Xây dựng quy trình xác định dư lượng một số chất nhóm quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC MS và MS

Mặc dù các điều kiện sắc ký tương đối mở rộng cho các nhà phân tích, nhưng không phải lúc nào cũng có thể thực hiện được quá trình tách tất cả các cấu tử của một hỗn hợp mẫu và điều này

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ LUYẾN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH

DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM QUINOLON TRONG THỰC PHẨM BẰNG

KỸ THUẬT LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ LUYẾN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH

DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT NHÓM QUINOLON TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ về mọi mặt từ các thầy cô, đồng nghiệp, gia đình và bạn bè

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Nguyễn Tường Vy – Phó Trưởng Phòng SĐH- ĐH Dược Hà Nội Th.S NCS Cao Công Khánh – Viện KN ATVSTPQG

đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài này Đồng thời tôi xin cảm ơn các cán bộ Viện Kiểm Nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã luôn sẵn lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 08 năm 2014 Tác giả

Bùi Thị Luyến

MỤC LỤC

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

Đặt vấn đề 1

Chương 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Vài nét về Quinolon 3

1.1.1 Cấu tạo chung 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Cơ chế tác dụng 3

1.1.4 Tác dụng phụ 3

1.1.5 Đặc tính của các quinolon nghiên cứu 4

1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký .5

1.3 Nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm 12

1.3.1 Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi .12

1.3.2 Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở trong nước .13

1.3.3 Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở ngoài nước 14

1.3.4 Một số quy định về giới hạn tồn dư quinolon trong thực phẩm 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu của đề tài 20

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 20

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 20

2.2.2 Thuốc thử, hóa chất 20

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Nghiên cứu các điều kiện LC-MS/MS 20

2.3.2 Nghiên cứu và lựa chọn quy trình xử lý mẫu 22

2.3.3 Thẩm định lại phương pháp đã xây dựng 24

2.3.4 Thực nghiệm xác định quinolon trên mẫu thịt, cá .24

2.4 Tính toán kết quả, xử lí số liệu 25

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả khảo sát và lựa chọn các thông số cho LC-MS 27

3.1.1 Xác định các thông số của detector khối phổ (MS 27

3.1.2 Xác định các thông số của phần LC để tách các chất nhóm Quinolon 28

3.2 Xác định kỹ thuật xử lý mẫu 29

3.2.1 Quy trình tách chiết các chất cần phân tích khỏi nền mẫu 29

3.2.2 Quy trình làm sạch và làm giàu mẫu qua SPE 31

3.2.3 Quy trình xử lí mẫu được lựa chọn 33

3.3 Thẩm định phương pháp đã xây dựng 34

3.3.1 Tính thích hợp của hệ thống 34

3.3.2 Độ đặc hiệu/độ chọn lọc 35

3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 35

3.3.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 39

3.3.5 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 39

3.4 Phân tích trên mẫu thực nghiệm 44

Chương 4 BÀN LUẬN 4.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật 46

4.1.1 Các điều kiện phân tích trên hệ thống LC-MS/MS 46

4.1.2 Điều kiện xử lý mẫu 47

4.2 Thẩm định quy trình đã xây dựng 47

Kết luận .50

Kiến nghị .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Điện di mao quản

Ion hóa phun điện tử

Hiệp hội các nhà hoá phân tích

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Giới hạn tồn dư tối đa của các quinolone theo quyết định số 2377/90/EC của

Ủy ban Châu Âu……….………… …15

Bảng 1.2 : Danh mục các quinolone hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản ……… ……… ….………….16

Bảng 3.1 Thông số chung của detector khối phổ………… ……… 27

Bảng 3.2 Thông số chi tiết của 4 Quinolon……… ………27

Bảng 3.3 Gradient pha động khi sử dụng cột Symmetry……….… ……….28

Bảng 3.4 Gradient pha động khi sử dụng cột Xbridge……… ……… … 28

Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Norfloxacin…… 29

Bảng 3.6: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Ciprofloxacin… 30

Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Enrofloxacin …30

Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Flumequin.… ….30

Bảng 3.9: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin……… ……….31

Bảng 3.10: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Ciprofloxacin…… ….…… 32

Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Enrofloxacin……… ………32

Bảng 3.12: Kết quả thử nghiệm cột SPE khi phân tích Flumequin ………… …… 33

Bảng 3.13 Kết quả phân tích tính thích hợp của hệ thống……… ……… 34

Bảng 3.14: Kết quả phân tích dãy chuẩn Norfloxacin……….……… 36

Bảng 3.15: Kết quả phân tích dãy chuẩn Ciprofloxacin……… ………37

Bảng 3.16: Kết quả phân tích dãy chuẩn Enrofloxacin……… ……… …37

Bảng 3.17: Kết quả phân tích dãy chuẩn Flumequin……….……38

Bảng 3.18: LOD và LOQ của các chất phân tích tính trên nền mẫu thịt……… ……39

Bảng 3.19: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Norfloxacin……… ……40

Bảng 3.20: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Ciprofloxacin…… …….40

