Xây dựng phương pháp xác định dư lượng một số kháng sinh macrolid trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ

Trong những năm gần đây thì tại Việt Nam, số lượng và chủng loại kháng sinh được sản xuất ngày càng nhiều, trong đó nhóm kháng sinh macrolid là một trong những nhóm có số lượng sản xuất

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

một số kháng sinh macrolid trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ” đã hoàn thành Bên cạnh sự cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự khích lệ và giúp đỡ từ phía nhà trường, bộ môn, gia đình và bạn bè

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh,

người đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới DS Lê Xuân Kỳ, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới DS Dương Thị Vân, DS Nguyễn Thị Hạnh đã nhiệt

tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin gửi cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, Bộ môn Vật lý – Hóa lý – Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và những người luôn động viên, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày 11 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

VŨ ĐỨC HOÀN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2

1.1.1 Tổng quan về nhóm Macrolid 2

1.1.2 Tổng quan về Azithromycin 5

1.1.3 Tổng quan về Clarithromycin 6

1.1.4 Tình trạng đề kháng của vi khuẩn 7

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 9

1.2.1 Thiết bị khối phổ 10

1.2.2 Một số kỹ thuật ghi phổ 12

1.2.3 Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ 13

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC MACROLID 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Hoá chất – thuốc thử - chất chuẩn 16

2.2.2 Thiết bị - dụng cụ 16

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.3.1 Xây dựng, thẩm định phương pháp 17

2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 22

3.2.1 Độ lặp lại hệ thống 27

3.2.2 Độ đặc hiệu, độ chọn lọc 28

3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 29

3.2.4 Độ lặp lại của phương pháp 31

3.2.5 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 33

3.2.6 Độ đúng của phương pháp 34

3.2.7 Độ thu hồi 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

High performance liquid chromatography High performance liquid chromatography Tandem Mass Spectrometry

Mass Spectrometry Retention time Area under the peak Methanol

Limit of Detection Limit of Quantitation Low Quantitative Concentration Medium Quantitative Concentration High Quantitative Concentration Solid Phase Extraction

Recovery Standard Deviation Relative Standard Deviation

Tiếng Việt

Azithromycin Clarithromycin Detector chuỗi diod Cục bảo vệ môi trường Mỹ Chuẩn nội

Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

Khối phổ Thời gian lưu Diện tích pic Methanol Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Nồng độ định lượng thấp Nồng độ định lượng trung bình Nồng độ định lượng cao

Chiết pha rắn Hiệu suất thu hồi

Độ lệch chuẩn

Độ lệch chuẩn tương đối

Bảng 1.1: Một số kháng sinh nhóm Macrolid 4

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát điều kiện ion hóa 23

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát điều kiện bắn phá 23

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại hệ thống 27

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn 30

Bảng 3.5 Kết quả độ lặp lại ở nồng độ LQC 32

Bảng 3.6 Kết quả độ lặp lại ở nồng độ MQC 32

Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại ở nồng độ HQC 33

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng 35

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ thu hồi 35

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của một số vòng lacton 2

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử của Azithromycin 5

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Clarithromycin 6

Hình 1.4 Cấu tạo thiết bị khối phổ 11

Hình 3.1 Kết quả khảo sát ion hóa tạo ion mẹ của CLARI (a) và AZI (b) 24

Hình 3.2 Phổ đồ khảo sát ion con của các kháng sinh CLARI (a), AZI (b) và chất chuẩn nội CIPRO-13C3 (c) 24

Hình 3.3 Sắc ký đồ của tổng 3 chất (a) và sắc ký đồ từng mảnh ion sản phẩm của CLARI (b) và AZI (c) và chuẩn nội (d) 26

Hình 3.4 Sắc ký đồ của mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thêm chuẩn (c) 29

Hình 3.5 Đường chuẩn dung dịch Clarithromycin 30

Hình 3.6 Đường chuẩn dung dịch Azithromycin 31

Hình 3.7 Sắc ký đồ của CLARI (a) và AZI (b) tại giới hạn phát hiện của mỗi chất 34

