Sau khi xây dựng một quy trình phân tích, để áp dụng quy trình vào phân tích trong thực tế một cách chính xác, cho kết quả tin cậy, cần thẩm định lại phương pháp theo quy định chung về phân tích định lượng.
- Độ chọn lọc: Nhờ có phần mềm xử lý thô, chúng tôi đã ghi lại các pic sắc ký và chỉ ra là pic các chất thu được trên sắc ký đồ là tinh khiết. Chứng tỏ phương pháp có độ chọn lọc rất cao.
- Khoảng nồng độ tuyến tính: Tiến hành khảo sát các khoảng nồng độ tuyến tính như trong các bảng 3.4 đến 3.9 cho thấy các chất đều có đường hồi quy trong khoảng nồng độ khảo sát có đường thẳng, phương trình hồi quy có hệ số tương quan
>0,99 chứng tỏ sự tương quan tuyến tính nồng độ của chất và diện tích pic trong khoảng nồng độ khảo sát.
- Độ đúng, độ lặp lại của phương pháp: Đều cho kết quả phù hợp với yêu cầu thực tế cần phân tích.
- Giới hạn định lượng: Với cách chuẩn bị các dung dịch thử trên thì giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD) đã được trình bày trong bảng 3.11 mục 3.5.6.
Như vậy, chương trình định lượng các chất trong vỏ thân cây Gạo bằng phương pháp HPLC mà tôi xây dựng hoàn toàn đáng tin cậy. Đồng thời phương pháp có ưu điểm là đơn giản, nhanh chóng, dễ thực hiện, có thể tiết kiệm được thời gian và chi phí kiểm nghiệm. Hiện nay đa số các Trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm, mỹ phẩm đến các cơ sở sản xuất thuốc đều được trang bị máy HPLC. Vì vậy, kết quả nghiên cứu của đề tài có thể triển khai và ứng dụng vào thực tế.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
KẾT LUẬN
Qua thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi đã triển khai thực nghiệm và đã thu được các kết quả sau:
1. Đã xây dựng được một phương pháp cho phép định lượng đồng thời 6 chất trong vỏ thân cây Gạo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với các điều kiện sắc ký cụ thể như sau:
- Cột pha đảo Zorbax C18 column (250; 4,6mm; 5μm) kết hợp bảo vệ cột Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl) (5μm, 3,0mm) tại 25oC.
- Tốc độ dòng: 0,7mL/phút. - Thể tích tiêm: 10µl
- Detector: sử dụng detector SPD-20A, chọn bước sóng phát hiện 280nm. - Pha động: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol (B). Tỷ lệ kênh A-B ban đầu là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (40:60) ở phút thứ 6, rồi thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (50:50) ở phút thứ 23. Thay đổi tuyến tính về lại A–B (40:60) ở phút thứ 27 và cuối cùng pha động được thay đổi tuyến tính về tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu ở phút thứ 30.
2. Phương pháp xây dựng đã được thẩm định, kết quả cho thấy các chỉ tiêu đều đạt yêu cầu, đảm bảo phương pháp có thể áp dụng vào định lượng các chất có trong vỏ thân cây Gạo.
3. Đã áp dụng phương pháp và xác định đồng thời được hàm lượng của 6 hợp chất trong 100g của 01 mẫu vỏ thân Gạo cụ thể như sau: epicatechin là 12,293mg; catechin là 6,716mg; daucosterol là 1,811mg; lupeol là 9,451mg; stigmasterol là 1,915mg và friedelin là 7,566mg.
ĐỀ XUẤT
- Tiếp tục phân lập và tinh chế thêm các hợp chất có trong vỏ thân cây Gạo để có thể tiến hành thiết lập các chất chuẩn đối chiếu. Đây là công việc rất quan trọng để có thể cho kết quả xác định hàm lượng các chất trong vỏ thân cây Gạo được chính xác và ổn định hơn.
- Do thời gian có hạn, tôi mới chỉ phân tích trên 01 mẫu vỏ thân cây Gạo nên chưa có tính đại diện cao. Do đó cần mở rộng nghiên cứu, nghiên cứu xác định hàm lượng hoạt chất trong vỏ thân cây Gạo khác ở Việt để có số liệu chính xác về hàm lượng các hợp chất có trong lá cây Gạo.
- Hoàn thiện phương pháp, để có thể góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu cây Gạo (Bombax Malabaricum DC.).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), Hoá phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội, 125-147, 173-223.
2. Đỗ Huy Bích, Bùi Xuân Chương (1980), Sổ tay cây thuốc Việt nam, Nxb Y học,
201.