Bảng 3.21: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Enrofloxacin……… ….41

Bảng 3.22: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE HLB của Flumequin ……….…….41

Bảng 3.23: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18 của Norfloxacin…….……… 42

Bảng 3.24: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Ciprofloxacin…………42

Bảng 3.25: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Enrofloxacin…….…….41

Bảng 3.26: Độ lặp lại và độ thu hồi trên cột SPE C18-E của Flumequin.…… …….41 Bảng 3.27 : Kết quả phân tích 20 mẫu thịt gà (đơn vị là µg/kg)…… ………… …44 Bảng 3.28: Kết quả phân tích 20 mẫu thịt lợn (đơn vị là µg/kg)……… … 44 Bảng 3.29: Kết quả phân tích 20 mẫu cá nước ngọt (đơn vị là µg/kg)……… 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolon ……… …….3 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin ……… ……… 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Enrofloxacin ……….………….…….…… ……….5

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Norfloxacin ….……… 5 Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Flumequin …….………5 Hình 3.1: Sắc ký đồ thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích norfloxacin…… 29 Hình 3.2: Sắc ký đồ thử nghiệm cột SPE khi phân tích Norfloxacin………32 Hình 3.3: Sắc ký đồ khi phân tích tính thích hợp của hệ thống……… ….35 Hình 3.4: Đồ thị đường chuẩn của Norfloxacin (trái) và Ciprofloxacin (phải)……….36 Hình 3.5: Sắc ký đồ khi xây dựng đường chuẩn của norfloxacin……….37 Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn của Enrofloxacin (trái) và Flumequin (phải)… …… 38 Hình 3.7: sắc ký đồ của norfloxacin khi xử lí mẫu qua cột SPE HLB ……… 40 Hình 3.8: Sắc ký đồ của mẫu thực tế có (hoặc không có) norfloxacin……… 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ sức khoẻ con người Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến

bộ của công nghệ sinh học Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh nói chung

và nhóm Fluoroquinolon nói riêng có thể làm nguồn thực phẩm cung cấp cho con người còn chứa một lượng nhỏ chất kháng sinh, người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ

Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá của Việt nam được mở rộng, đặc biệt trong lĩnh vực xuất khẩu các mặt hàng nông sản, thuỷ sản Tuy nhiên,

do việc kiểm soát dư lượng hoá chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng chưa được thực hiện nghiêm túc nên một số lô hàng bị thị trường xuất nhập khẩu phát hiện kháng sinh có hại vẫn còn cao Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho các doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến uy tín chất lượng hàng Việt nam trên thị trường thế giới và sức khỏe người tiêu dùng Quinolon có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả cao nên chúng được sử dụng rộng rãi để chữa bệnh cho người, gia cầm và thủy sản trong công nghiệp Trong quá trình nuôi dưỡng, nếu không tuân thủ về thời gian dùng thuốc và thời gian sản xuất hoặc chế biến thì sẽ dẫn đến lượng Quinolon còn lại trong thịt gia cầm hay thủy sản Điều này sẽ gây rất nhiều mối nguy hiểm Đặc biệt là gây ra hiện

tượng kháng thuốc của một số vi khuẩn như: Salmonella, Campylobacter spp,

Escherichia coli, Hậu quả là giảm hiệu quả của Quinolon đối với các chủng vi

khuẩn trên, gây khó khăn và tốn kém trong điều trị cho con người

Để bảo vệ quyền lợi của người tiêu dùng, ở châu Âu, tổ chức EU đã thiết lập giới hạn lớn nhất (MRLs) đối với dư lượng thuốc trong nguồn thực phẩm khi cung cấp cho con người vào năm 1990 Theo sự kiểm tra và định hướng của các chuyên gia phòng thí nghiệm, EU đã công bố “Council directive 96/23/EC in 1996” [23] , trong đó quy định rõ hàm lượng kháng sinh theo từng loại thực phẩm và từng loại thuốc, ví dụ như với enrofloxacin trong cơ, gan, thận của bò, lợn, gia cầm (gà, vịt)

là 30µg/kg; trong sữa bò là 100 µg/kg; Ở châu Mỹ, Hoa kỳ và các nước Bắc Mỹ đã

cấm sử dụng kháng sinh họ Fluoroquinolon Bộ Thủy sản đã ra quyết định số 07/2005/QD-BTS ban hành ngày 24/02/2005 quy định danh mục 17 loại kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử dụng trong đó có nhóm Quinolon [10]

và Quyết định số 26/2005/QD-BTS ban hành ngày 18/8/2005 bổ sung nhóm Quinolon vào danh mục cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu vào thị trường Bắc Mỹ và Hoa Kỳ [11]

Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình xác định dư lượng một

số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC-MS/MS”, với 2 mục tiêu

chính như sau:

1 Xây dựng quy trình xác định dư lượng ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin , flumequin trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép 2 lần khổi phổ LC-MS/MS

2 Ứng dụng quy trình đã xây dựng để sơ bộ khảo sát dư lượng Quinolon trong một

số loại thực phẩm (Thịt, cá) trên thị trường Hà Nội

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về Quinolon [5]