ạt, thiếu kiểm soát dẫn tới tình trạng vi khuẩn kháng lại kháng sinh với mức độ ngày càng trầm trọng Dư lượng kháng sinh trong môi trường được đánh giá là một trong những nguyên nhân của tình trạng kháng thuốc này Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh được mối liên hệ giữa nồng độ dư lượng kháng sinh trong môi trường với khả năng đề kháng lại kháng sinh của vi khuẩn

Trong những năm gần đây thì tại Việt Nam, số lượng và chủng loại kháng sinh được sản xuất ngày càng nhiều, trong đó nhóm kháng sinh macrolid là một trong những nhóm có số lượng sản xuất và sử dụng rất lớn [2] Vì vậy trong quá trình sản xuất và sử dụng nhóm kháng sinh này thì vấn đề kiểm soát dư lượng kháng sinh thải ra môi trường cần phải được quan tâm đúng mức Điều này đòi hỏi phải xây dựng được một phương pháp định lượng có độ tin cậy để làm công cụ đánh giá Xuất phát từ những yêu cầu trên

chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng một số kháng sinh macrolid trong nước thải bằng sắc ký lỏng khối phổ” đề tài được thực

hiện với hai mục tiêu:

1 Lựa chọn các điều kiện và xây dựng qui trình định lượng đồng thời hai kháng sinh Clarithromycin và Azithromycin trong nước thải bằng phương pháp LC-MS/MS

2 Thẩm định phương pháp phân tích

1995 dirithromycin có mặt trên thị trường Các thuốc mới xuất hiện này có tiến bộ rõ rệt

so với erythromycin mặc dù giá đắt hơn [19]

1.1.1.1 Cấu trúc nhóm macrolid

Các macrolid là những kháng sinh có cấu trúc heterosia mà phần genin là một vòng lacton có chứa nhiều nguyên tử (thường từ 12-17 hoặc nhiều hơn) và được chia thành 2 nhóm chính: nhóm kháng khuẩn và nhóm kháng nấm hay còn gọi là các polyen

Nhóm macrolid kháng khuẩn bao gồm các macrolid có cấu trúc vòng lacton (chứa

từ 12-17 cấu tử - còn gọi là vòng esther) có chứa 1 hay nhiều đường (deoxy sugar) (thường là cladinose và desosamin)

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của một số vòng lacton

Phổ biến nhất trong nhóm này là các kháng sinh chứa vòng lacton 14 cấu tử bao gồm erythromycin, trocandomycin và roxithromycin Đây là những kháng sinh macrolid thế

Được xếp vào danh sách nhóm kháng sinh Macrolid thế hệ II còn bao gồm các chất

có cấu trúc vòng lacton 16 cấu tử như leucomycin, josamycin, spiramycin, tylosin, tylocicin Trong đó tylosin chủ yếu sử dụng trong thú y

Một số kháng sinh macrolid được xếp riêng vào nhóm các kháng sinh cấu trúc ketolid hay còn gọi là macrolid thế hệ III Điển hình cho nhóm này là telithromycin được bán tổng hợp từ erythromycin vào năm 1998

Nhóm kháng nấm (cấu trúc polyen): Có tài liệu xếp nystatin và amphotericin B vào nhóm kháng sinh đại lacton (chứa 26-38 carbon) có tác dụng chống nấm Trong nhiều năm, Amphotericin B là kháng sinh chống nấm toàn thân có hiệu quả cao tuy có độc tính cao Nystatin thường được sử dụng để điều trị bệnh do Candia albicans ở da, niêm mạc (miệng, đường tiêu hóa, âm đạo) và không có tác dụng khi nhiễm nấm toàn thân vì không hấp thụ qua đường tiêu hóa [3],[4]

1.1.1.2 Đặc điểm lý hóa tính

 Dạng base không thân nước, dễ tan trong nhiều dung môi hữu cơ, thuận lợi khi chiết xuất macrolid từ môi trường nuôi cấy vi sinh như chiết một alkaloid Muối với các acid tan trong nước nhưng dung dịch không bền, dễ kết tủa lại dạng base

 Tất cả các chế phẩm macrolid đều là bột màu trắng, vị rất đắng

 Vòng lacton lớn dễ bị mở trong môi trường pH, kiềm hoặc acid

 Macrolid tạo màu với một số thuốc thử: Acid HCl, H2SO4 đậm đặc, xanthydrol, p-dimethylamino benzaldehydyd Những phản ứng màu này được định tính, nhận biết

