương pháp chuẩn nội
- Phương pháp thêm chuẩn
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại
Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử
Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:
Cx =
Cx: Nồng độ mẫu thử
CS: Nồng độ mẫu chuẩn
Sx: Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu thử
SS: Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn
Chuẩn hóa nhiều điểm
Cách tiến hành: Chuẩn bị 1 dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần
rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi
Trang 27điểm nồng độ chuẩn Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể tính theo 2 cách:
- Áp dữ liệu diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của nó
- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích pic (hoặc chiều cao) với nồng độ của chất cần xác định
S = a + b.C S: Diện tích pic
a: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung b: Độ dốc của đường chuẩn
C: Nồng độ của chất thử
Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử
trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn [1]
1.5.5 Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) [1]
LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao
và phân tích khối phổ Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng dụng rộng lớn trong phân tích
1.5.5.1 Nguyên tắc
Khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng
và điện tích ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử mẫu
Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc bằng Dalton
bộ phân tích khối trước khi đến detector Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được
thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau, tập hợp thành một khối phổ
Trang 28đồ hoặc phổ khối, cung cấp thông tin để định tính, xác định cấu trúc và định lượng các chất
1.5.5.2 Máy khối phổ
a) Bộ nạp mẫu (Inlet)
Đưa mẫu vào máy Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn phải chuyển mẫu sang dạng hơi bằng cách thích hợp Có thể nạp mẫu trực tiếp hoặc nối với đầu ra của một thiết bị phân tích khác như sắc ký khí, sắc ký lỏng siêu giới hạn (SFC), điện di mao quản (CE)
Hình 1.2 Sơ đồ khối của máy khối phổ
b) Bộ nguồn ion (Ion source)
Ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi, khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân không sâu Và rút ra ngoài các phân tử trung hòa, ion khác dấu có thể ảnh hưởng tới phép đo
Các kỹ thuật ion hóa đã được phát triển và sử dụng là: Va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển, ion hóa bởi nguồn ion bằng giải hấp
Electronspray ionization (ESI)
c) Bộ phân tích khối (Mass Analyzer)
Tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector Có thể phân bộ phân tích khối thành 4 loại:
- Bộ phân tích từ (Magnetic Analyser )
Trang 29- Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)
- Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser – TOF)
- Bộ phân tích cộng hường ion cyclotron (Ion cyclotron resonance analyser – ICR)
Đề tại này chúng tôi sử dụng máy khối phổ có bộ phân tích khối là bộ phân
Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện
tử của máy khối phổ Hiện có 2 dạng truyền thống:
- Nhân eclectron (electron myltiplier)
- Nhân quang (photomultiplier)
e) Bộ xử lý dữ liệu (Data System)
số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ, định lượng…
1.5.5.3 Một số kỹ thuật LC-MS
- Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN)
Cho đầy đủ thông tin về các chất phân tích trong mẫu ion Tuy nhiên phương pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn
- Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Monitoring)
Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời gian, kỹ thuật SIM nhạy hơn FULL SCAN từ 10 tới 100 lần tùy theo thiết bị
Trang 30- Kỹ thuật MS/MS
Trong kỹ thuật MS/MS một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phân tích bằng cách sử dụng năng lượng bẻ gãy, tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở chế
độ phân tích MS lần 2 Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng
độ nhạy do làm giảm nhiễu đường nền rất đáng kể
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật MS/MS để định tính 6 hợp chất có trong vỏ thân cây Gạo
Trang 31CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu nghiên cứu là vỏ thân của cây Gạo (được làm khô tự nhiên) thu hái vào mùa hè tại Hương Sơn (Mỹ Đức, Hà Nội) và đã được TS Trần Huy Thái (Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh học) giám định tên khoa học là: Bombax malabaricum
DC., họ Gạo (Bombacaceae)
2.2 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
2.2.1 Hóa chất
- Hóa chất tinh khiết phân tích: acid formic
- Dung môi loại dùng cho HPLC: methanol, acetonitril
- Các hợp chất đã phân lập được từ vỏ thân cây Gạo là Lupeol, Friedelin, Stigmasterol, Epicatechin, Catechin, Daucosterol đã được tinh chế và nhận dạng cấu
trúc bằng các phương pháp phổ MS và NMR
2.2.2 Dụng cụ thiết bị
- Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS 8030 có kết nối thêm detector SPD-20A (có khả năng phân tích UV-VIS trong vùng 190-700nm) của Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm và mỹ phẩm Hà Nội
- Cột sắc ký Zorbax C18 (250mm x 4,6mm; 5μm) kết hợp bảo vệ cột Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15×30mm ID)
- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45µm
- Bộ sinh hàn hồi lưu và bình cầu
- Nồi đun cách thủy
- Pipet tự động 1000µl, 100µl và 10µl
- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong, ống ly tâm, phễu lọc, màng lọc…
- Máy li tâm Hettich của Đức
- Máy đo hàm ẩm Precisa XM 60, max 124g, d=0,001g
Trang 322.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Đánh giá tổng tạp có trong các mẫu hợp chất phân lập và tinh chế được bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích
- Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp chất trong hỗn hợp 6 hợp chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong cao lỏng thân cây Gạo
- Định tính các pic trên sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với MS kết nối
- Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích
- Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lượng 6 hợp chất trên có trong mẫu thân cây Gạo đã thu hái được
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Chuẩn bị mẫu thử
2.4.1.1 Xác định độ ẩm của bột dược liệu
Vỏ thân sau khi sấy khô, nghiền thành bột khô Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên cứu để xác định độ ẩm của dược liệu Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ
110oC, rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy
tự động hiện kết quả lên màn hình, đọc kết quả Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình
2.4.1.2 Chiết xuất
Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi chọn phương pháp xử lý mẫu tương đối phù hợp như sau: cân khoảng 500g dược liệu vỏ cây (đã xác định độ ẩm trước) đã được làm nhỏ, ngâm lạnh 3 lần với methanol trong
24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, thu dịch chiết, lọc, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Cân cắn toàn phần thu được và bảo quản cắn ở 4oC
2.4.1.3 Tính hiệu suất chiết
Hàm lượng % của cắn toàn phần so với khối lượng bột dược liệu được tính
