Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bịở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của thời gian lưu.
Bảng 3.2. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn
Hợp chất Epicatechin Catechin Daucosterol Lupeol Stigmasterol Friedelin
1 4,370 5,401 7,890 11,380 17,910 21,350 2 4,375 5,412 7,866 11,365 17,980 21,340 3 4,380 5,413 7,869 11,346 17,902 21,397 4 4,369 5,411 7,883 11,353 17,923 21,372 5 4,376 5,423 7,886 11,334 17,950 21,314 6 4,381 5,408 7,875 11,357 17,945 21,317 Trung bình 4,375 5,411 7,878 11,356 17,935 21,348 Thời gian lưu (phút) RSD (%) 0,11 0,13 0,12 0,14 0,16 0,15 Sốđĩa lý thuyết 22320 23230 24550 34660 35140 32340 Hệ số bất đối 1,11 1,05 1,10 1,07 1,04 1,12 Nhận xét: Các thông số thực nghiệm thể hiện sự phù hợp của hệ thống sắc ký đã lựa chọn để phân tích các hợp chất nghiên cứu. 3.5.2. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu được kiểm tra bằng cách tiêm lần lượt dung môi pha mẫu, dung dịch thử và dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký, kết quả cho thấy dung dịch chuẩn và dung dịch thử tương ứng cho pic có thời gian lưu tương ứng (hình 3.1 và hình 3.2), còn dung môi pha mẫu không cho pic ở các thời gian lưu tương ứng (hình 3.15).
Hình 3.15. Sắc ký đồ của mẫu trắng (dung môi pha mẫu)
3.5.3. Độ lặp lại
Tiêm lặp lại 6 lần với một dung dịch ở nồng độ khảo sát đối với mỗi chất nghiên cứu vào hệ thống sắc ký để khảo sát độ lặp lại.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại với các chất phân tích
Diện tích pic (mAU.s) Hợp chất 1 2 3 4 5 6 Tr.bình RSD (%) Epicatechin 38872 38543 38590 38650 38596 38652 38650,5 0,27 Catechin 124346 124367 123454 124356 123243 124562 124054,7 0,41 Daucosterol 6184 6170 6155 6156 6243 6182 6181,67 0,48 Lupeol 60352 60367 60454 60356 60243 60862 60439 0,33 Stigmasterol 6351 6270 6325 6356 6343 6362 6334,5 0,49 Friedelin 21501 21470 21454 21356 21243 21262 21381 0,47 Nhận xét:
Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp HPLC đã chọn có độ chính xác cao với các giá trịđộ lệch chuẩn thu được tương đối nhỏ.
3.5.4. Khoảng nồng độ tuyến tính
Tiêm dung dịch chuẩn trong khoảng nồng độ khảo sát vào hệ thống sắc ký để khảo sát độ tuyến tính, kết quảđược ghi trong bảng 3.4 -3.9.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tuyến tính với epicatechin
Nồng độ C(µg/mL) 4,6 9,2 18,4 27,5 36,7 45,9 Diện tíc pic S (mAu.s) 7360 14718 29437 44154 58872 73590
Phương trình hồi quy với epicatechin xác định được là S = 1604,63.C - 34,73. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 4,6-
45,9μg/mL với hệ số tương quan r là 1,0000.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tuyến tính với catechin
Nồng độ C(µg/mL) 3,8 7,6 15,2 22,8 30,4 45,6 Diện tíc pic S (mAu.s) 16213 32420 64000 97201 129700 197023
Phương trình hồi quy với catechin xác định được là S = 4321,06.C-884,04. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 3,8- 45,6μg/mL với hệ số tương quan r là 0,9999.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tuyến tính với daucosterol
Nồng độ C (µg/mL) 1,7 5,1 13,6 20,4 27,2 34,0 Diện tíc pic S (mAu.s) 3573 10652 27420 42630 56841 71051
Phương trình hồi quy với daucosterol xác định được là S = 2093,72.C - 232,08. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 1,7- 34,0μg/mL với hệ số tương quan r là 0,9999.
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tuyến tính với Lupeol
Nồng độ C (µg/mL) 4,5 9,0 17,9 26,9 35,8 53,8 Diện tíc pic S (mAu.s) 9546 19090 38180 57270 76001 118017
Phương trình hồi quy với lupeol xác định được là S = 2188,58.C – 909,39. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 4,5- 53,8μg/mL với hệ số tương quan r là 0,9997.
