Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ cỏ seo gà

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THỊ THANH MAI BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THỊ THANH MAI BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu Nơi thực hiện: Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dược và trang thiết bị y tế Quân đội HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ Cỏ seo gà”, ngoài sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bạn bè. Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu – Trưởng bộ môn Hóa phân tích và độc chất, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS. Nguyễn Duy Chí – Chủ nhiệm Khoa kiểm nghiệm Hóa học – Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dược và trang thiết bị y tế Quân đội, người đã rất nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến DS. Nguyễn Hải Đường và các anh chị Khoa kiểm nghiệm Hóa học, Khoa kiểm nghiệm Vật lý, Khoa nghiên cứu kiểm nghiệm Dược liệu cùng các cán bộ Viện kiểm nghiệm nghiên cứu Dược và trang thiết bị y tế Quân đội đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2014 Phan Thị Thanh Mai MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY CỎ SEO GÀ 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật 2 1.1.2. Thành phần hóa học 2 1.1.3. Tác dụng dược lý 4 1.1.4. Công dụng 5 1.2. MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ 5 1.2.1. Maltol-3-O-β-D-glucopyranosid 5 1.2.2. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-β-D-glucopyranosid 6 1.2.3. Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosid-7-O-[α-D-apiofuranosyl-(1-2)-β- D-glucopyranosid] 7 1.2.4. 3,4-dihydroxybenzandehyd 8 1.2.5. Kaempferitrin 9 1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 11 1.3.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng hiệu năng cao 11 1.3.2. Máy HPLC 11 1.3.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký 12 1.3.4. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC 13 1.3.5. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) 15 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 17 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2. Dung môi, hóa chất 17 2.1.3. Dụng cụ, thiết bị 17 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử 19 2.3.2. Chuẩn bị các chất đối chiếu 20 2.3.3. Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký 20 2.3.4. Thẩm định phương pháp phân tích 21 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24 3.1. ĐỘ ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN 24 3.1.1. Độ ẩm của dược liệu 24 3.1.2. Hiệu suất chiết cắn toàn phần 24 3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 25 3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký 25 3.2.2. Lựa chọn pha động 26 3.2.3. Lựa chọn tốc độ dòng 26 3.2.4. Lựa chọn bước sóng phát hiện 26 3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ NHẬN DẠNG CÁC PIC TRÊN SẮC KÝ ĐỒ CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CỎ SEO GÀ 29 3.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ SEO GÀ 33 3.4.1. Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký 33 3.4.2. Độ lặp lại của phương pháp 35 3.4.3. Khoảng nồng độ tuyến tính 37 3.4.4. Độ đúng 41 3.4.5. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 44 3.5. SƠ BỘ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG CỎ SEO GÀ 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47 KẾT LUẬN 47 ĐỀ XUẤT 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AEPM: Dịch chiết Cỏ seo gà (aqueous extracts of P.multifida Poiret) DAD: Detector mảng diod (Diod Array Detector) DMSO: Dimethyl sulfoxid HDL – Cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng cao mang Cholesterol (High Density Lipoprotein Cholesterol) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid Chromatographic) HPLC – MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (High-Performance Liquid Chromatographic – Mass Spectrometry) IR: Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) LDL – Cholesterol: Lipoprotein tỷ trọng thấp mang Cholesterol (Low Density Lipoprotein Cholesterol) LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Qualification) NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) S/N: Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise) SKĐ: Sắc ký đồ STT: Số thứ tự UV – VIS: Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet Visible) DANH MỤC BẢNG Danh mục các bảng Trang Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm bột dược liệu 24 Bảng 3.2. Một số thông số trên phổ DAD của các chất nghiên cứu 28 Bảng 3.3. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về thời gian lưu 33 Bảng 3.4. Sự phù hợp của hệ thống HPLC về diện tích pic 34 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM3 35 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM12 36 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM18 36 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM15 37 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ lặp lại với PM9 37 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM3 38 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM12 38 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM18 39 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM15 40 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của PM9 40 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với PM3 41 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng với PM12 42 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng với PM18 42 Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng với PM15 43 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ đúng với PM9 43 Bảng 3.20. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 5 hợp chất phân tích 44 Bảng 3.21. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (g/mL) 44 Bảng 3.22. Kết quả xác định nồng độ chất phân tích trong các dung dịch thử 45 Bảng 3.23. Kết quả xác định hàm lượng các chất có trong cây Cỏ seo gà 46 DANH MỤC HÌNH Danh mục các hình Trang Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC 11 Hình 1.2. Cấu tạo detector mảng diod (DAD) 15 Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu trên cột C18 dài 15 cm với các hệ dung môi khác nhau 25 Hình 3.2. Phổ DAD của các chất nghiên cứu 27 Hình 3.3. Phổ UV – VIS của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ seo gà 27 Hình 3.4. SKĐ của hỗn hợp 5 chất nghiên cứu 29 Hình 3.5. SKĐ của dịch chiết toàn phần cây Cỏ seo gà 29 Hình 3.6. SKĐ của hợp chất PM3 phân lập được từ Cỏ seo gà 30 Hình 3.7. SKĐ của hợp chất PM12 phân lập được từ Cỏ seo gà 30 Hình 3.8. SKĐ của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ seo gà 30 Hình 3.9. SKĐ của hợp chất PM15 phân lập được từ Cỏ seo gà 31 Hình 3.10. SKĐ của hợp chất PM9 phân lập được từ Cỏ seo gà 31 Hình 3.11. Kết quả so sánh phổ DAD của pic tương ứng với thời gian lưu của chuẩn và thử PM3 32 Hình 3.12. Kết quả chồng phổ DAD của pic một số chất nghiên cứu trên sắc ký đồ của hỗn hợp chuẩn và của mẫu thử 32 Hình 3.13. SKĐ của mẫu trắng 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, trên thế giới, nhu cầu về dược liệu, thuốc y học cổ truyền và hoạt chất chiết xuất từ dược liệu có xu hướng ngày càng tăng, nhất là ở các nước đang phát triển. Nền y học cổ truyền của nước ta có một lịch sử phát triển lâu đời và phong phú. Từ xa xưa ông cha ta đã biết sử dụng nguồn dược liệu quý để phòng bệnh và chữa bệnh. Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, từ những kinh nghiệm do nhu cầu của thực tiễn, số lượng cây, con được đưa vào làm thuốc ngày càng tăng. Cỏ seo gà, còn được gọi là Phượng vĩ, Phượng vĩ thảo, Cỏ luồng có tên khoa học là Pteris multifida Poir., họ Seo gà (Pteridaceae). Theo y học cổ truyền, Seo gà có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính lạnh, có tác dụng thanh nhiệt, lương huyết, lợi thấp, chỉ lỵ được dùng chữa kiết lỵ mạn tính, lỵ trực khuẩn, viêm ruột, viêm đường tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú, mụn nhọt, lở, ngứa, bệnh ngoài da, ung thư [3]. Tuy nhiên, cho đến nay có rất ít công trình khoa học nghiên cứu tổng thể về loài thực vật này. Năm 2012, NCS. Nguyễn Duy Chí đã nghiên cứu, phân lập được một số hợp chất từ Cỏ seo gà thu hái tại Ba Vì, Hà Nội. Để đánh giá tiềm năng và góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu, đề tài “Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ Cỏ seo gà” đã được thực hiện nhằm các mục tiêu: 1. Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất đã phân lập được từ cây Cỏ seo gà bằng phương pháp HPLC. 2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng các hợp chất trên trong mẫu Cỏ seo gà thu hái được. [...]