2.3.1. Xây dựng, thẩm định phương pháp
2.3.1.1. Phương pháp thu thập, xử lý mẫu thải trước khi tiến hành chiết tách
- Mẫu nước thải không chứa kháng sinh nghiên cứu lấy tại bể nước thải thứ cấp của Xí nghiệp dược phẩm TW2 đựng trong chai thủy tinh màu nâu,tránh ánh sáng.
- Bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2 - 8oC.
- Mẫu sau khi lấy được xử lý bằng cách: lọc nhiều lần qua giấy lọc, màng lọc thủy tinh, màng lọc 0,45µm, acid hóa đến pH 2 bằng HCl 10%, loại kim loại nặng bằng Na2EDTA.
2.3.1.2. Phương pháp chiết tách kháng sinh macrolid từ nước thải
Do mẫu có tính chất phức tạp và lượng chất phân tích trong mẫu (nếu có) rất nhỏ, lựa chọn phương pháp chiết pha rắn. Để tìm được quy trình tối ưu chiết tách và làm giàu mẫu với các kháng sinh macrolid nghiên cứu:
- Loại cột chiết sử dụng: Cột chiết pha rắn OASIS HLB Cartridge 200 mg, 6ml(Mỹ) - Hoạt hóa cột với các dung môi: 10 ml MeOH, 5 ml H2O và 5ml H2O pH = 2,0 (acid hóa nước bằng HCl 10%) theo thứ tự để chuyển pha rắn sang trạng thái có thể lưu giữ chất phân tích trong mẫu.
- Nạp mẫu bằng cách cho 100ml dung dịch mẫu qua cột với tốc độ dòng 5 -10 ml phút.
- Rửa cột bằng 10ml H2O rồi làm khô cột.
- Rửa giải: dùng 10 ml MeOH với tốc độ dòng 5-10ml/phút rửa chất phân tích ra khỏi cột pha rắn.
- Lấy dịch chiết tiến hành làm khô bằng khí N2 đến khi thu được cắn. Hòa tan cắn trong vừa đủ 1ml MeOH rồi đem đi định lượng.
2.3.1.3. Lựa chọn các điều kiện sắc ký lỏng khối phổ
Xây dựng quy trình phân tích sao cho có thể sử dụng định lượng đồng thời các kháng sinh nghiên cứu và một số kháng sinh macrolid khác. Tiến hành khảo sát để lựa chọn các điều kiện sau đây:
Khảo sát điều kiện khối phổ: + Nguồn ion hóa.
+ Điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con. + Lựa chọn ion con để định lượng, định tính. + Tốc độ khí phun
+ Tốc độ khí làm khô Khảo sát điều kiện sắc ký:
+ Pha tĩnh (Cột sắc ký) + Pha động
+ Thể tích tiêm mẫu
+ Lựa chọn chất chuẩn nội.
2.3.1.4. Đánh giá quy trình phân tích
Phương pháp được thẩm định các tiêu chí theo hướng dẫn của AOAC bao gồm : Độ lặp lại của hệ thống: Đánh giá độ lặp lại của hệ thống về thời gian lưu và
diện tích pic khi tiêm lặp lại 1 mẫu chuẩn 6 lần liên tiếp, ghi lại sắc ký đồ và diện tích pic.
Giá trị RSD của tỷ số diện tích pic mỗi kháng sinh và chất chuẩn nội
< 2%.
Độ đặc hiệu, độ chọn lọc: được đánh giá trên mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn. Trên sắc ký đồ, mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu chuẩn nội; nếu có đáp ứng pic phải < 1% so với nồng độ giữa của khoảng tuyến tính. Mẫu thêm chuẩn (dịch chiết qua cột của mẫu chuẩn được thêm một lượng chất phân tích vào) phải cho tín hiệu của chất phân tích trùng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn nhưng với cường độ tín hiệu đáp ứng lớn hơn
Độ tuyến tính: Xây dựng đường chuẩn ít nhất 5 điểm của dung dịch có chứa chất
chuẩn CLARI (hoặc AZI) ở trong khoảng nồng độ phù hợp và chất chuẩn nội ở một nồng độ nhất định.
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Tiêm 3 lần mỗi mẫu. Tính giá trị trung bình.
Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa tỉ lệ diện tích kháng sinh/diện tích píc của chuẩn nội với nồng độ kháng sinh tương ứng và từ đó tính hệ số tương quan r.
Độ đúng của phương pháp: Mẫu trắng xử lí qua cột thu được nền mẫu. Thêm
chính xác một lượng kháng sinh đã biết trước nồng độ. Tiến hành sắc ký và tìm lại nồng độ ban đầu.
