Mẫu nghiên cứu là vỏ thân của cây Gạo (được làm khô tự nhiên) thu hái vào mùa hè tại Hương Sơn (Mỹ Đức, Hà Nội) và đã được TS. Trần Huy Thái (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh học) giám định tên khoa học là: Bombax malabaricum
DC., họ Gạo (Bombacaceae). 2.2. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
2.2.1. Hóa chất
- Hóa chất tinh khiết phân tích: acid formic.
- Dung môi loại dùng cho HPLC: methanol, acetonitril.
- Các hợp chất đã phân lập được từ vỏ thân cây Gạo là Lupeol, Friedelin, Stigmasterol, Epicatechin, Catechin, Daucosterol đã được tinh chế và nhận dạng cấu trúc bằng các phương pháp phổ MS và NMR.
2.2.2. Dụng cụ thiết bị
- Máy sắc ký lỏng khối phổ Shimadzu LC/MS 8030 có kết nối thêm detector SPD-20A (có khả năng phân tích UV-VIS trong vùng 190-700nm) của Trung tâm Kiểm nghiệm dược phẩm và mỹ phẩm Hà Nội.
- Cột sắc ký Zorbax C18 (250mm x 4,6mm; 5μm) kết hợp bảo vệ cột Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15×30mm ID).
- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45µm - Bộ sinh hàn hồi lưu và bình cầu
- Nồi đun cách thủy
- Pipet tựđộng 1000µl, 100µl và 10µl
- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống đong, ống ly tâm, phễu lọc, màng lọc…
- Máy li tâm Hettich của Đức
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Đánh giá tổng tạp có trong các mẫu hợp chất phân lập và tinh chế được bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích.
- Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp chất trong hỗn hợp 6 hợp chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong cao lỏng thân cây Gạo.
- Định tính các pic trên sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với MS kết nối.
- Thẩm định các điều kiện định lượng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích.
- Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lượng 6 hợp chất trên có trong mẫu thân cây Gạo đã thu hái được.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Chuẩn bị mẫu thử
2.4.1.1.Xác định độẩm của bột dược liệu
Vỏ thân sau khi sấy khô, nghiền thành bột khô. Lấy khoảng 2g bột mẫu nghiên cứu để xác định độẩm của dược liệu. Bật máy đo độẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110oC, rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình, đọc kết quả. Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
2.4.1.2.Chiết xuất
Qua thử nghiệm với nhiều biện pháp xử lý mẫu khác nhau, chúng tôi chọn phương pháp xử lý mẫu tương đối phù hợp như sau: cân khoảng 500g dược liệu vỏ cây (đã xác định độ ẩm trước) đã được làm nhỏ, ngâm lạnh 3 lần với methanol trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, thu dịch chiết, lọc, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Cân cắn toàn phần thu được và bảo quản cắn ở 4oC.
2.4.1.3. Tính hiệu suất chiết
theo công thức sau:
Trong đó: X: Hàm lượng (%)
M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g) x: Độẩm dược liệu (%)
a: Khối lượng cắn toàn phần thu được (g) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.1.4.Pha dung dịch thử
Dược liệu sau khi chiết, cất thu hồi dung môi tới cắn, cân chính xác khoảng 0,5000g cắn pha trong bình 25mL, sau đó lọc qua bông thủy tinh, sau đó qua màng lọc 0,45μm trước khi định tính và định lượng bằng HPLC.
2.4.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu
2.4.2.1.Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu phân lập được
Vì các hợp chất nghiên cứu đều tan tốt trong methanol nên methanol được chọn làm dung môi để pha dung dịch đối chiếu.
Các chất nghiên cứu được cân chính xác, hòa tan và định mức thành các dung dịch trong methanol, lọc qua màng lọc và tiêm vào hệ thống sắc ký.
Độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu được đánh giá qua tổng tạp có trong chúng sau khi được phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc. Tổng tạp của các hợp chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích.
2.4.2.2.Pha các dung dịch đối chiếu gốc
Cân chính xác một lượng từng chất nghiên cứu đã phân lập và tinh chếđược, cho vào bình định mức 25mL, thêm vừa đủ methanol, lắc đều cho tan hoàn toàn. Dung dịch này dùng để kiểm tra tổng tạp và được pha loãng thích hợp để xây dựng dãy dung dịch chuẩn.
2.4.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký
2.4.3.1.Cột sắc ký
Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết, định lượng một số thành phần có trong cây Gạo [11], [12], [13], tôi thấy các phương
pháp đều sử dụng sắc ký pha đảo. Hiện nay, sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng khá phổ biến với nhiều tính ưu việt. Do đó, tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này.
Sử dụng cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250mm × 4,6 mm; 5µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30mm ID).
2.4.3.2.Pha động
Là một trong những yếu tố quyết định thời gian lưu giữ các chất phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký.