3. Nguyễn Huy Bích và cs (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt nam, tập I, NXB Khoa học và Kỹ Thuật Hà Nội, 852.
4. Bộ Y Tế (1978), Dược liệu Việt Nam, Nxb Y học, 5, 67-68.
5. Võ Văn Chi (1996), Từđiển cây thuốc Việt nam, Nxb Y học, 508-509. 6. Võ Văn Chi (1997), Từđiển cây thuốc Việt nam, Nxb Y học, 1437-1445.
7. Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Nxb Khoa học và Kỹ Thuật, tập I, 464-466.
8. Võ Văn Chi, Vũ Văn Chuyên (1969), Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam. Nxb KHKT, tập I, 146-150.
9. Nguyễn Văn Đàn, Vũ Xuân Quang, Ngô Ngọc Khuyến (2005), Cây hoa chữa bệnh (hoa trị liệu pháp), Nxb Y học, 37-40.
10. Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam, trồng hái, chế biến, trị bệnh ban đầu. Nxb Nông nghiệp, 1195-1200.
11. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An, Phan Văn Kiệm (2011), “Phân lập và nhận dạng epicatechin từ vỏ thân cây Gạo Bombax malabaricum DC., họ Gạo Bombacaceae”, Tạp chí Dược học, 6/2011(422), 19-20, 44, 57.
12. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2012), “Phân lập catechin và momor-cerebrosid I từ vỏ thân cây Gạo (Bombax malabaricum
DC.)”, Tạp chí Dược học, 12/2012(440), 49-52.
13. Hồ Thị Thanh Huyền, Thái Nguyễn Hùng Thu, Nguyễn Thái An (2013), “Phân lập lupeol và stigmasterol từ vỏ thân cây Gạo (Bombax malabaricum DC.)”, Tạp chí Dược học, 3/2013(443), 14-18.
14. Phó Thuần Hương (2010), “Cây Gạo chứa nhiều bệnh”, Thuốc và sức khỏe, 15/11/2010(416), 15.
16. Nguyễn Tích, Trần Hợp (1971), Tên cây rừng Việt Nam, Nxb Nông thôn, 64. 17. Viện Dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ
dược thảo, Nxb Khoa học và Kỹ Thuật.
18. Viện Dược liệu (12/2009), Cây thuốc Nghệ An, Nhà in báo Nghệ an, 354-355. 19. Viện Dược liệu (12/2009), Cây thuốc và động vận làm thuốc ở Việt nam, tập I,
Nxb Khoa học và Kỹ Thuật, 852-853.
TIẾNG ANH
20. Fernández A, Alvarez A, García MD, Sáenz MT (Apr 2001), “Anti-inflammatory effect of Pimenta racemosa var. ozua and isolation of the triterpene lupeol”,II Farmaco, 56(4), 335–338.
21. Fernández MA, de las Heras B, García MD, Sáenz MT, Villar A (Nov 2001), “ New insights into the mechanism of action of the anti-inflammatory triterpene lupeol”, J Pharmacy and Pharmacology, 53(11), 1533–1539.
22. Paulrayer Antonisamy, Veeramuthu Duraipandiyan, Savarimuthu Ignacimuthu (8/2011), “Anti-inflammatory,analgesic and antipyretic effects of Friedelin isolated from Azima tetracantha Lam. in mouse and rat models”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, Division of Ethnopharmacology, Entomology Research Institute, Loyola College, Chennai, Tamil Nadu, India, 63(8), 1070– 1077.
23. Lin CC, Chen SY, Lin JM, Chiu HF (1992), “ The pharmacological and pathological studies on Taiwan folk medicine (VIII): The anti-inflammatory and liver protective effects of “mu-mien”, The American Journal of Chinese Medicince, 20(2), 135-46.
24. M Careri, L Elviri, A Mangia (2001), “Liquid chromatography–UV determination and liquid chromatography–atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric characterization of sitosterol and stigmasterol in soybean oil”,
Journal of Chromatography A, 935(1–2), 249–257.
25. Richard E. Ostlund Jr (2007), “Phytosterols,Cholesterol Absorption and HealthyDiets”, Journal Lipids, 42(1), 41-45.
26. Lee JH, Lee JY, Park JH, Jung HS, Kim JS, Kang SS, Kim YS, Han Y (2007), “Immunoregulatory activity by daucosterol, a beta-sitosterol glycoside, induces
protective Th1 immune response against disseminated Candidiasis in mice”,
Vaccins, 25(19), 3834–3840.
27. Hogg, John A. (1992). "Steroids, the steroid community, and Upjohn in perspective: A profile of innovation", Steroids, 57 (12), 593–616.