... được phân lập và tinh chế để xác định cấu trúc Tổng tạp của các hợp chất được đánh giá theo phương pháp chuẩn hóa diện tích Nếu chất phân lập không bị lẫn các tạp chất khác, tạm bỏ qua hàm ẩm (vì khối lượng chất phân lập được rất ít) để coi hàm lượng của các chất phân lập là 100% trong xây dựng phương pháp định lượng 2.3.2.2 Pha các dung dịch đối chiếu gốc Cân chính xác một lượng từng chất nghiên cứu. .. định lượng một số hợp chất trên với chất đối chiếu là các chất phân lập được đã qua nhận dạng cấu trúc và xác định tổng tạp chất bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích  Áp dụng để sơ bộ xác định hàm lượng các hợp chất trên có trong mẫu cây Cỏ seo gà đã thu hái được 19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Chuẩn bị mẫu thử 2.3.1.1 Xác định độ ẩm của bột dược liệu Toàn cây Cỏ seo gà sau khi được làm khô tự... được khảo sát trong khoảng 0,8 1,2 mL/phút để xác định tốc độ dòng phù hợp cho một thời gian lưu tối ưu 2.3.3.4 Chọn bước sóng phát hiện Quét phổ UV – VIS của các hợp chất nghiên cứu để xác định cực đại hấp thụ của chúng, từ đó chọn bước sóng thích hợp nhất mà tại đó các chất phân tích đều có độ hấp thụ tương đối lớn 2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích Phép định lượng các hợp chất phân lập được từ. .. 2.3.3.1 Chọn cột sắc ký Hiện nay sắc ký phân bố pha đảo là phương pháp được sử dụng phổ biến với nhiều tính ưu việt Dựa trên tính chất của các hợp chất phân lập được từ cây Cỏ seo gà, đồng thời qua tham khảo tài liệu nghiên cứu về phương pháp tách chiết, định lượng một số thành phần trong cây Cỏ seo gà, chúng tôi đã lựa chọn sắc ký phân bố pha đảo trong nghiên cứu này Chúng tôi tiến hành khảo sát trên... methanol, định mức vừa đủ trong bình 20 50 mL, lọc qua màng lọc 0,45 m trước khi định tính và định lượng bằng HPLC 2.3.2 Chuẩn bị các chất đối chiếu 2.3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu phân lập được Các chất nghiên cứu được cân chính xác, hòa tan và định mức thành các dung dịch trong methanol, lọc qua màng lọc và tiêm vào hệ thống sắc ký Độ tinh khiết của các hợp chất nghiên cứu được. .. được bằng phương pháp chuẩn hóa diện tích để kiểm tra khả năng sử dụng chúng như các chất đối chiếu  Khảo sát các điều kiện sắc ký với HPLC để có thể tách hoàn toàn các hợp chất trong hỗn hợp các chất nghiên cứu với nhau và với các hợp chất khác trong dịch chiết cây Cỏ seo gà  Định tính các pic trên sắc ký đồ dựa vào thời gian lưu và kết hợp với quét phổ DAD  Thẩm định các điều kiện định lượng một. .. nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký: 14  Phương pháp chuẩn ngoại  Phương pháp chuẩn nội  Phương pháp thêm chuẩn  Phương pháp chuẩn hóa diện tích Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến... chất phân lập được từ Cỏ seo gà bằng phương pháp HPLC được thẩm định thông qua các chỉ tiêu:  Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký  Độ lặp lại của phương pháp  Độ tuyến tính và khoảng xác định  Độ đúng  Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 2.3.4.1 Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký Độ chính xác của hệ thống phân tích là độ chính xác của thiết bị, được xác định bằng cách đo lặp... hành định lượng để xác định hàm lượng của các chất trong mẫu thử và mẫu thử có thêm chất đối chiếu dựa trên phương trình đường chuẩn, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất đối chiếu tìm được so với lượng chất đối chiếu thêm vào Yêu cầu: Độ tìm lại: 95,0 – 105,0% 2.3.4.5 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ LOD là lượng chất thấp nhất của chất. .. nền 2.3.4.2 Độ lặp lại của phương pháp Độ lặp lại của một phương pháp phân tích (độ chính xác của tổng thể quy trình phân tích) là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác định bằng cách phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu nhưng các lần lặp lại phải được thực hiện từ công đoạn đầu tiên (cân, pha, xử lý . tài Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số hợp chất phân lập được từ Cỏ seo gà đã được thực hiện nhằm các mục tiêu: 1. Xây dựng được một quy trình định lượng. thời một số hợp chất đã phân lập được từ cây Cỏ seo gà bằng phương pháp HPLC. 2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng các hợp chất trên trong mẫu Cỏ seo gà thu hái được. . 3.7. SKĐ của hợp chất PM12 phân lập được từ Cỏ seo gà 30 Hình 3.8. SKĐ của hợp chất PM18 phân lập được từ Cỏ seo gà 30 Hình 3.9. SKĐ của hợp chất PM15 phân lập được từ Cỏ seo gà 31 Hình