1.1.1 Cấu tạo chung

Đôi khi ở vị trí 8 là N Vậy đa số chúng là dẫn chất của acid oxo-quinolein-3-carboxylic

1,4-dihydro-4-Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của nhóm quinolon

+ Tác dụng trên cả vi khuẩn gram (-) đã kháng acid nalidixic, trực khuẩn mủ xanh, nhiều vi khuẩn gram (-) khó trị khác

+ Trên các vi khuẩn gram (+) thì đặc biệt là tụ cầu vàng, S.epidermitis đã kháng gentamycin, liên cầu, cầu khuẩn ruột (Enterococus) và các vi khuẩn kỵ khí

+ Trên các vi khuẩn phát triển trong tế bào, và một số loại vi khuẩn đặc biệt nguy hiểm (như Legionella, Chlamydia, Ureoplasma, Mycoplasma, các vi khuẩn kháng alcol )

1.1.3 Cơ chế tác dụng

Theo một hoặc hai cơ chế sau và đều cho tác dụng diệt khuẩn:

- Ức chế ADN-gyrase, là enzym tham gia vào quá trình tổng hợp acid nhân

- Tạo phức với kim loại hóa trị hai của các protein chứa các kim loại này, đồng thời phức đó ion hóa thành ion phức có hoạt tính cao với các enzym chuyển hóa

1.1.4 Tác dụng phụ

Tác dụng phụ của thuốc chủ yếu là lên dạ dày - ruột, thần kinh trung ương và da

- Tiêu hóa: Buồn nôn, nôn, ỉa chảy, đau bụng, rối loạn tiêu hoá

- Da: Nổi ban, ngứa, viêm tĩnh mạch nông

- Cơ xương: Ðau ở các khớp, sưng khớp Ðau cơ, viêm gân (gân gót) và mô bao quanh Có một vài trường hợp bị đứt gân, đặc biệt là ở người cao tuổi khi dùng phối hợp với corticosteroid

- Thần kinh trung ương: Cơn co giật, lú lẫn, rối loạn tâm thần, hoang tưởng, mất ngủ, trầm cảm, loạn cảm ngoại vi, rối loạn thị giác kể cả ảo giác, rối loạn thính giác,

ù tai, rối loạn vị giác và khứu giác, tăng áp lực nội sọ

- Da: Hội chứng da - niêm mạc, viêm mạch, hội chứng Lyell, ban đỏ da thành nốt, ban đỏ đa dạng tiết dịch

- Gan: Ðã có báo cáo về một vài trường hợp bị hoại tử tế bào gan, viêm gan, vàng

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Ciprofloxacin

Tính chất: là bột kết tinh màu vàng nhạt, tan một phần trong nước, tan rất ít trong ethanol, methylen chlorid Tan tốt trong dung dịch acid acetic loãng, có hai giá trị pKa là 6.0 và 8.8

HN

N

Tên gọi: acid

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Enrofloxacin

Tính chất: là tinh thể màu vàng nhạt, tan nhẹ một phần trong nước ở pH = 7,

có hai giá trị pKa: khoảng 5 và 8-9

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Norfloxacin

Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt, dễ hút ẩm, nhạy cảm với ánh

sáng Rất khó tan trong nước, khó tan trong aceton và ethanol 96%

Flumequin

Tên gọi: acid 9-Fluoro-5-methyl-1-oxo-6,

7-dihydro-1H,5H-benzoquinolizin-2-carboxylic

Trọng lượng phân tử: 261,3 Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Flumequin

Tính chất: Bột trắng, không tan trong nước, ít tan trong methylen chlorid, rất

ít tan trong methanol, dễ tan trong kiềm

1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao và chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký

[2], [7]

Quá trình tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố

của các chất tan giữa hai pha khác nhau (pha động, pha tĩnh) Dung dịch các chất

N

O

COOH F

N N

phân tích khi vào cột sẽ được hấp thụ hay liên kết với pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích Khi pha động dịch chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột Tùy theo bản chất của pha tĩnh, bản chất của chất tan, bản chất của dung môi mà quá trình rửa giải tách được các chất ra khỏi nhau Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng được đưa

ra máy in hoặc hiển thị trên màn hình Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều pic Quá trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần thì sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt trên sắc đồ