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát tuyến tính với Stigmasterol
Nồng độ C (µg/mL) 2,4 7,2 9,6 14,4 19,2 24,0 Diện tíc pic S (mAu.s) 3504 10410 14000 21002 28020 34890
Phương trình hồi quy với stigmasterol xác định được là S = 1456,33.C- 3,36. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 2,4- 24,0μg/mL với hệ số tương quan r là 1,0000.
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tuyến tính với friedelin
Nồng độ C (µg/mL) 5,3 8,0 16,0 21,4 32,0 42,7 Diện tíc pic S (mAu.s) 7221 10801 21500 28700 43231 58500 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương trình hồi quy với friedelin xác định được là S = 1367,76.C-260,66. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 5,3- 42,7μg/mL với hệ số tương quan r là 0,9999.
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ khảo sát đối với các hợp chất nghiên cứu. Kết quả này được sử dụng làm cơ sở để lựa chọn nồng độđịnh lượng của các hợp chất nghiên cứu tương ứng.
3.5.5. Độđúng
Thêm một lượng chính xác dung dịch chuẩn vào dung dịch thử, sao cho tổng nồng độ sau khi thêm vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tiến hành phân tích kết quả sắc ký để khảo sát độ đúng. Kết quả được tổng hợp trong bảng 3.10, chi tiết cho từng chất được thể hiện trong Phụ lục.
Bàng 3.10. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 6 chất
Tỷ lệ thu hồi (%) Hợp chất Nồng độ thêm vào mẫu (μg/mL) Trung bình min-max Epicatechin 7,34 99,20 97,44 - 99,84 Catechin 3,04 99,21 96,58 - 101,26 Lupeol 7,17 100,88 99,82 - 101,74 Friedelin 4,27 99,77 95,33 - 102,68 Stigmasterol 1,92 100,61 99,07 - 102,43 Daucosterol 1,36 101,42 99,97 - 102,19
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp phân tích đã lựa chọn cho tỷ lệ thu hồi cao, có độđúng tốt.
3.5.6. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Xác định LOD dựa vào tỷ lệđáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N). Việc xác định tỉ lệ S/N được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng của mẫu trắng từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được.
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/mL)
Epicatechin Catechin Daucosterol Lupeol Stigmasterol Friedelin LOD 0,5 0,5 0,34 0,61 0,32 0,8
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, giới hạn định lượng LOQ thấp hơn nồng độ định lượng nhiều lần. Việc xác định LOQ chủ yếu giúp cho việc phân tích tạp chất.
3.6. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG VỎ THÂN CÂY GẠO Tiến hành cân chính xác khoảng 0,5000g cắn hòa tan và định mức thành Tiến hành cân chính xác khoảng 0,5000g cắn hòa tan và định mức thành 25mL, lọc qua bông và qua màng lọc. Tiến hành sắc ký song song mẫu thử với mẫu hỗn hợp các chất đối chiếu. Tính kết quả theo phương pháp chuẩn hóa 1 điểm.
Lượng cắn cân cho các lần định lượng lần lượt là: 0,5022g; 0,5032g và 0,5034g. Tính toán lượng từng chất có mẫu thử qui về tương đương với 0,5000g cắn. Tính giá trị trung bình của 3 lần thử. Từ lượng dược liệu và hàm ẩm của nó đem chiết và tổng lượng cắn thu được tính ra hàm lượng từng chất có trong 100g dược liệu khô.
Kết quảđịnh lượng thu được có trong 100g vỏ thân cây Gạo được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.12. Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong mẫu vỏ thân cây Gạo nghiên cứu
Khối lượng hợp chất (mg)
Có trong cắn đem định lượng Tương đương trong 0,5g cắn
Hợp chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Tr.bình Hàm lượng (mg/100g dl) Epicatechin 1,225 1,226 1,205 1,219 1,218 1,197 1,211 12,293 Catechin 0,662 0,667 0,668 0,659 0,663 0,664 0,662 6,716 Daucosterol 0,178 0,181 0,180 0,177 0,179 0,179 0,178 1,811 Lupeol 0,936 0,935 0,939 0,932 0,929 0,933 0,931 9,451 Stigmasterol 0,186 0,190 0,193 0,185 0,189 0,192 0,189 1,915 Friedelin 0,752 0,751 0,746 0,749 0,746 0,741 0,746 7,566
Cần làm thêm trên số lượng mẫu đủ lớn để có số liệu chính xác hơn về hàm lượng 6 chất trên có trong vỏ thân cây Gạo.