Qua nghiên cứu tính chất lí hóa của các chất và nghiên cứu một số tài liệu tham khảo, các dung môi thường sử dụng là methanol, acetonitril, acid formic, nước. Tiến hành khảo sát với nhiều hệ dung môi khác nhau sao cho các pic của các hợp chất nghiên cứu được tách riêng rẽ với thời gian phân tích hợp lý.
2.4.4. Thẩm định phương pháp phân tích
2.4.4.1.Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống
Là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý xong.
Cách xác định: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic. Độ lặp lại của hệ thống được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD.
2.4.4.2. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác.
Trong HPLC, tính đặc hiệu thể hiện: Trên sắc ký đồ thu được từ mẫu trắng và các mẫu tự tạo, pic của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các pic tạp.
Tiến hành:
Chuẩn bị các mẫu sau: - Mẫu trắng
- Mẫu chuẩn pha trong MeOH - Mẫu thử pha trong MeOH
So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.
Yêu cầu: tại thời gian lưu của chất chuẩn không xuất hiện pic lạ trên mẫu trắng, mẫu nền.
2.4.4.3. Độ lặp lại của phương pháp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Độ lặp lại của một phương pháp pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất.
Độ lặp lại được biểu thị bằng giá trị RSD Tiến hành:
- Phân tích 1 mẫu 6 lần song song
- Xác định kết quảđịnh lượng theo đường chuẩn, tiến hành trong cùng điều kiện.
- Tính độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa giá trị của các lần định lượng.
2.4.4.4.Xác định khoảng nồng độ tuyến tính
Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích: là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định. Nó được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan r.
Cách xác định: khảo sát trên 1 dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên.
Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính.
Yêu cầu: Hệ số tương quan r > 0,995.
2.4.4.5.Độđúng
Là mức độ sát gần các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực. Cách xác định: Tiến hành pha 1 dung dịch chuẩn, 6 dung dịch thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Thêm vào một mẫu thử một lượng chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Độđúng sẽđược tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm được so với lượng chất chuẩn thêm vào.
Yêu cầu: Độ tìm lại: 95% -105%
2.4.4.6. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Xác định LOD và LOQ dựa vào tỷ lệđáp ứng so với nhiễu đường nền (S/N), tỉ lệ S/N được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng của mẫu trắng từđó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được.
Tiến hành: Pha loãng dung dịch chuẩn từ nồng độ ban đầu đến nồng độ thấp nhất có thể phát hiện được bằng sắc ký sao cho vẫn nằm trong khoảng tuyến tính.
- LOD được xác định bằng nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó cho các pic có tín hiệu bằng 3 lần nhiễu đường nền (S/N =3).
- LOQ là nồng độ chất phân tích tại đó có tín hiệu gấp 10 lần nhiễu đường nền (S/N = 10).
2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả sắc ký được xử lý bằng các phần mềm Chemstation của thiết bị HPLC.
Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel.
CHƯƠNG III - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. HÀM ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN
3.1.1. Hàm ẩm của dược liệu:
Lấy 3 mẫu ngẫu nhiên ở 3 vị trí khác nhau của mẫu dược liệu đem đo hàm ẩm bằng máy xác định độẩm Precisa XM 60. Kết quả thu được tại bảng 3.1.
Bảng 3.1. Độ ẩm bột dược liệu Thứ tự Khối lượng dược liệu (g) Độẩm (%) 1 2,5463 7,33 2 2,4698 7,81 3 2,5129 8,02 Trung bình 2,5096 7,72 3.1.2. Hiệu suất chiết - Khối lượng cắn toàn phần:
Cân 500,08g vỏ thân cây Gạo (có độẩm 7,72%) đã được làm nhỏ, ngâm lạnh 3 lần với methanol trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thu hồi dịch chiết, lọc, gộp dịch lọc được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Cắn được cô đến khối lượng không đổi, thu được 25,12g cắn toàn phần, đem bảo quản ở 4ºC.
- Hiệu suất chiết: trong đó: M = 500,08(g) x = 7,72% a = 25,12(g) Ö Hiệu suất X = 5,41% 3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký với cột hiện có là Cột Zorbax C18 (250mm × 4,6mm; 5µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30mm ID). Quá trình khảo sát tiến hành ở nhiệt độ phòng là 25ºC.
Sử dụng detector SPD-20A, chọn bước sóng phát hiện 280nm để dung hòa khả năng phát hiện của các hợp chất nghiên cứu.
Bắt đầu từ dùng hỗn hợp acetonitril và methanol có thêm acid formic 0,1% với các tỷ lệ khác nhau ở chế độđẳng dòng đều không cho khả năng tách cả 6 chất nghiên cứu hoặc thời gian phân tích quá dài. Do vậy chúng tôi phải sử dụng chếđộ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi thử nghiệm với một số chương trình dung môi khác nhau, tốc độ dòng và thể tích tiêm mẫu khác nhau, chúng tôi chọn lựa được một chương trình tương đối phù hợp đủ tách các chất nghiên cứu cũng như các pic khác trong mẫu nghiên cứu được chuẩn bị từ vỏ thân cây Gạo. Mặt khác thời gian phân tích không quá kéo dài, là 30 phút cho một lần tiêm mẫu. Điều kiện sắc ký chúng tôi xác định được với điều kiện cột sẵn có ở trên như sau:
Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol (B). Tỷ lệ kênh A-B ban đầu là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (40:60) ở phút thứ 6, rồi thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (50:50) ở phút thứ 23. Thay đổi tuyến tính về lại A–B (40:60) ở phút thứ 27 và cuối cùng pha động được thay đổi tuyến tính về tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu ở phút thứ 30.