1.2.1 Kết nối sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với phổ khối lượng (MS)

Trong nhiều quá trình phân tích, các hợp chất quan tâm thường nằm trong một hỗn hợp phức tạp, và vai trò của kỹ thuật sắc ký là thiết lập sự tách các thành phần của hỗn hợp, cho phép định tính hoặc định lượng chúng Về mặt định tính, nhược điểm chính của kỹ thuật sắc ký trong quá trình tách là không có khả năng cung cấp thông tin về định tính một cách rõ ràng cho các hợp phần mẫu, thậm chí cả trong trường hợp chúng được tách hoàn toàn khỏi nhau Việc định tính được dựa trên cơ sở so sánh các đặc tính lưu giữ, mà đơn giản nhất là thời gian lưu của một chất chưa biết với các chất so sánh được xác định trong cùng một điều kiện thí nghiệm Tuy nhiên, trên thực tế rất nhiều trường hợp thậm chí có cùng các đặc tính lưu giữ của cấu tử chưa biết và vật liệu so sánh, trong giới hạn sai số thực nghiệm, định tính, người phân tích cũng không thể kết luận một cách tuyệt đối hai hợp chất này là giống nhau Mặc dù các điều kiện sắc ký tương đối mở rộng cho các nhà phân tích, nhưng không phải lúc nào cũng có thể thực hiện được quá trình tách tất

cả các cấu tử của một hỗn hợp mẫu và điều này có thể ảnh hưởng đến độ đúng, độ chính xác trong quá trình phân tích định lượng của các chất cần quan tâm

Khả năng của thiết bị sắc ký - khối phổ trên thực tế phụ thuộc vào phổ khối lượng của nhiều chất mà các chất này đã có đầy đủ các phổ (thư viện phổ) Điều này cho phép việc nhận dạng chúng một cách dễ dàng với độ tin cậy cao, mặc dù nhiều khi không hoàn toàn như vậy Nếu chất phân tích nằm trong một phần của hỗn hợp

thì phổ khối lượng nhận được sẽ chứa các ion từ tất cả các chất có mặt Trong trường hợp đặc biệt, nếu chất phân tích là một hỗn hợp của các thành phần lượng nhỏ thì việc nhận dạng sẽ trở nên khó khăn và dường như không thể Sự kết hợp khả năng tách của phương pháp sắc ký cho phép các chất tinh khiết được đưa vào máy phổ khối Khả năng nhận dạng của máy phổ khối rất rõ ràng, vì thế có thuận lợi và đặc biệt cho các chất tương tự nhau hoặc giống hệt nhau về các đặc trưng lưu, nhưng có phổ khối lượng hoàn toàn khác nhau và có thể phân biệt được các chất này Ngoài ra, phổ khối lượng còn cho phép định lượng với độ chính xác phụ thuộc vào mức độ phức tạp của hỗn hợp mẫu và bản chất của mỗi thành phần trong hỗn hợp Công việc này nếu chỉ riêng phép sắc ký thôi thì không thể thực hiện được

Phương pháp sắc ký

- Là phương pháp tách dành cho hỗn hợp mẫu

- Nhận dạng các mẫu dựa trên thời gian lưu

- Cho phép phân tích định tính và định lượng

- Phân lập và tinh chế chất

Phương pháp phổ khối lượng

- Là phương pháp nhận dạng các lượng mẫu nhỏ

- Cung cấp phổ khối lượng của các hỗn hợp phức tạp

Sự kết hợp của HPLC và phổ khối lượng vì thế cho phép nhận dạng rõ ràng và xác định

số lượng của các hợp chất mà phương pháp sắc ký không phân tích đầy đủ được

1.2.2 Sơ đồ thiết bị sắc ký lỏng - khối phổ

Một máy sắc ký lỏng khối phổ bao gồm 3 bộ phận chính (hình 1.1)

- Thiết bị sắc ký lỏng (LC, Liquid Chromatography): thông thường sử dụng máy

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, High Performance Liquid Chromatography), hiện đại hơn là máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC – Ultra Performance Liquid Chromatography)

- Bộ kết nối (Interface): có nhiệm vụ loại dung môi rửa giải và đưa mẫu chất vào buồng ion hoá của máy phổ khối Đây là bộ phận rất quan trọng và là chìa khoá của phương pháp LC-MS

- Thiết bị phổ khối lượng (MS, Mass Spectrometry)

Hình 1.6 Sơ đồ hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ

Bộ phận kết nối (interface) ở đây đóng vai trò quan trọng vì nó là kỹ thuật

chìa khoá của một máy sắc ký lỏng - khối phổ Chức năng của bộ kết nối là loại dung môi rửa giải và đưa mẫu chất vào buồng ion hóa của máy khối phổ Bộ kết nối bao gồm nhiều loại khác nhau và ra đời ở các thời điểm khác nhau như:

- Bộ kết nối băng chuyền (Moving Belt Interface): 1977

- Bộ kết nối nạp chất lỏng trực tiếp (DLI, Direct Liquid Introduction Interface):

1980

- Bộ kết nối phun nhiệt (Thermospray Interface): 1983

- Bộ kết nối bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FBA, Continuous Flow Fast Atom Bombardment Interface): 1985/1986

- Bộ kết nối ion hoá hoá học áp suất khí quyển (APCI, Atmospheric-Pressure Chemical Ionization Interface): 1986

- Bộ kết nối ion hóa phun điện (ESI, Electrospray Ionization Interface): 1988

1.2.3 Phương pháp phổ khối lượng (MS)

Phương pháp phổ khối lượng là một trong những phương pháp phân tích công cụ quan trọng Phổ khối lượng cung cấp các thông tin về phân tích định tính, định lượng các nguyên tố, thành phần và cấu trúc của các hợp chất vô cơ và hữu cơ

a Nguyên tắc chung của phương pháp

Cơ sở của phương pháp phổ khối lượng đối với các hợp chất hữu cơ là sự bắn phá các phân tử hợp chất hữu cơ trung hoà thành ion phân tử mang điện tích