Độ lặp lại: đánh giá thông qua giá trị RSD thu được khi phân tích 6 mẫu khác
nhau của một nồng độ. Lựa chọn 3 nồng độ chất chuẩn thêm vào để khảo sát là nồng độ thấp (LQC), nồng độ trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC). Tiến hành xử lý mẫu và sắc ký theo các điều kiện đã chọn.
Yêu cầu: Theo AOAC [12]:
+ Nồng độ từ 100 – 1000 ng/ml: RSD ≤ 15%. + Nồng độ từ 10 – 100 ng/ml: RSD ≤ 21%.
Độ thu hồi: Sử dụng mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ xác định rồi tiến hành chiết
qua cột. Tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã thiết lập.Tính nồng độ kháng sinh còn lại.Độ thu hồi được tính theo công thức:
R = (Ctt /Clt) x 100%
Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn định lượng được tính dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc của đường tuyến tính. LOD được tính theo công thức:
3,3×S LOD=
a
Trong đó: S là độ lệch chuẩn của đáp ứng (intercept) và a là hệ số góc của đường chuẩn.
Từ kết quả đường chuẩn xác định độ tuyến tính, tính toán được giá trị LOD.
Từ kết quả tính toán LOD, pha 3 mẫu tự tạo có nồng độ xấp xỉ bằng LOD tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký theo chương trình đã khảo sát. Ghi lại sắc ký đồ và kết luận.
LOQ được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp. LOQ được tính toán tính theo công thức:
𝐿𝑂𝑄 = 𝐿𝑂𝐷 × 3,3
2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu
- Phần mềm Microsoft Excel để tính toán và xử lý thống kê.
Một số công thức tính các giá trị thống kê: Giá trị trung bình 𝑥̅ = 1
n × ∑𝑛𝑖=1𝑥𝑖
Độ lệch chuẩn (SD) SD = √∑𝑛𝑖=1(𝑥𝑖− 𝑥̅)2 𝑛−1
Độ lệch chuẩn tương đối RSD = 𝑆𝐷
Trong đó: xi là kết quả ở lần xác định thứ i. n là số lần xác định.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ
3.1.1. Khảo sát các điều kiện khối phổ
Để phân tích dư lượng kháng sinh bằng sắc ký lỏng khối phổ tứ cực chập ba cần phải xác định được ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con). Với kỹ thuật ion hóa ESI, chế độ ion dương, các ion phân tử thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+, một số trường hợp thêm hai proton [M-2H]++. Tuy nhiên để định tính và định lượng thì cần phải xác định được ít nhất 2 ion sản phẩm, trong đó có một ion sản phẩm dùng để định lượng và một ion sản phẩm dùng để định tính.
Tiến hành tiêm 3 l các chất chuẩn kháng sinh có nồng độ khoảng 5 g/ml vào máy khối phổ thông qua hệ thống LC với hệ dung môi pha động là MeOH (0,1% acid formic) : H2O (0,1% acid formic) tỉ lệ 60:40, tốc độ dòng 0,3 ml/ph, chạy ở chế độ MS2Scan để tìm ion phân tử. Ở chế độ chạy MS2Scan thì ion phân tử thường cho cường độ tín hiệu lớn nhất, có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z=M+1) nếu ion phân tử ở dạng [M-H]+ hoặc ion phân tử có số khối M+2
m/z=
2 nếu ion phân tử ở dạng [M-2H]
++
Sau khi lựa chọn được ion phân tử, chuyển sang chế độ chạy Product Ion để khảo sát các điều kiện bắn phá ion mẹ xác định hai ion con. Ion con có cường độ tín hiệu lớn và ổn định hơn được sử dụng làm ion định lượng, ion còn lại được dùng cho mục đích xác nhận (khẳng định). Các thông số bắn phá như năng lượng va chạm (CE), thế phân mảnh Fragmentor (Frag), Cell Accelerator Voltage (CAV) được khảo sát lựa chọn giá trị tối ưu dựa trên tỉ lệ tín hiệu ion con định lượng/ion mẹ > 9/1.