1954 Str.antibioticus Azithromycin

1953 Str.kitasatoensis Josamycin

1.1.1.3 Phổ tác dụng

 Vi khuẩn Gram (+): Tụ cầu, phế cầu, liên cầu, trực khuẩn than, bạch hầu

 Vi khuẩn Gram (-): Lậu cầu, màng não cầu

 Một số vi khuẩn yếm khí, Mycoplasma, Rickettsiae, Chlamydiae…

 Không nhạy cảm với phần lớn vi khuẩn gram (-), do kháng sinh khó thâm nhập vào nội bào vi khuẩn

 Với phổ tác dụng trên, kết hợp đặc tính phân bố, macrolid chỉ dùng để uống điều trị vi khuẩn gram (+), vi khuẩn yếm khí ở các cơ quan sâu trong cơ thể [3]

 Khối lượng phân tử: 748,98

 Tên khoa học: 10-deoxo-11-methyl-11-azaerythromycinA [3],[4]

1.1.2.2 Tính chất hóa lí

 Tính chất vật lý

 Dạng bột, màu trắng (hoặc trắng ngà), không mùi, vị đắng

 Không tan trong nước, dễ tan trong dung môi hữu cơ như: Ethanol, methanol, aceton, diethyl ether, chloroform và dung dịch acid hydrochloric

loãng

 Năng suất quay cực là từ -45o tới -49o (dung dịch 20mg/ml ethanol) [4]

 Tính chất hóa học

 Tính base: Do các osamin (đường amin) gây ra, pKa= 8,74

 Tạo muối dễ tan trong nước với các acid vô cơ và hữu cơ

 Phản ứng màu: với các acid như HCl, H2SO4 [3]

1.1.3 Tổng quan về Clarithromycin

1.1.3.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của Clarithromycin

 Công thức phân tử : C38H69NO13

 Khối lượng phân tử: 747,953

 Tên khoa học: (3R, 4S, 5S, 6R, 7R, 9R, 11S, 12R, 13S, {[(2S,3R,4S,6R)-4-(dimethylamino)-3-hydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy} -

14S)-6-14-ethyl-12,13-dihydroxy-4-{[(2R,4S,5S,6S)-5-hydroxy

-4-methoxy-4,6-oxacyclotetradecane-2,10-dione [3],[4]

dimethyloxan-2-yl]oxy}-7-methoxy-3,5,7,9,11,13-hexamethyl-1-1.1.3.2 Tính chất hóa lí

 Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng Không tan trong nước, tan trong aceton

và methylene clorid, khó tan trong methanol

 Góc quay cực từ -94o đến -102O, tính theo chế phẩm đã làm khô [3],[4]

1.1.4 Tình trạng đề kháng của vi khuẩn

Kháng sinh là những chất có nguồn gốc sinh học, tổng hợp hoặc bán tổng hợp mà ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách đặc hiệu.Việc khám phá và phát triển các kháng sinh đã tạo ra các thế hệ vũ khí hữu hiệu giúp con người chống lại vi khuẩn Tuy nhiên, việc nghiên cứu phát triển kháng sinh mới đang có xu hướng giảm theo thời gian: 1936 phát minh ra các sulfonamid, 1940 phát minh ra penicilin, 1949: tetracyclin, 1949: chloramphenicol, 1950: aminoglycosid, 1952: macrolid, 1958: glycopeptid, 1962: streptogramin và quinolon, 1999: oxazolidinon và đến 2003 mới phát minh thêm được các lipopeptid [20] Trong một hội nghị về chống nhiễm khuẩn tại Chicago năm 2004, các báo cáo đều cho rằng các hãng dược phẩm đang

có xu hướng từ bỏ cam kết triển khai thuốc kháng sinh mới Trong khi đó, tình hình kháng kháng sinh ngày càng gia tăng và đang là mối quan ngại của toàn cầu (tỷ lệ đề kháng cao của nhiều vi khuẩn với fluoroquinolon hay vấn đề phế cầu đa kháng kháng sinh tại châu Á hoặc nhiều vùng trên thế giới có tỷ lệ pneumococci đề kháng cao với nhiều kháng sinh ) [17]

Báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công bố ngày 30/4/2014 đã phác họa bức tranh toàn cảnh về kháng thuốc trong điều trị các bệnh nhiễm trùng cho đến nay, với dữ liệu thu thập từ 114 quốc gia, cho thấy mối đe dọa nghiêm trọng của tính kháng thuốc không còn là một dự đoán ở tương lai, mà là đang xảy ra và có khả năng ảnh hưởng đến

bất kỳ ai, với mọi lứa tuổi, ở bất cứ nơi nào trên thế giới Theo Trợ lý Tổng Giám đốc WHO, Tiến sĩ Keiji Fukuda, nếu không khẩn cấp phối hợp hành động, thì thế giới sẽ phải đối mặt với một kỷ nguyên hậu kháng sinh, khi đó các bệnh nhiễm trùng thông thường hoặc các vết thương nhẹ trước đây có thể chữa trị được thì nay có thể gây ra chết người do hiện tượng kháng thuốc; do đó, cần nỗ lực hơn nữa trong việc ngăn chặn nhiễm trùng, thay đổi cách sản xuất, quy định và sử dụng thuốc kháng sinh [24],[25]

Vấn đề vi khuẩn kháng kháng sinh cũng là một vấn đề nóng tại Việt Nam Hiện nay các kháng sinh “thế hệ một” gần như không còn được lựa chọn sử dụng Các kháng sinh thế hệ mới đắt tiền, thậm chí cả một số kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” cũng đang mất dần hiệu lực Theo báo cáo kết quả nghiên cứu ở 15 bệnh viện ở Hà Nội, TPHCM và Hải Phòng trong 2 năm (2008-2009) về tình trạng kháng thuốc kháng sinh,

có 4 chủng vi khuẩn thường gặp kháng kháng sinh là Acinetobacter spp, Pseudomonas

spp, E.coli, Klebsiella Hầu hết các kháng sinh thông thường như: penicillin, tetracyclin,

streptomycin… hay như kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ 3 đều đã xuất hiện các khuẩn kháng thuốc Sự kháng thuốc cao đặc biệt ở nhóm thuốc Cephalosporin thế hệ 3,

4 với tỷ lệ kháng từ 66 - 83%, tiếp theo là nhóm kháng sinh aminosid và floquinolon tỷ

lệ kháng xấp xỉ trên 60% Tỷ lệ kháng imipenem năm 2009 là 35%, tăng gần gấp đôi so với tỷ lệ này năm 2006 (18,4%) Tổng hợp các nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy:

 Ở Việt Nam, các chủng Streptococcus pneumoniae - một trong những nguyên

nhân thường gặp nhất gây nhiễm khuẩn hô hấp - kháng penicillin (71.4%) và kháng erythromycin (92.1%) - có tỉ lệ phổ biến cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 2000-2001

 75% các chủng pneumococci kháng với ba hoặc trên ba loại kháng sinh

 57% Haemophilus influenzae (một căn nguyên vi khuẩn phổ biến khác) kháng

với ampicillin

 Các vi khuẩn gram âm đa số là kháng kháng sinh (enterobacteriaceae): hơn 25%

số chủng phân lập tại một bệnh viện kháng với kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 (theo nghiên cứu năm 2000-2001) Theo báo cáo của một nghiên cứu khác năm 2009 cho thấy, 42% các chủng vi khuẩn gram âm kháng với ceftazidime, 63% kháng với gentamicin và 74% kháng với acid nalidixic tại cả bệnh viện và trong cộng đồng

 Xu hướng gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh cũng thể hiện rõ rệt Những

năm 1990, tại thành phố Hồ Chí Minh, chỉ có 8% các chủng pneumococcus kháng với

penicillin Đến năm 1999-2000, tỉ lệ này đã tăng lên 56% Xu hướng tương tự cũng được báo cáo tại các tỉnh phía bắc Việt Nam [2],[7]

Hiện nay vẫn chưa có một nghiên cứu đánh giá căn bản, toàn diện về nguyên nhân của tình trạng kháng thuốc và những biện pháp hữu hiệu để kiểm soát tình hình Một số nhóm nguyên nhân hàng đầu được cho là:

 Lạm dụng sử dụng kháng sinh, thiếu kiến thức về sử dụng kháng sinh hợp lý

 Thiếu cơ chế kiểm soát lượng kháng sinh tồn dư thải ra môi trường từ các nguồn: nước thải bệnh viện, nước thải từ các nhà máy sản xuất dược phẩm và thú y Nguồn chất thải này chứa một lượng đáng kể kháng sinh lâu ngày không bị phân hủy sẽ làm tăng khả năng chống chịu của vi khuẩn, gây đột biến gen tạo ra các chủng kháng thuốc

 Kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi, trồng trọt và chế biến thủy hải sản Không kiểm soát được nồng độ tồn dư dẫn đến một loạt kháng sinh chưa qua chuyển hóa từ các ngành này thải ra môi trường gây biến đổi đáp ứng của vi sinh vật

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry) là một phương pháp phân tích dụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất Phương pháp này nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định

Trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-) Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn [1],[6],[11]

1.2.1 Thiết bị khối phổ

Một khối phổ kế bao gồm các bộ phận chính như sau:

 Bộ nạp mẫu (Inlet): có nhiệm vụ đưa mẫu vào máy Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc

dạng rắn cần phải chuyển sang dạng hơi bằng các phương pháp thích hợp Có hai kiểu nạp mẫu: nạp mẫu trực tiếp và nạp mẫu gián tiếp (bộ nạp mẫu là đầu ra của một thiết bị phân tích khác được kết nối với khối phổ như GC/MS hay LC/MS)

 Bộ nguồn ion hóa (Ion source): tại đây các phân tử ở trạng thái hơi bị bắn phá tạo

ra ion phân tử hoặc các ion mảnh, mỗi ion có khối lượng m và điện tích z nhất định Tỷ

số m/z (hay còn gọi là số khối) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Đây là một thông số rất quan trọng trong định tính cũng như định lượng

 Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ

được gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để

đi đến bộ phận phát hiện

 Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại

thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

 Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)

Hình 1.4 Cấu tạo thiết bị khối phổ

Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa

hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu

dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt, bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục … đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80 nhờ kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API) mới tạo ra bước đột phá thật sự cho phương pháp LC-MS/MS

Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC-MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (Continuous Flow- Fast Atom Bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (Thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC-MS:

 Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI)

 Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI)

 Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photon Ionization – APPI)

Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả [1],[6],[11]

1.2.2 Một số kỹ thuật ghi phổ

Trong phân tích khối phổ việc xác định chính xác 1 ion rất quan trọng cho việc xác định được hợp chất cần phân tích Một hợp chất xác định trong những điều kiện nhất định sẽ cho 1 ion có số khối xác định trên phổ đồ Tuy nhiên, một ion có số khối xác định trên phổ đồ lại có thể xuất phát từ nhiều hợp chất khác nhau vì vậy trong phân tích một hỗn hợp hoặc lẫn nhiều tạp chất nếu điều kiện sắc ký chưa đảm bảo việc phân tách thì việc nhận định các ion thông qua số khối tên phổ đồ có thể bị ảnh hưởng Đối với trường hợp này khối phổ 1 lần (MS) có thể cho kết quả không chính xác so với kỹ thuật khối phổ nhiều lần (2 lần MS/MS)

 Quét toàn phổ (Full Scan)

Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất

 Selected Ion Monitoring (SIM)

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó,

do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn Đối với đầu

dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

 SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM

 SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện [1],[6],[11]

1.2.3 Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ

Đặc tính nổi bật của LC-MS là tính chọn lọc và độ nhạy cao Vì vậy mà khối phổ thường được sử dụng để xác định lượng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp như định tính, định lượng thuốc và các dạng chuyển hóa trong dịch sinh học, độc chất học, định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm,

mỹ phẩm, dược liệu, thủy hải sản và môi trường Ngoài ra phương pháp khối phổ còn có thể được sử dụng để xác định mức độ tinh khiết của chất chuẩn hoặc mẫu chuẩn cần phân tích

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC MACROLID

Nghiên cứu của Taninaka Cvà cộng sự (2000) xác định nồng độ của erythromycin (EM), Roxithromycin (RXM), và azithromycin (AZM) trong huyết tương chuột bằng HPLC với phát hiện amperometric sử dụng clarithromycin (CLARI) là một chất chuẩn nội Mỗi loại thuốc được chiết xuất từ 150 microl mẫu huyết tương tăng vọt với chất chuẩn nội dưới môi trường kiềm với tert-butyl methyl ether Điện thế thiết lập cho

detector của tế bào quang điện dùng cho quá trình oxi hóa của thuốc được thiết lập ở mức 950mV Độ tuyến tính của đường chuẩn được lưu giữ trên các khoảng nồng độ 0,1-