Bộ kết nối

Nguồn ion

Bộ phân tích khối

Bộ phát hiện Bơm chân không

Máy tính điều khiển và phân tích số liệu

dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc theo sơ đồ sau bằng các phần tử mang năng lượng cao:

Sự hình thành các ion mang điện tích +1 chiếm hơn 95%, còn lại các ion mang điện tích +2 hoặc ion âm (-) Năng lượng bắn phá các phân tử thành ion phân

tử khoảng 10 ev Nhưng với năng lượng cao thì ion phân tử có thể phá vỡ thành mảnh ion dương (+), hoặc các ion gốc, các gốc hoặc các phân tử trung hoà nhỏ hơn:

Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo chất, phương pháp bắn phá và năng lượng bắnphá Quá trình này gọi là quá trình ion hóa

Ion phân tử và các ion mảnh là các phần tử có khối lượng Nếu gọi khối lượng của một ion là m và điện tích của nó là e thì tỷ số z=m/e được gọi là số khối Hiển nhiên các ion có khối lượng là m, 2m, 3m… và điện tích tương ứng bằng e, 2e, 3e, … có số khối z bằng nhau Ion phân tử có số khối ký hiệu là M+

b Thiết bị khối phổ

Thiết bị phổ khối đầu tiên được chế tạo bởi J Thomspon (1912) và F W Aston (1919) Thiết bị hoàn thiện được chế tạo năm 1932

1.2.4 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký

Trong các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như: lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng-lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, SPE, xung siêu âm, vi sóng nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí:

- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc

- Tăng nồng độ lên nhiều lần

- Lượng mẫu không cần nhiều

- Lượng dung môi cần ít

- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu

- Đơn giản, nhanh, giá thành thấp

Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời gian mà chúng ta chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất

a Chiết lỏng - lỏng

Phương pháp chiết lỏng - lỏng là phương pháp làm sạch mẫu thông dụng, dụng cụ thiết bị khá đơn giản nhưng hiệu quả chiết khá cao Quá trình chiết lỏng - lỏng dựa trên định luật phân bố Nernst: bất cứ một hợp phần trung tính nào cũng sẽ phân bố giữa hai dung môi không trộn lẫn với tỷ số nồng độ trong hai pha là một hằng số

[ ]

hc A

A

A

K =

b Chiết pha rắn SPE

Ngày nay, để làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký người ta thường sử dụng phương pháp chiết pha rắn SPE (chiếm hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu)

Phương pháp chiết pha rắn ứng dụng cho nhiều nền mẫu (matrix) như các loại mẫu môi trường, các loại mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu hữu cơ và mẫu thực phẩm Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn:

Bước 1 Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được với chất hấp phụ Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho vào cột SPE để tránh làm tắc cột

Bước 2 Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp phụ chất phân tích Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp

Bước 3 Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu

Bước 4 Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 3ml/phút

Bước 5 Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích

Bước 6 Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc

độ khoảng 1ml/phút

Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu có thể được sử dụng để phân tích tồn dư kháng sinh trong các nền mẫu khác nhau Hai kỹ thuật phổ biến được sử dụng trên thế giới

và Việt Nam là kỹ thuật chiết lỏng-lỏng và kỹ thuật chiết pha rắn Các nền mẫu trong nghiên cứu là các thực phẩm (chủ yếu là thịt và nội tạng động vật) và thức ăn chăn nuôi, đây là nền mẫu khá phức tạp nên thường phải sử dụng phối hợp nhiều kỹ thuật xử lý mẫu để đạt hiệu quả cao Căn cứ vào các tài liệu tham khảo chúng tôi cần phân tích và tìm ra những ưu điểm của các nghiên cứu khác nhau về các kỹ thuật xử lý mẫu với các đối tượng khác nhau và các kỹ thuật phân tích trên các loại hiết bị khác nhau nhằm xây dựng được quy trình kỹ thuật xác định dư lượng kháng sinh nhóm Quinolon trong thực phẩm phù hợp với điều kiện Việt Nam

1.3 Nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm

1.3.1 Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi

Trong những năm gần đây, kháng sinh được sử dụng nhiều trong lĩnh vực nông nghiệp đặc biệt là chăn nuôi Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10500 tấn (qui theo mức 100% tinh khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong dân y, 33% trong điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi Trong

đó, tỷ lệ các loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi: penicillin (9%); tetracycline (66%); macrolid (12%); Aminoglycosid (4%); Fluoroquinolon (1%); Trimethomprim /sulphamid (2%) và các kháng sinh khác (6%) [24]