28. Nima D. Namsa, Hui Tag M. Mandal, P. Kalita, A.K.Das (2009), “ An ethnobotanical study of traditional anti-inflammatory plants used by the Lohit community of Arunachal Pradesh, India”, Journal of Ethnopharmacology, 125(2), 234-245.
29. Padmanabhan P Nair, NabilaTurjman, GeorgeKessie, BeverlyCalkins, Gordon T Goodman, Helene Davidovitz, and Geetha Nimmagadd (1984), “Diet, nutrition intake, and metabolismin, Populations at high and low risk for colon cancer Dietary cholesterol,f3-sitosterol,and stigmasterol”, The American Journal of Clinical Nutrition, 40(4), 927-930.
30. Sundararaman P, Djerassi C (1977). "A convenient synthesis of progesterone from stigmasterol", Journal of Organic Chemistry. 42(22), 3633–3634.
31. Mohammed Rahmatullah, Md. Rezwanul Haque. Sarder Kamrul Islam, Farhana Jarnal, A.B.M. Anwarul Bashar, Rasheda Ahmed, Ishtiaq Ahmed, Rownak Jahan, Shamima Absan, Maieedul H. Chowdhury (2010). “A survey of the Use of Medicinal Plants by Folk Medicinal Practitioners in Three Areas of Pirojpur District, Bangladesh”, American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture, 4(2), 247-259.
32. Mopuru VIJAYA BHASKAR REDDY, Muntha KESAVA REDDY, Duvvuru GUNASEKAR, Madugula MARTHANDA MURTHY, Cristelle CAUX, and Bernard BODO (2003), “A new Sesquiterpene Lactone from Bombax Malabaricum”, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 51(4), 458-459.
33. Rubeena SLEEM, Syed Iqbal AHMAD, Mohammad AHMED, Zareen FAIZI, Sadia ZIKR-UR-REHMAN, Muhammad ALI, and Shaheen FAIZI (2003), “Hypotensive Activity and Toxicology of Constituents from Bombax ceiba Stem Bark”, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 26(1), 41-45.
34. Hagen Schroeter, Parmvir Bahia, Jeremy P. E. Spencer, Olivia Sheppard, Marcus Rattray, Enrique Cadenas, Catherine Rice-Evans, Robert J. Williams (2007), “(-) Epicatechin stimulates ERK-dependent cyclic AMP response element
activity and up-regulates GluR2 in cortical neurons”, Journal of Neurochemistry, 101(6), 1596–1606.
35. Hagen Schroeter,Christian Heiss, Jan Balzer, Petra KleinbongardCarl L. Keen,Norman K. Hollenberg, Helmut Sies, Catherine Kwik-Uribe, Harold H. Schmitz, and Malte Kelm (January 24, 2006 ), “(–)-Epicatechin mediates beneficial effects of flavanol-rich cocoa on vascular function in humans”,
PNAS, 103(4), 1024-1029.
36. Navindra P. Seeram, Yanjun Zhang & Muraleedharan G. Nair (2003), “Inhibition of Proliferation of Human Cancer Cells and Cyclooxygenase Enzymes by Anthocyanidins and Catechins”, Nutrition and Cancer, 46(1),101-106.
37. Tang De-song, Shen Sheng-rong, Chen Xun, Zhang Yu-yan, Xu Chong-yang (June 2004), “Interaction of catechins with aluminum in vitro”, Journal of Zhejiang University Science, 5(6), 668-675.
38. K. Surendra and E. J. Corey (2009). "A short enantioselective total synthesis of the fundamental pentacyclic triterpene lupeol”, Journal of the American Chemical Society, 131(39), 13928–13929.
39. Katsuyuki Tanabe, Yoshifuru Tamura, Miguel A. Lanaspa, Makoto Miyazaki, Norihiko Suzuki, Waichi Sato, Yohei Maeshima, George F. Schreiner, Francisco J. Villarreal, Richard J. Johnson, and Takahiko Nakagawa (2012), “Epicatechin limits renal injury by mitochondrial protection in cisplatin nephropathy”, American Journal of Physiology, 303(9), 1264-1274. 40. Liby KT, Yore MM, Sporn MB (2007), “Triterpenoids and rexinoids as
multifunctional agents for the prevention and treatment of cancer”. Nature Review Cancer, 7, 357–369.
41. Ravi V. Patel SS, Verma NK, Dutta D, Saleem TSM (2010), “Hepatoprotective Activity of Bombax ceiba L. Against Isoniazid and Rifampicin – induced Toxicity in Experimental Rats”, International Journal of Applied Research in Natural Products, 3(3), 19-26.