Kết quả khảo sát các điều kiện khối phổ được thể hiện ở các bảng 3.1, 3.2 và hình 3.1, 3.2.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát điều kiện ion hóa
Thông số (đơn vị) Giá trị tối ưu
Nhiệt độ khí phun (oC) 300
Tốc độ khí phun (l/min) 11
Áp suất đầu phun (psi) 15
Thế nguồn ion hóa (V) 4000
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát điều kiện bắn phá
S T T Tên chất Khối lượng phân tử Ion mẹ (m/z)
Ion con (m/z) Điều kiện bắn phá
Định lượng Xác nhận CE (V) Frag (V) CAV (V) Scan time (ms) Dwell (ms) 1 CLARI 747,4 748,3 158,0 590,2 20 135 7 500 200 2 AZI 748,4 375,3 591,3 158,0 13 135 7 500 200 3 CIPRO 335,3 336,1 318,0 291,0 19 110 7 500 50 (a)
(b)
Hình 3.1. Kết quả khảo sát ion hóa tạo ion mẹ của CLARI (a) và AZI (b)
(a)
(b)
(c)
Hình 3.2. Phổ đồ khảo sát ion con của các kháng sinh CLARI (a), AZI (b) và
chất chuẩn nội CIPRO-13C3 (c)
Nhận xét: Quá trình ion hóa tạo ion mẹ ở hình (a) ta thấy CLARI chủ yếu tạo thành ion
có m/z=158 cho tín hiệu lớn nhất và ổn định được lựa chọn làm ion định lượng. Kết quả này phù hợp với hướng dẫn của EPA [23], cũng như các tài liệu đã công bố trước đây [16] [21] . Còn kết quả khảo sát AZI cho thấy kháng sinh này luôn cho 2 ion mẹ có m/z lần lượt là 375,2 và 749,3 tương ứng với sự hình thành 2 dạng ion mẹ [M-2H]++ và [M- H]+, theo hướng dẫn của EPA thì cặp ion mẹ/con dùng cho định lượng AZI là 749,9/591,6. Tuy nhiên qua khảo sát thực tế cho thấy ion mẹ m/z=375,3 luôn cho cường độ tín hiệu lớn hơn nên chúng tôi đã chọn ion này cho mục đích bắn phá tiếp theo để khảo sát hình thành ion con. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả mà một số tác giả đã công bố. Quá trình ion hóa của AZI luôn cho 2 ion mẹ và chỉ 1 ion mẹ được lựa chọn cho mục đích định lượng nên độ đáp ứng tín hiệu sẽ thấp hơn so với CLARI ở cùng nồng độ phân tích.
3.1.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký
Pha tĩnh: Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn cột pha đảo RRHD SB-C18,
2,1x50mm, 1,8m, 1200 bar của Agilent-Mỹ để tách các kháng sinh. Trong LC-MS/MS do bộ phận MS có khả năng tách và nhận biết các chất theo tỉ số khối lượng trên điện tích (m/z) nên hiệu quả tách tín hiệu của hỗn hợp vẫn đạt yêu cầu ngay cả khi các chất không tách nhau ra khỏi cột sắc ký. Hình 3.3 minh họa sắc ký đồ của 2 kháng sinh và chất chuẩn nội, mặc dù có thời gian lưu gần nhau nhưng AZI và chất chuẩn nội vẫn được tách hoàn toàn nhờ khối phổ
Hình 3.3. Sắc ký đồ của tổng 3 chất (a) và sắc ký đồ từng mảnh ion sản phẩm của
CLARI (b) và AZI (c) và chuẩn nội (d)
Pha động: Pha động trong LC-MS/MS không chỉ có vai trò phân tách các chất
mà còn tác động đến quá trình ion hóa do đó ảnh hưởng đến tín hiệu chất phân tích. Với kỹ thuật ESI(+) thì sự ion hóa tăng lên khi trong thành phần pha động có thêm các chất cung cấp proton như: HCOOH, CH3COOH. Tham khảo một số tài liệu trước đây và theo hướng dẫn của EPA chúng tôi lựa chọn khảo sát 3 dung môi là nước, acetonitril và methanol có thêm HCOOH để tách các kháng sinh trong nước thải.
Kết quả khảo sát đã lựa chọn được các điều kiện sắc ký như sau:
Cột phân tích: RRHD SB-C18, 2,1x50mm, 1,8m, 1200 bar (Agilent) Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
Pha động: MeOH (0,1% acid formic) : H2O (0,1% acid formic) tỉ lệ 60:40 Tốc độ dòng: 0,3 ml/ph Thể tích tiêm: 3µl (a) (b) (c) (d)
3.2.THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 3.2.1. Độ lặp lại hệ thống
Từ dung dịch chuẩn gốc CLA và AZI và dung dịch chuẩn nội, tiến hành pha để có dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa đồng thời hai kháng sinh CLARI, AZI và chuẩn nội có nồng độ lần lượt là 61,6 ng/ml, 54,4 ng/ml và 5,0 ng/ml. Tiến hành sắc ký mẫu này 6 lần liên tiếp theo điều kiện sắc ký đã chọn để khảo sát độ lặp lại của hệ thống sắc ký. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại hệ thống
STT CIPRO- 13C3 CLARI AZI SIS tR (ph) Spic tR (ph) Spic/SIS Spic tR (ph) Spic/SIS 1 200 0,681 20446 1,785 102,230 2218 0,670 11,090 2 197 0,680 20475 1,786 103,934 2212 0,672 11,228 3 207 0,682 20548 1,788 99,266 2246 0,673 10,850 4 203 0,671 20596 1,791 101,458 2223 0,669 10,951 5 199 0,689 20560 1,786 103,317 2234 0,674 11,226 6 201 0,684 20307 1,797 101,030 2232 0,669 11,194 TB 0,681 20488,7 1,789 102,040 2227,5 0,671 11,069 SD 0,060 105,01 0,004 1,827 12,292 0,002 0,167 RSD(%) 0,868 0,513 0,231 1,786 0,552 0,318 1,514
Nhận xét: Kết quả cho thấy giá trị RSD của thời gian lưu của chuẩn nội, CLARI và AZI
tích píc của mỗi kháng sinh và chuẩn nội < 2%. Như vậy, hệ thống đạt yêu cầu để phân tích định lượng các kháng sinh CLARI và AZI trong nước thải.