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của một số tác giả, kháng sinh được sử dụng tràn lan trong thức ăn cho vật nuôi và tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt là phổ biến Các nghiên cứu đều cho rằng hầu hết các cơ sở chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý

từ đó dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm cao gấp hàng chục tới hàng ngàn lần so với tiêu chuẩn quốc tế Hiện nay, việc kiểm soát dư lượng kháng sinh gặp rất nhiều khó khăn do thiếu kinh phí, thiếu trang thiết bị, thiếu hiểu biết của người sử dụng Kết quả điều tra “Tình hình sử dụng kháng sinh và dư lượng kháng sinh trong thịt

gà tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp của thành phố Hồ Chí Minh” của Võ Thị Trà

An cho thấy có 8 loại kháng sinh được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi gà thịt công nghiệp trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh: colistin (15,83%), enrofloxacin, diaveridin (7,74%), sulfadimidin (6,72%), trimethoprim (6,38%), norfloxacin (5,79%),

oxytetracyclin (4,93%), gentamycin (4,51%) và acid oxolinic (4%) Có 32,61% cơ sở sử dụng kháng sinh không hợp lý, trong đó sai về liều lượng chiếm tỉ lệ cao nhất (23,3%)

Số cơ sở không ngưng thuốc đúng qui định chiếm 44,54% Kiểm tra 70 mẫu thịt gà tại các cơ sở sử dụng không hợp lý phát hiện 42 (60%) mẫu thịt có tồn dư với các loại kháng sinh: enrofloxacin, norfloxacin, tylosin, tetracyclin, sulfadimidin, sulfadiazin, sulfaquinoxalin Có mối liên quan giữa việc ngưng thuốc không đúng qui định với tình trạng tồn dư kháng sinh 35,71% mẫu thịt gà có tồn dư vượt quá giới hạn từ 2 – 400 lần

so với tiêu chuẩn của Malaysia [1]

Trong các loại kháng sinh dùng cho chăn nuôi trên thị trường không ít loại không đảm bảo hàm lượng và chất lượng nên khi sử dụng chúng sẽ có ít hiệu quả Người chăn nuôi thường phải dùng kết hợp nhiều loại kháng sinh khác nhau để phòng và chữa bệnh

Do đó đã gây nên hiện tượng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật như : thịt , sữa , trứng Điều này gây nguy hại lớn cho sức khỏe cộng đồng Con người sẽ bị nhiễm vi khuẩn kháng thuốc khi ăn phải thịt nhiễm khuẩn Đặc biệt là sự kháng thuốc của nhiều lọai vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm

1.3.2 Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở trong nước

Phạm Kim Đăng và đồng sự “ Ứng dụng phương pháp Elisa để phân tích tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong Tôm tại một số ven biển khu vực phía bắc” cho thấy: Tình hình tồn dư quinolon trong tôm đã được đánh giá thông qua việc phân tích 90 mẫu tôm được lấy ở 4 địa phương đại diện (Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định, Nghệ An) bằng phương pháp ELISA và khẳng định bằng phương pháp Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) Kết quả phân tích đánh giá tình hình tồn dư phát hiện 5 quinolon (enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, danofloxacin và acid oxolinic) trong 9 mẫu nhiễm (tỷ lệ nhiễm 10%) với nồng độ dao động từ 0,4 đến 145 ppb Trong đó, có 4 mẫu nhiễm ở nồng độ cao hơn giới hạn tồn dư cho phép theo Nghị định 2377/90 CE của Uỷ

ban Châu Âu [4]

Một số kết quả khảo sát tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà và tồn dư kháng sinh trong thịt, trứng gà trên địa bàn Hà Nội của Lê Thị Ngọc Diệp thấy rằng: Kiểm tra tồn dư kháng sinh theo phương pháp vi sinh vật (theo Dược điển Việt Nam 3, tập II, 1994) Mẫu dương tính là mẫu có đường kính vòng vô khuẩn > 8mm Kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi gà tại các huyện ngoại thành Hà Nội là các nhóm beta- lactamin (46,58%), aminoglycosid (50,96%), quinolon (78,14%), macrolid

(86,89%), tetracycline (46,58%), sulfamid (54,92%) và polypeptide (22,27%) Các kháng sinh khác có tỷ lệ sử dụng thấp, chiếm 10,11% [3]

Tác giả Nguyễn Thanh Nga trong nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh ciprofloxacin và enrofloxacin trong thực phẩm cũng lựa chọn phương pháp

động gồm acetonitril và acid formic 0,1% Các điều kiện khối phổ được tối ưu hóa như sau: Kỹ thuật ion phun hóa điện EIS với chế độ bắn ion dương, tốc độ dòng:

thế áp vào ống mao quản (capillary): 3840V, cường độ dòng điện của buồng (chamber current): 1.66μA, cường độ dòng điện tại ống mao quản (capillary

hạn phát hiện của ciprofloxacin và enrofloxacin tương ứng là 0.426ppb và 0,391ppb [6]

Để đánh giá tồn dư enrofloxacin trên cá tra, tác giả Trần Minh Phú đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với đầu dò khối phổ Phương pháp có giới hạn định lượng 2ppb Các điều kiện sắc ký đã được tối ưu hóa: sử dụng cột C18 (150 mm x 3mm; 3,0μm), Pha động chạy sắc ký là acetonitril và nước được điều chỉnh đến pH đạt 2,5 bằng axit formic Thể tích tiêm mẫu 20μl, tốc độ dòng