Tốc độ dòng là 0,7 mL/phút và thể tích tiêm mẫu là 10μl.
Với điều kiện sắc ký như trên, các chất được tách hoàn toàn, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý. Các sắc ký đồ thu được nhưở hình 3.1 và hình 3.2.
Hình 3.1. Sắc ký đồ của hỗn hợp 6 chất nghiên cứu.
Hình 3.2. Sắc ký đồ của mẫu thử chuẩn bị từ vỏ thân cây Gạo.
Tiến hành sắc ký với từng hợp chất nghiên cứu (hình 3.3 đến hình 3.8) và so sánh với sắc ký đồ thu được của hỗn hợp 6 hợp chất là epicatechin, catechin, daucosterol, lupeol, stigmasterol và friedelin (hình 3.1) xác định được thời gian lưu của các chất lần lượt là 4,375; 5,411; 7,878; 11,356; 17,935 và 21,348 phút.
Như vậy, qua quá trình khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện sắc ký như sau để định lượng 6 chất: epicatechin, catechin, daucosterol, lupeol, stigmasterol và friedelin:
‐ Cột: Zorbax C18 (250mm × 4,6mm; 5µm) kết hợp cột bảo vệ Phenomenex C18 (ODS, Octadecyl; cartridge 15x30mm ID), nhiệt độ 25º.
‐ Pha động: Sử dụng chế độ gradient dung môi với kênh A là acid formic 0,1% trong acetonitril và kênh B là acid formic 0,1% trong methanol (B). Tỷ lệ kênh A-B ban đầu là (30:70), thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (40:60) ở phút thứ 6, rồi thay đổi tuyến tính đạt đến A–B (50:50) ở phút thứ 23. Thay đổi tuyến tính về lại A–B (40:60) ở phút thứ 27 và cuối cùng pha động được thay đổi tuyến tính về tỷ lệ A–B (30:70) ban đầu ở phút thứ 30.
‐ Detector SPD-20A với λ = 280nm.
‐ Tốc độ dòng: 0,7 mL/phút.
‐ Thể tích tiêm: 10μl.
3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU
Các chất nghiên cứu được cân chính xác và hòa tan thành các dung dịch trong methanol và tiêm vào hệ thống sắc ký.
Thực hiện chương trình sắc ký như mục 3.2, thu được sắc ký đồ của 6 hợp chất nhưở hình 3.3 đến hình 3.8.
Hình 3.3. Sắc ký đồ của epicatechin phân lập được từ vỏ thân cây Gạo.
Hình 3.4. Sắc ký đồ của catechin phân lập được từ vỏ thân cây Gạo.
Hình 3.6. Sắc ký đồ của lupeol phân lập được từ vỏ thân cây Gạo.
Hình 3.7. Sắc ký đồ của stigmasterol phân lập được từ vỏ thân cây Gạo.
Các sắc ký đồở các hình 3.3 đến hình 3.8 cho thấy cả 6 hợp chất đều không xuất hiện pic tạp chất (trong thời gian sắc ký là 30 phút) nên có thể sử dụng các hợp chất này làm nguyên liệu để thiết lập chất đối chiếu. Tuy nhiên do lượng các hợp chất phân lập được còn ít và chưa đủ thời gian cho phép để thiết lập chất chuẩn, do vậy chúng tôi tạm dùng chúng như chất đối chiếu để khảo sát phương pháp định lượng chúng trong vỏ thân cây Gạo.
3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ
Định tính bằng so sánh phổ khối lượng của các pic cùng thời gian lưu của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Phổ khối lượng nhận dạng các pic được đo ở chế độ: ESI+ với tốc độ khí phun là 3 L/phút, tốc độ khí làm khô là 15L/phút, nhiệt độ mao quản là 250oC, nhiệt độ của heat block là 400oC, vùng quét m/z là 100-1000. Thế phá mảnh +4,5kV.
Phổ khối lượng của các pic tương ứng thu được nhưở các hình 3.9-3.14.
Hình 3.9. Phổ khối lượng ứng với các pic của epicatechin trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu
.
Hình 3.10. Phổ khối lượng ứng với các pic của catechin trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.11. Phổ khối lượng ứng với các pic của daucosterol trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu.
Hình 3.12. Phổ khối lượng ứng với các pic của lupeol trên sắc ký đồ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.13. Phổ khối lượng ứng với các pic của stigmasterol trên sắc ký đồ của mẫu