42. Setzer W, Setzer MC (2003), “Plant-derived triterpenoids as potential antineoplastic agents”, Mini Review in Medical Chemistry, 3(6), 540–556.
43. Young-Jae You, Nguyen Hai Nam, Yong Kim, Ki-Hwan Bae and Byung-Zun Ahn (2003), “Antiangiogenic Activitiy of Lupeol from Bombax ceiba”,
PHỤ LỤC
Kết quả khảo sát độđúng của 6 hợp chất có trong vỏ thân cây Gạo
Kết quả khảo sát độđúng với Epicatechin TT S mẫu (mAU.s) S thêm (mAU.s) C thêm (µg/mL) C cũ (µg/mL) C mới (µg/mL) % tìm lại 1 38872 50345 7,34 24,25 31,40 97,44 2 38543 50245 7,34 24,04 31,34 99,39 3 38590 50346 7,34 24,07 31,40 99,84 4 38650 50355 7,34 24,11 31,41 99,41 5 38596 50346 7,34 24,07 31,40 99,79 6 38652 50345 7,34 24,11 31,40 99,31 24,11 99,20 RSD (%) 0.27 0.08 0.00 0.28 0.07 0.82 Kết quả khảo sát độđúng với Catechin TT S mẫu (mAU.s) S thêm (mAU.s) C thêm (µg/mL) C cũ (µg/mL) C mới (µg/mL) % tìm lại 1 124346 136841 3,04 29,36 32,31 97,25 2 124367 137242 3,04 29,36 32,41 100,21 3 123454 136272 3,04 29,14 32,18 99,77 4 124356 136765 3,04 29,36 32,29 96,58 5 123243 136253 3,04 29,09 32,17 101,26 6 124562 137432 3,04 29,41 32,45 100,17 29,29 99,21 RSD (%) 0.41 0.32 0.00 0.42 0.32 1.71
Kết quả khảo sát độđúng với Daucosterol TT S mẫu (mAU.s) S thêm (mAU.s) C thêm (µg/mL) C cũ (µg/mL) C mới (µg/mL) % tìm lại 1 6184 9030 1,36 3,06 4,42 99,97 2 6170 9034 1,36 3,06 4,43 100,58 3 6155 9052 1,36 3,05 4,43 101,75 4 6156 9065 1,36 3,05 4,44 102,16 5 6243 9153 1,36 3,09 4,48 102,19 6 6182 9082 1,36 3,06 4,45 101,85 3,06 101,42 RSD (%) 0.48 0.46 0.00 0.44 0.44 0.83 Kết quả khảo sát độđúng với Lupeol TT S mẫu (mAU.s) S thêm (mAU.s) C thêm (µg/mL) C cũ (µg/mL) C mới (µg/mL) % tìm lại 1 60352 75841 7,17 28,36 35,65 101,60 2 60367 75842 7,17 28,37 35,65 101,51 3 60454 75672 7,17 28,41 35,57 99,82 4 60356 75665 7,17 28,37 35,56 100,42 5 60243 75753 7,17 28,31 35,61 101,74 6 60862 76132 7,17 28,60 35,78 100,16 28,40 100,88 RSD (%) 0.33 0.21 0.00 0.33 0.20 0.76
Kết quả khảo sát độđúng với Stigmasterol TT S mẫu (mAU.s) S thêm (mAU.s) C thêm (µg/mL) C cũ (µg/mL) C mới (µg/mL) % tìm lại 1 6351 9130 1,92 4,36 6,27 99,41 2 6270 9134 1,92 4,31 6,27 102,43 3 6325 9172 1,92 4,35 6,30 101,83 4 6356 9165 1,92 4,37 6,30 100,46 5 6343 9153 1,92 4,36 6,29 100,48 6 6362 9132 1,92 4,37 6,27 99,07 4,35 100,61 RSD (%) 0.49 0.18 0.00 0.47 0.22 1.19 Kết quả khảo sát độđúng với Friedelin TT S mẫu (mAU.s) S thêm (mAU.s) C thêm (µg/mL) C cũ (µg/mL) C mới (µg/mL) % tìm lại 1 21501 27500 4,27 15,93 20,31 102,68 2 21470 27242 4,27 15,90 20,12 98,79 3 21454 27372 4,27 15,89 20,22 101,29 4 21356 27165 4,27 15,82 20,07 99,42 5 21243 27153 4,27 15,74 20,06 101,14 6 21262 26832 4,27 15,75 19,82 95,33 15,84 99,77 RSD (%) 0.47 0.76 0.00 0.47 0.76 2.37