1.3.3 Các nghiên cứu về tồn dư quinolon trong thực phẩm ở ngoài nước

Trên thế giới hiện nay có rất nhiều các nghiên cứu xác định dư lượng của các kháng sinh nói chung và quinolon nói riêng trên các nền mẫu khác nhau Một số phương pháp đang được sử dụng như: phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) [4]; phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật học), phương pháp lý hóa Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng Với nhóm quinolon, có thể nhận thấy, phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do có độ chính xác cao, phát hiện được một lượng nhỏ kháng sinh tồn dư trong thực phẩm Các detector được sử dụng nhiều nhất là detector UV [19], detector huỳnh quang[19], [26], [34] và detector khối phổ [13]…[22]…[41]

Để xác định tồn dư kháng sinh cần phải trải qua quá trình tách chiết lấy chất cần phân tích ra khỏi nền mẫu, sau đó được làm sạch và làm giầu sử dụng bằng các kỹ thuật hiện đại để phát hiện và định lượng

Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu có thể được sử dụng để phân tích tồn dư kháng sinh trong các nền mẫu khác nhau Nguyên tắc chung của quá trình này là kết tủa protein trong mẫu sử dụng dung môi thích hợp để chiết được chất phân tích, sau đó được làm sạch và/hoặc làm giàu mẫu trước khi đem đi phân tích Dung môi được sử dụng chủ yếu là acetonitril [13], [14] [21], [30]….[41] hoặc hỗn hợp acetonitril: acid phosphoric 0,3%, hỗn hợp acetonitril : acid formic [13] Một số nghiên cứu cũng sử dụng hỗn hợp acid acetic/ethanol hoặc acid formic/ethyl acetate để chiết mẫu cho kết quả tốt Giai đoạn này thường được kết hợp với kỹ thuật rung siêu âm, lắc Vortex cho đồng nhất và ly tâm để phân tách lớp tốt hơn Giai đoạn chiết được lặp lại nhiều lần để chiết được tối đa chất phân tích Dịch chiết được loại chất béo bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (n-hexan) hoặc làm sạch mẫu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn SPE, sau đó cô cạn làm giàu mẫu, hòa cặn và đem đi phân tích [20]

Trong kỹ thuật chiết pha rắn, phân tích tồn dư kháng sinh thường sử dụng 2 loại cột chính là cột SPE Oasis HLB Waters và cột SPE C18 [14], [15]…[22], [38]….[41] Đây là kỹ thuật được đa số các nghiên cứu sử dụng để làm sạch mẫu,

sử dụng ít dung môi, cho hiệu quả cao Ngoài vai trò loại các tạp chất, kỹ thuật chiết pha rắn còn có vai trò làm giàu mẫu, tăng cường khả năng phân tích mẫu

Sắc ký lỏng là kỹ thuật được sử dụng phổ biến để phân tích tồn dư kháng sinh Kỹ thuật này đều có nhiều điểm thuận lợi để xây dựng một phương pháp phân tích đa dư lượng kháng sinh trong thực phẩm nói chung

Ngay từ khi được bắt đầu ứng dụng trong phân tích, sắc ký lỏng đã được nghiên cứu phát triển để xác định rất nhiều hợp chất Với khả năng kết hợp với nhiều loại detector khác nhau nên phạm vi ứng dụng của sắc ký lỏng rất rộng rãi và phong phú Để xác định tồn dư kháng sinh, trong thời gian đầu, detector UV và detector huỳnh quang được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu, đặc biệt là detector huỳnh quang (do có độ nhạy cao) Trong nghiên cứu của Verdon sử dụng detector huỳnh quang có LOD khoảng 4-11 mcg/kg và LOQ khoảng 13-36 mcg/kg [41] Thời gian gần đây, kỹ thuật khối phổ phát triển mạnh mẽ và đạt được nhiều

bước tiến vượt bậc Sắc ký lỏng ghép nối với detector khối phổ có độ nhạy và tính đặc hiệu rất cao, đáp ứng được yêu cầu ngày càng khắt khe của thế giới về phân tích

dư lượng

Ngoài kỹ thuật sắc ký lỏng, một số tác giả cũng đã nghiên cứu phát triển phân tích dư lượng kháng sinh sử dụng kỹ thuật: điện di mao quản (CE) Gần đây, phương pháp CE được sử dụng do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp này được D Barrón sử dụng với detector PAD để phân tích flumequin và acid oxolinic Các điều kiện điện di gồm: dung dịch điện di là dung dịch acid phosphoric 40mM điều chỉnh pH 8,02 bằng

250nm Phương pháp có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng cho acid oxolinic

và flumequine tương ứng là 15 và 48ppb và 10 và 30ppb [20] Tuy nhiên do độ nhạy không tốt và độ tin cậy không cao nên phương pháp điện di mao quản ít được

