Lấy 3 mẫu ngẫu nhiên ở 3 vị trí khác nhau của mẫu dược liệu đem đo hàm ẩm bằng máy xác định độẩm Precisa XM 60. Kết quả thu được tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Độ ẩm bột dược liệu Thứ tự Khối lượng dược liệu (g) Độẩm (%) 1 2,5463 7,33 2 2,4698 7,81 3 2,5129 8,02 Trung bình 2,5096 7,72 3.1.2. Hiệu suất chiết - Khối lượng cắn toàn phần:
Cân 500,08g vỏ thân cây Gạo (có độẩm 7,72%) đã được làm nhỏ, ngâm lạnh 3 lần với methanol trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thu hồi dịch chiết, lọc, gộp dịch lọc được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Cắn được cô đến khối lượng không đổi, thu được 25,12g cắn toàn phần, đem bảo quản ở 4ºC.
- Hiệu suất chiết: trong đó: M = 500,08(g) x = 7,72% a = 25,12(g) Ö Hiệu suất X = 5,41% 3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250mm × 4,6mm; 5µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30mm ID). Quá trình khảo sát tiến hành ở nhiệt độ phòng là 25ºC.
Sử dụng detector SPD-20A, chọn bước sóng phát hiện 280nm để dung hòa khả năng phát hiện của các hợp chất nghiên cứu.
Bắt đầu từ dùng hỗn hợp acetonitril và methanol có thêm acid formic 0,1% với các tỷ lệ khác nhau ở chế độđẳng dòng đều không cho khả năng tách cả 6 chất nghiên cứu hoặc thời gian phân tích quá dài. Do vậy chúng tôi phải sử dụng chếđộ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol.
Sau khi thử nghiệm với một số chương trình dung môi khác nhau, tốc độ dòng và thể tích tiêm mẫu khác nhau, chúng tôi chọn lựa được một chương trình tương đối phù hợp đủ tách các chất nghiên cứu cũng như các pic khác trong mẫu nghiên cứu được chuẩn bị từ vỏ thân cây Gạo. Mặt khác thời gian phân tích không quá kéo dài, là 30 phút cho một lần tiêm mẫu. Điều kiện sắc ký chúng tôi xác định được với điều kiện cột sẵn có ở trên như sau:
Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol (B). Tỷ lệ kênh A-B ban đầu là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (40:60) ở phút thứ 6, rồi thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (50:50) ở phút thứ 23. Thay đổi tuyến tính về lại A–B (40:60) ở phút thứ 27 và cuối cùng pha động được thay đổi tuyến tính về tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu ở phút thứ 30.
Tốc độ dòng là 0,7 mL/phút và thể tích tiêm mẫu là 10μl.
Với điều kiện sắc ký như trên, các chất được tách hoàn toàn, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý. Các sắc ký đồ thu được nhưở hình 3.1 và hình 3.2.
Hình 3.1. Sắc ký đồ của hỗn hợp 6 chất nghiên cứu.
Hình 3.2. Sắc ký đồ của mẫu thử chuẩn bị từ vỏ thân cây Gạo.
Tiến hành sắc ký với từng hợp chất nghiên cứu (hình 3.3 đến hình 3.8) và so sánh với sắc ký đồ thu được của hỗn hợp 6 hợp chất là epicatechin, catechin, daucosterol, lupeol, stigmasterol và friedelin (hình 3.1) xác định được thời gian lưu của các chất lần lượt là 4,375; 5,411; 7,878; 11,356; 17,935 và 21,348 phút.
Như vậy, qua quá trình khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện sắc ký như sau để định lượng 6 chất: epicatechin, catechin, daucosterol, lupeol, stigmasterol và friedelin:
‐ Cột: Zorbax C18 (250mm × 4,6mm; 5µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30mm ID), nhiệt độ 25º.
‐ Pha động: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol (B). Tỷ lệ kênh A-B ban đầu là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (40:60) ở phút thứ 6, rồi thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (50:50) ở phút thứ 23. Thay đổi tuyến tính về lại A–B (40:60) ở phút thứ 27 và cuối cùng pha động được thay đổi tuyến tính về tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu ở phút thứ 30.
‐ Detector SPD-20A với λ = 280nm.
‐ Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút.
‐ Thể tích tiêm: 10μl.
