Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký là: - Phương pháp chuẩn ngoại
- Phương pháp chuẩn nội - Phương pháp thêm chuẩn
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại.
Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thửđều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử.
Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm. Chuẩn hóa một điểm
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:
Cx =
Cx: Nồng độ mẫu thử CS: Nồng độ mẫu chuẩn
Sx: Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu thử SS: Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn Chuẩn hóa nhiều điểm
Cách tiến hành: Chuẩn bị 1 dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi
điểm nồng độ chuẩn. Vẽđồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính theo 2 cách:
- Áp dữ liệu diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của nó.
- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích pic (hoặc chiều cao) với nồng độ của chất cần xác định.
S = a + b.C S: Diện tích pic
a: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung b: Độ dốc của đường chuẩn
C: Nồng độ của chất thử.
Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử.
Chú ý: Độ lớn của diện tích pic Sx (hoặc chiều cao pic) mẫu thử phải nằm trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn [1].