10 mg/ml cho EM và RXM, và 0,03-3,0 mg/ml cho CLARI và AZM Hệ số biến đổi và sai số tương đối ít hơn 9% và +/- 7% Phương pháp phân tích được chứng minh là có ích trong việc xác định các đặc tính dược động học của EM, CLARI, RXM, và AZM ở chuột [22]

Trong đề tài nghiên cứu về dư lượng kháng sinh macrolids, sulfonamids và trimethoprim ở lưu vực sông Mê Kông, Satoshi Managaki và cộng sự đã sử dụng phương pháp LC/MS/MS với cột sắc ký YMC pro C18 (3 µm, 150 mm × 2 mm), pha động là hệ: Dung dịch acid formic 1% - MeOH (1 % acid formic) chạy gradient, với tốc độ dòng là 0,15 ml/phút Mẫu nước sông được xử lý bằng kỹ thuật chiết pha rắn với cột Oasis HLB (200mg, Water) Giới hạn định lượng của phương pháp là từ 0,1 – 1,2 ng/ml [21] Nghiên cứu của Chen BM và cộng sự (2006) đã xác định hàm lượng azithromycin trong huyết tương người bằng HPLC-MS và ứng dụng của nó trong một nghiên cứu tương đương sinh học Azithromycin trong huyết tương (0.2mL) được chiết xuất với metyl tert-butyl ether-hexane (50:50, v/v), pha hữu cơ được chuyển đến 1 ống 1.5mL Eppendorf đã làm sạch và bốc hơi đến khô ở 40oC và hòa tan trong pha động, các mẫu được tách ra bằng cách sử dụng dụng cụ Hypersil C18 giai đoạn đảo ngược cột (150mmx2.1mm id, 5microm), cùng với một pha động là 20mm ammonium acetate (pH 5.2) -acetonitrile-methanol (50:40:10, v/v/v) và được đẳng dòng tách rửa với một tốc độ dòng chảy 0.2mL/phút Azithromycin và chất chuẩn nội của mình, clarithromycin, được

đo bởi nguồn ion phun điện tử trong chế độ theo dõi ion dương có chọn lọc Phương pháp này đã chứng minh rằng độ tuyến tính tốt dao động từ 2 đến 1000ng/mL với r = 0,9977 Các giới hạn định lượng cho azithromycin trong huyết tương là 2ng/ml với độ chính xác cao Việc thu hồi chiết xuất trung bình cao hơn, với 81,2% và 75,5% đối với azithromycin và chất chuẩn nội.Độ chính xác trong ngày và giữa các ngày nằm trong khoảng từ 4,8% đến 8,6% và 6,4% đến 10,7% (RSD) Phương pháp thành lập đã được

áp dụng thành công để nghiên cứu tương đương sinh học của 2 công thức azithromycin cho 24 tình nguyện viên khỏe mạnh [13]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Mẫu trắng: mẫu nước thải không chứa kháng sinh nghiên cứu lấy tại bể nước thải thứ cấp của Xí nghiệp dược phẩm TW2

- Các kháng sinh clarithromycin và azithromycin

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hoá chất – thuốc thử - chất chuẩn

Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu:

 Thuốc thử, dung môi sử dụng trong nghiên cứu:

- Methanol, Acid formic, Acetonitril, Na2EDTA (Merck-Đức)

- Nước cất hai lần

- Acid hydroclorid (tinh khiết phân tích)

2.2.2 Thiết bị - dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ tại Viện công nghệ Dược phẩm Quốc gia:

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Technologies 6460 Triple Quad LC/MS, Mỹ

- Cột Agilent SB C18 1,8µm, 2,1×50mm, Mỹ

- Bộ chiết pha rắn LiChrolut, Đức

- Cột chiết pha rắn OASIS HLB Cartridge 200 mg, 6ml, Oasis (Mỹ)

- Thiết bị siêu âm Ultrasonic Cleaner Set, Hàn Quốc