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU
Các chất nghiên cứu được cân chính xác và hòa tan thành các dung dịch trong methanol và tiêm vào hệ thống sắc ký.
Thực hiện chương trình sắc ký như mục 3.2, thu được sắc ký đồ của 6 hợp chất nhưở hình 3.3 đến hình 3.8.
Hình 3.3. Sắc ký đồ của epicatechin phân lập được từ vỏ thân cây Gạo.
Hình 3.4. Sắc ký đồ của catechin phân lập được từ vỏ thân cây Gạo.
Hình 3.6. Sắc ký đồ của lupeol phân lập được từ vỏ thân cây Gạo.
Hình 3.7. Sắc ký đồ của stigmasterol phân lập được từ vỏ thân cây Gạo.
Các sắc ký đồở các hình 3.3 đến hình 3.8 cho thấy cả 6 hợp chất đều không xuất hiện pic tạp chất (trong thời gian sắc ký là 30 phút) nên có thể sử dụng các hợp chất này làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu. Tuy nhiên do lượng các hợp chất phân lập được còn ít và chưa đủ thời gian cho phép để thiết lập chất chuẩn, do vậy chúng tôi tạm dùng chúng như chất đối chiếu để khảo sát phương pháp định lượng chúng trong vỏ thân cây Gạo.
3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ
Định tính bằng so sánh phổ khối lượng của các pic cùng thời gian lưu của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Phổ khối lượng nhận dạng các pic được đo ở chế độ: ESI+ với tốc độ khí phun là 3 L/phút, tốc độ khí làm khô là 15L/phút, nhiệt độ mao quản là 250oC, nhiệt độ của heat block là 400oC, vùng quét m/z là 100-1000. Thế phá mảnh +4,5kV.
Phổ khối lượng của các pic tương ứng thu được nhưở các hình 3.9-3.14.
Hình 3.9. Phổ khối lượng ứng với các pic của epicatechin trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu
.
Hình 3.10. Phổ khối lượng ứng với các pic của catechin trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.11. Phổ khối lượng ứng với các pic của daucosterol trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.12. Phổ khối lượng ứng với các pic của lupeol trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.13. Phổ khối lượng ứng với các pic của stigmasterol trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu
Hình 3.14. Phổ khối lượng ứng với các pic của friedelin trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu
Kết quả hoàn toàn phù hợp giữa phổ khối lượng của các pic tương ứng với từng chất trên sắc ký đồ hỗn hợp 6 chất nghiên cứu và mẫu thử là dịch chiết toàn phần chuẩn bị từ vỏ thân cây Gạo. Ngoài pic của 6 hợp chất nghiên cứu, trên sắc ký đồ của mẫu thử chuẩn bị từ vỏ thân cây Gạo còn xuất hiện thêm 2 pic khác ở khoảng 14,0 phút và 25,4 phút (hình 3.2)
3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG VỎ THÂN CÂY GẠO BẰNG HPLC
3.5.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký:
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bịở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD của thời gian lưu.
Bảng 3.2. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn
Hợp chất Epicatechin Catechin Daucosterol Lupeol Stigmasterol Friedelin
1 4,370 5,401 7,890 11,380 17,910 21,350 2 4,375 5,412 7,866 11,365 17,980 21,340 3 4,380 5,413 7,869 11,346 17,902 21,397 4 4,369 5,411 7,883 11,353 17,923 21,372 5 4,376 5,423 7,886 11,334 17,950 21,314 6 4,381 5,408 7,875 11,357 17,945 21,317 Trung bình 4,375 5,411 7,878 11,356 17,935 21,348 Thời gian lưu (phút) RSD (%) 0,11 0,13 0,12 0,14 0,16 0,15 Sốđĩa lý thuyết 22320 23230 24550 34660 35140 32340 Hệ số bất đối 1,11 1,05 1,10 1,07 1,04 1,12 Nhận xét: Các thông số thực nghiệm thể hiện sự phù hợp của hệ thống sắc ký đã lựa chọn để phân tích các hợp chất nghiên cứu. 3.5.2. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu được kiểm tra bằng cách tiêm lần lượt dung môi pha mẫu, dung dịch thử và dung dịch đối chiếu vào hệ thống sắc ký, kết quả cho thấy dung dịch chuẩn và dung dịch thử tương ứng cho pic có thời gian lưu tương ứng (hình 3.1 và hình 3.2), còn dung môi pha mẫu không cho pic ở các thời gian lưu tương ứng (hình 3.15).