3.2.2. Độ đặc hiệu, độ chọn lọc
Tính đặc hiệu thể hiện khả năng phân biệt rõ chất phân tích khi có mặt các thành phần khác có trong nền mẫu, trong khi tính chọn lọc thể hiện khả năng phân biệt các chất phân tích với nhau. Để khảo sát tính đặc hiệu và tính chọn lọc chúng tôi tiến hành trên mẫu trắng (mẫu nước thải không có kháng sinh), mẫu chuẩn (mẫu trắng cho thêm chất phân tích) và mẫu thêm chuẩn. Tiến hành cho mẫu trắng và mẫu chuẩn chiết qua cột, dịch chiết thu được tiến hành chạy sắc ký theo các điều kiện đã chọn. Theo yêu cầu mẫu trắng phải không được cho tín hiệu của chất phân tích tại thời gian lưu trùng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn. Mẫu thêm chuẩn (dịch chiết qua cột của mẫu chuẩn được thêm một lượng chất phân tích vào) phải cho tín hiệu của chất phân tích trùng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn nhưng với cường độ tín hiệu đáp ứng lớn hơn. Hình 3.4 giới thiệu sắc ký đồ của mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thêm chuẩn (c)
(b) (c)
Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thêm chuẩn (c)
Ngoài ra đối với phương pháp sắc ký lỏng khối phổ thì mỗi chất phân tích đều có hai ion con dùng để định tính và định lượng. Do đó độ đặc hiệu còn được chắc chắn nhờ sự có mặt của ion con này.
3.2.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Chúng tôi đã khảo sát khoảng tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic của chất phân tích và chuẩn nội và nồng độ chất phân tích, cụ thể tiến hành như sau:
- Mẫu trắng được chiết qua cột theo qui trình thu được dịch chiết làm nền mẫu trắng - Pha dung dịch chuẩn các kháng sinh trên nền mẫu trắng ở các nồng độ trong khoảng từ 2 ng/ml đến 240 ng/ml. Nồng độ chuẩn nội được giữ cố định là 5,0 ng/ml.
- Tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã chọn. Xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỉ lệ diện tích píc kháng sinh với chất chuẩn nội và nồng độ kháng sinh tương ứng.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính và đường chuẩn STT Tên KS Nồng độ thực (ng/ml) Diện tích píc Tỉ lệ SKS/Si Kết quả SKS/Si Si 1 CLARI 2,46 715 200 3,57 Phương trình hồi quy : y=1,5333x + 2,0882. r= 0,9997 6,16 2042 218 9,37 12,32 4252 203 20,95 24,64 9537 213 44,77 243,94 74765 199 375,70 2 AZI 2,22 175 200 0,88 Phương trình hồi quy : y=0,3945x +0,6131. r=0,9996 5,54 495 218 2,27 11,08 1036 203 5,10 22,16 2231 213 10,47 219,38 17323 199 87,05
Hình 3.5. Đường chuẩn dung dịch Clarithromycin
y = 1,5333x + 2,0882 r = 0,9997 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 50 100 150 200 250 300 Peak ra tio Concentration of Clarithromycin (ng/ml) Đường chuẩn Clarithromycin
Hình 3.6. Đường chuẩn dung dịch Azithromycin
Nhận xét: Các đường tuyến tính đều có hệ số tương quan trên 0,99 do đó trong khoảng
nồng độ từ 2,5 ng/ml đến 244 ng/ml (đối với CLARI) và từ 2,2 ng/ml đến 219 ng/ml (đối với AZI) có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỉ lệ diện tích píc và nồng độ tương ứng. Đối với các nồng độ cao hơn thì tiến hành pha loãng mẫu trước khi định lượng.