3.7. BÀN LUẬN
3.7.1. Về phương pháp xử lý mẫu
Đểđịnh lượng các chất trong cây Gạo đạt kết quả tốt, trước hết cần phải chiết kiệt hoạt chất và làm sạch dịch chiết. Qua tham khảo các tài liệu, tôi chọn phương pháp ngâm lạnh với dung môi là methanol. Đây là phương pháp dễ thực hiện trong
điều kiện phòng thí nghiệm, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt mà lại cho hiệu suất cao.
3.7.2. Về khảo sát điều kiện sắc ký HPLC
Dựa trên các nghiên cứu trước đây và các tài liệu đã công bố, kết hợp với các điều kiện có sẵn tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký nhưđã mô tảở mục 3.2 và đã xây dựng được chương trình sắc ký trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HP1100. Việc đánh giá thông qua xác định tính phù hợp của hệ thống sắc ký, khả năng tách pic ra khỏi chất khác, hình ảnh của pic trên sắc ký đồ và thời gian lưu. Kết quả là các chất trong HPLC tách hoàn toàn, pic cân đối, thời gian lưu không quá dài. Điều đó chứng tỏ, các chương trình sắc ký sử dụng trong đề tài là phù hợp đểđịnh lượng các thành phần trong vỏ thân cây Gạo.
3.7.3. Về kết quảđịnh lượng các chất trong vỏ thân cây Gạo
1. Từ mẫu vỏ thân cây Gạo dùng nghiên cứu chúng tôi xác định được hàm lượng của 6 chất nghiên cứu có trong 100g dược liệu như sau: epicatechin là 12,293mg; catechin là 6,716mg; daucosterol là 1,811mg; lupeol là 9,451mg; stigmasterol là 1,915mg và friedelin là 7,566mg.
2. Cần làm thêm trên số lượng mẫu đủ lớn để có số liệu chính xác hơn về hàm lượng 6 chất trên có trong vỏ thân cây Gạo.
3.7.4. Về thẩm định phương pháp định lượng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi xây dựng một quy trình phân tích, để áp dụng quy trình vào phân tích trong thực tế một cách chính xác, cho kết quả tin cậy, cần thẩm định lại phương pháp theo quy định chung về phân tích định lượng.
- Độ chọn lọc: Nhờ có phần mềm xử lý thô, chúng tôi đã ghi lại các pic sắc ký và chỉ ra là pic các chất thu được trên sắc ký đồ là tinh khiết. Chứng tỏ phương pháp có độ chọn lọc rất cao.
- Khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành khảo sát các khoảng nồng độ tuyến tính như trong các bảng 3.4 đến 3.9 cho thấy các chất đều có đường hồi quy trong khoảng nồng độ khảo sát có đường thẳng, phương trình hồi quy có hệ số tương quan
>0,99 chứng tỏ sự tương quan tuyến tính nồng độ của chất và diện tích pic trong khoảng nồng độ khảo sát.
- Độ đúng, độ lặp lại của phương pháp: Đều cho kết quả phù hợp với yêu cầu thực tế cần phân tích.
- Giới hạn định lượng: Với cách chuẩn bị các dung dịch thử trên thì giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD) đã được trình bày trong bảng 3.11 mục 3.5.6.
Như vậy, chương trình định lượng các chất trong vỏ thân cây Gạo bằng phương pháp HPLC mà tôi xây dựng hoàn toàn đáng tin cậy. Đồng thời phương pháp có ưu điểm là đơn giản, nhanh chóng, dễ thực hiện, có thể tiết kiệm được thời gian và chi phí kiểm nghiệm. Hiện nay đa số các Trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm, mỹ phẩm đến các cơ sở sản xuất thuốc đều được trang bị máy HPLC. Vì vậy, kết quả nghiên cứu của đề tài có thể triển khai và ứng dụng vào thực tế.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
KẾT LUẬN
Qua thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi đã triển khai thực nghiệm và đã thu được các kết quả sau:
1. Đã xây dựng được một phương pháp cho phép định lượng đồng thời 6 chất trong vỏ thân cây Gạo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện sắc ký cụ thể như sau:
- Cột pha đảo Zorbax C18 column (250; 4,6mm; 5μm) kết hợp bảo vệ cột Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl) (5μm, 3,0mm) tại 25oC.