Hình 3.15. Sắc ký đồ của mẫu trắng (dung môi pha mẫu)
3.5.3. Độ lặp lại
Tiêm lặp lại 6 lần với một dung dịch ở nồng độ khảo sát đối với mỗi chất nghiên cứu vào hệ thống sắc ký để khảo sát độ lặp lại.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại với các chất phân tích
Diện tích pic (mAU.s) Hợp chất 1 2 3 4 5 6 Tr.bình RSD (%) Epicatechin 38872 38543 38590 38650 38596 38652 38650,5 0,27 Catechin 124346 124367 123454 124356 123243 124562 124054,7 0,41 Daucosterol 6184 6170 6155 6156 6243 6182 6181,67 0,48 Lupeol 60352 60367 60454 60356 60243 60862 60439 0,33 Stigmasterol 6351 6270 6325 6356 6343 6362 6334,5 0,49 Friedelin 21501 21470 21454 21356 21243 21262 21381 0,47 Nhận xét:
Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp HPLC đã chọn có độ chính xác cao với các giá trịđộ lệch chuẩn thu được tương đối nhỏ.
3.5.4. Khoảng nồng độ tuyến tính
Tiêm dung dịch chuẩn trong khoảng nồng độ khảo sát vào hệ thống sắc ký để khảo sát độ tuyến tính, kết quảđược ghi trong bảng 3.4 -3.9.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tuyến tính với epicatechin
Nồng độ C(µg/mL) 4,6 9,2 18,4 27,5 36,7 45,9 Diện tíc pic S (mAu.s) 7360 14718 29437 44154 58872 73590
Phương trình hồi quy với epicatechin xác định được là S = 1604,63.C - 34,73. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 4,6-
45,9μg/mL với hệ số tương quan r là 1,0000.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tuyến tính với catechin
Nồng độ C(µg/mL) 3,8 7,6 15,2 22,8 30,4 45,6 Diện tíc pic S (mAu.s) 16213 32420 64000 97201 129700 197023
Phương trình hồi quy với catechin xác định được là S = 4321,06.C-884,04. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 3,8- 45,6μg/mL với hệ số tương quan r là 0,9999.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tuyến tính với daucosterol
Nồng độ C (µg/mL) 1,7 5,1 13,6 20,4 27,2 34,0 Diện tíc pic S (mAu.s) 3573 10652 27420 42630 56841 71051
Phương trình hồi quy với daucosterol xác định được là S = 2093,72.C - 232,08. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 1,7- 34,0μg/mL với hệ số tương quan r là 0,9999.
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tuyến tính với Lupeol
Nồng độ C (µg/mL) 4,5 9,0 17,9 26,9 35,8 53,8 Diện tíc pic S (mAu.s) 9546 19090 38180 57270 76001 118017
Phương trình hồi quy với lupeol xác định được là S = 2188,58.C – 909,39. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 4,5- 53,8μg/mL với hệ số tương quan r là 0,9997.
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát tuyến tính với Stigmasterol
Nồng độ C (µg/mL) 2,4 7,2 9,6 14,4 19,2 24,0 Diện tíc pic S (mAu.s) 3504 10410 14000 21002 28020 34890
Phương trình hồi quy với stigmasterol xác định được là S = 1456,33.C- 3,36. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 2,4- 24,0μg/mL với hệ số tương quan r là 1,0000.
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tuyến tính với friedelin
Nồng độ C (µg/mL) 5,3 8,0 16,0 21,4 32,0 42,7 Diện tíc pic S (mAu.s) 7221 10801 21500 28700 43231 58500
Phương trình hồi quy với friedelin xác định được là S = 1367,76.C-260,66. Phương trình đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát 5,3- 42,7μg/mL với hệ số tương quan r là 0,9999.
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ khảo sát đối với các hợp chất nghiên cứu. Kết quả này được sử dụng làm cơ sở để lựa chọn nồng độđịnh lượng của các hợp chất nghiên cứu tương ứng.
3.5.5. Độđúng
Thêm một lượng chính xác dung dịch chuẩn vào dung dịch thử, sao cho tổng nồng độ sau khi thêm vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tiến hành phân tích kết quả sắc ký để khảo sát độ đúng. Kết quả được tổng hợp trong bảng 3.10, chi tiết cho từng chất được thể hiện trong Phụ lục.
Bàng 3.10. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 6 chất
Tỷ lệ thu hồi (%) Hợp chất Nồng độ thêm vào mẫu (μg/mL) Trung bình min-max Epicatechin 7,34 99,20 97,44 - 99,84 Catechin 3,04 99,21 96,58 - 101,26 Lupeol 7,17 100,88 99,82 - 101,74 Friedelin 4,27 99,77 95,33 - 102,68 Stigmasterol 1,92 100,61 99,07 - 102,43 Daucosterol 1,36 101,42 99,97 - 102,19
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp phân tích đã lựa chọn cho tỷ lệ thu hồi cao, có độđúng tốt.
3.5.6. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Xác định LOD dựa vào tỷ lệđáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N). Việc xác định tỉ lệ S/N được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng của mẫu trắng từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được.
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/mL)
Epicatechin Catechin Daucosterol Lupeol Stigmasterol Friedelin LOD 0,5 0,5 0,34 0,61 0,32 0,8
Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, giới hạn định lượng LOQ thấp hơn nồng độ định lượng nhiều lần. Việc xác định LOQ chủ yếu giúp cho việc phân tích tạp chất.
3.6. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG VỎ THÂN CÂY GẠO Tiến hành cân chính xác khoảng 0,5000g cắn hòa tan và định mức thành Tiến hành cân chính xác khoảng 0,5000g cắn hòa tan và định mức thành 25mL, lọc qua bông và qua màng lọc. Tiến hành sắc ký song song mẫu thử với mẫu hỗn hợp các chất đối chiếu. Tính kết quả theo phương pháp chuẩn hóa 1 điểm.
Lượng cắn cân cho các lần định lượng lần lượt là: 0,5022g; 0,5032g và 0,5034g. Tính toán lượng từng chất có mẫu thử qui về tương đương với 0,5000g cắn. Tính giá trị trung bình của 3 lần thử. Từ lượng dược liệu và hàm ẩm của nó đem chiết và tổng lượng cắn thu được tính ra hàm lượng từng chất có trong 100g dược liệu khô.
Kết quảđịnh lượng thu được có trong 100g vỏ thân cây Gạo được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.12. Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong mẫu vỏ thân cây Gạo nghiên cứu
Khối lượng hợp chất (mg)
Có trong cắn đem định lượng Tương đương trong 0,5g cắn
Hợp chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Tr.bình Hàm lượng (mg/100g dl) Epicatechin 1,225 1,226 1,205 1,219 1,218 1,197 1,211 12,293 Catechin 0,662 0,667 0,668 0,659 0,663 0,664 0,662 6,716 Daucosterol 0,178 0,181 0,180 0,177 0,179 0,179 0,178 1,811 Lupeol 0,936 0,935 0,939 0,932 0,929 0,933 0,931 9,451 Stigmasterol 0,186 0,190 0,193 0,185 0,189 0,192 0,189 1,915 Friedelin 0,752 0,751 0,746 0,749 0,746 0,741 0,746 7,566
Cần làm thêm trên số lượng mẫu đủ lớn để có số liệu chính xác hơn về hàm lượng 6 chất trên có trong vỏ thân cây Gạo.
3.7. BÀN LUẬN
3.7.1. Về phương pháp xử lý mẫu
Đểđịnh lượng các chất trong cây Gạo đạt kết quả tốt, trước hết cần phải chiết kiệt hoạt chất và làm sạch dịch chiết. Qua tham khảo các tài liệu, tôi chọn phương pháp ngâm lạnh với dung môi là methanol. Đây là phương pháp dễ thực hiện trong
điều kiện phòng thí nghiệm, không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt mà lại cho hiệu suất cao.
3.7.2. Về khảo sát điều kiện sắc ký HPLC
Dựa trên các nghiên cứu trước đây và các tài liệu đã công bố, kết hợp với các điều kiện có sẵn tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký nhưđã mô tảở mục 3.2 và đã xây dựng được chương trình sắc ký trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HP1100. Việc đánh giá thông qua xác định tính phù hợp của hệ thống sắc ký, khả