- Tốc độ dòng: 0,7mL/phút. - Thể tích tiêm: 10µl
- Detector: sử dụng detector SPD-20A, chọn bước sóng phát hiện 280nm. - Pha động: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol (B). Tỷ lệ kênh A-B ban đầu là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (40:60) ở phút thứ 6, rồi thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (50:50) ở phút thứ 23. Thay đổi tuyến tính về lại A–B (40:60) ở phút thứ 27 và cuối cùng pha động được thay đổi tuyến tính về tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu ở phút thứ 30.
2. Phương pháp xây dựng đã được thẩm định, kết quả cho thấy các chỉ tiêu đều đạt yêu cầu, đảm bảo phương pháp có thể áp dụng vào định lượng các chất có trong vỏ thân cây Gạo.
3. Đã áp dụng phương pháp và xác định đồng thời được hàm lượng của 6 hợp chất trong 100g của 01 mẫu vỏ thân Gạo cụ thể như sau: epicatechin là 12,293mg; catechin là 6,716mg; daucosterol là 1,811mg; lupeol là 9,451mg; stigmasterol là 1,915mg và friedelin là 7,566mg.
ĐỀ XUẤT
- Tiếp tục phân lập và tinh chế thêm các hợp chất có trong vỏ thân cây Gạo để có thể tiến hành thiết lập các chất chuẩn đối chiếu. Đây là công việc rất quan trọng để có thể cho kết quả xác định hàm lượng các chất trong vỏ thân cây Gạo được chính xác và ổn định hơn.
- Do thời gian có hạn, tôi mới chỉ phân tích trên 01 mẫu vỏ thân cây Gạo nên chưa có tính đại diện cao. Do đó cần mở rộng nghiên cứu, nghiên cứu xác định hàm lượng hoạt chất trong vỏ thân cây Gạo khác ở Việt để có số liệu chính xác về hàm lượng các hợp chất có trong lá cây Gạo.
- Hoàn thiện phương pháp, để có thể góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu cây Gạo (Bombax Malabaricum DC.).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), Hoá phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội, 125-147, 173-223.
2. Đỗ Huy Bích, Bùi Xuân Chương (1980), Sổ tay cây thuốc Việt nam, Nxb Y học,
201.
3. Nguyễn Huy Bích và cs (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt nam, tập I, NXB Khoa học và Kỹ Thuật Hà Nội, 852.
4. Bộ Y Tế (1978), Dược liệu Việt Nam, Nxb Y học, 5, 67-68.
5. Võ Văn Chi (1996), Từđiển cây thuốc Việt nam, Nxb Y học, 508-509. 6. Võ Văn Chi (1997), Từđiển cây thuốc Việt nam, Nxb Y học, 1437-1445.
7. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Nxb Khoa học và Kỹ Thuật, tập I, 464-466.
8. Võ Văn Chi, Vũ Văn Chuyên (1969), Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam. Nxb KHKT, tập I, 146-150. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
9. Nguyễn Văn Đàn, Vũ Xuân Quang, Ngô Ngọc Khuyến (2005), Cây hoa chữa bệnh (hoa trị liệu pháp), Nxb Y học, 37-40.
10. Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam, trồng hái, chế biến, trị bệnh ban đầu. Nxb Nông nghiệp, 1195-1200.
11. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An, Phan Văn Kiệm (2011), “Phân lập và nhận dạng epicatechin từ vỏ thân cây Gạo Bombax malabaricum DC., họ Gạo Bombacaceae”, Tạp chí Dược học, 6/2011(422), 19-20, 44, 57.
12. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2012), “Phân lập catechin và momor-cerebrosid I từ vỏ thân cây Gạo (Bombax malabaricum
DC.)”, Tạp chí Dược học, 12/2012(440), 49-52.
13. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2013), “Phân lập lupeol và stigmasterol từ vỏ thân cây Gạo (Bombax malabaricum DC.)”, Tạp chí Dược học, 3/2013(443), 14-18.
14. Phó Thuần Hương (2010), “Cây Gạo chứa nhiều bệnh”, Thuốc và sức khỏe, 15/11/2010(416), 15.
16. Nguyễn Tích, Trần Hợp (1971), Tên cây rừng Việt Nam, Nxb Nông thôn, 64. 17. Viện Dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ
dược thảo, Nxb Khoa học và Kỹ Thuật.
18. Viện Dược liệu (12/2009), Cây thuốc Nghệ An, Nhà in báo Nghệ an, 354-355. 19. Viện Dược liệu (12/2009), Cây thuốc và động vận làm thuốc ở Việt nam, tập I,