áp dụng

1.3.4 Một số quy định về giới hạn tồn dư quinolon trong thực phẩm

EU đã ban hành quyết định số 2377/90/EC quy định qui định giới hạn cho phép thuốc thú y trong sản phẩm động vật, theo đó các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật phải được kiểm soát dư lượng tuân thủ qui trình của Chỉ thị số 96/23 EC (EU, 1996) Đặc biệt các phương pháp phân tích được công nhận và áp dụng trong chiến lược kiểm soát dư lượng phải chuẩn hoá theo quyết định số 2002/657/CE (CE, 2002) Trong đó, quy định về giới hạn tồn dư tối đa của các quinolon trong nghiên cứu cụ thể như sau

Bảng 1.1: Giới hạn tồn dư tối đa của các quinolone theo quyết định số

2377/90/EC của Ủy ban Châu Âu [22]

Giới hạn tồn dư tối đa (MRL) (µg/kg)

Bò, cừu, dê, lợn

Thịt

Mỡ Gan Thận Sữa Thịt

Gia cầm

Các loài khác

Da và mỡ Gan Thận Thịt

Mỡ Gan Thận

Da và mỡ Gan Thận Thịt

Da và mỡ Gan Thận Thịt

Da Gan Thận

và Ciprofloxacin

Mỡ Gan Thận Thịt

Mỡ Gan Thận Thịt

Mỡ Gan Thận

Gia cầm

Thịt

Mỡ Gan Thận Sữa Thịt

Cá thu Khác

Mỡ Gan Thận

Da và thịt Thịt

Mỡ Gan Thận

Da và mỡ Gan Thận

Da và thịt

10

100

30

Bộ Thủy sản đã ra quyết định 07/2005/QĐ-BTS ban hành ngày 24 tháng 02 năm

2005 quy định danh mục 17 kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế

sử dụng, trong đó có nhóm flouroquinolon và quyết định 26/2005/QĐ-BTS ban hành ngày 18/8/2005 bổ sung nhóm kháng sinh fluoroquinolon cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc Mỹ Các Quyết định này được thay thế bởi Thông tư số 15/2009/TT-BNN ban hành ngày 17/03/2009 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, quy định danh mục thuốc, hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng và hạn chế sử dụng Fluoroquinolon vẫn bị cấm

sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản xuất khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc

Mỹ Các kháng sinh enrofloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin bị cấm sử dụng trong thú

y Một số kháng sinh quinolone nằm trong danh mục các kháng sinh hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản

Bảng 1.2 : Danh mục các quinolone hạn chế sử dụng trong sản xuất

kinh doanh thủy sản

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu của đề tài

- Các chất phân tích: Ciprofloxacin, Enrofloxacin, Norfloxacin , Flumequin

- Đối tượng phân tích: tồn dư quinilon trong thực phẩm

- Đối tượng nghiên cứu: thịt gà, thịt lợn, cá

Các mẫu thịt, cá được lấy ngẫu nhiên tại một số chợ trên thị trường Hà Nội

- Máy ly tâm lạnh Hermle (Đức)

- Máy lắc xoáy Vortex;

- Cột SPE Sep-Pak C18-E : (500mg, 3ml) của Waters

- Cột SPE Oasis HLB (200mg, 6ml) của Waters

- Bộ cất quay chân không Eyela

- Dụng cụ thủy tinh các loại

- Ống ly tâm nhựa 50ml có nắp kín

2.2.2 Thuốc thử, hóa chất

Tất cả các hóa chất thuốc thử phải đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích

- Chuẩn ciprofloxacin, norfloxacin, enrofloxacin và flumequin của Fluka

- Nước tinh khiết dùng cho HPLC (nước cất 2 lần lọc qua màng lọc 0,45 mcm)

- Acetonitril, Methanol, Acid acetic, acid formic loại dùng cho HPLC (Merck)

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu các điều kiện LC-MS/MS

a Khảo sát và lựa chọn các điều kiện MS để xác định các chất phân tích

Sử dụng các dung dịch chuẩn của các chất nghiên cứu có nồng độ thích hợp

để phân tích trên detector MS/MS và lựa chọn được các thông số tối ưu:

- Chế độ hóa hơi: APCI hay ESI và lựa chọn ion (+) hay ion (-)

- Chế độ theo dõi ion: MRM, SIM, TIC,

- Các ion mẹ (procusor ion) và ion con (product ion),

- Các thông số về năng lượng bắn phá theo từng chất

- Nhiệt độ nguồn ion hóa và thế ion hóa

- Nhiệt độ và tốc độ của khí mang

- Thế phân mảnh cho từng cặp ion

- Một số thông số khác: khí loại tạp, well time,

b Khảo sát và lựa chọn các điều kiện LC để tách các chất phân tích

- Chuẩn bị dụng cụ và máy móc

+ Thiết bị LC-MS/MS được hiệu chuẩn theo định kỳ để đảm bảo độ chính xác + Cột sắc ký được kiểm tra đánh giá hiệu lực cột định kỳ

+ Các dụng cụ thí nghiệm được đảm bảo sạch sẽ trước khi sử dụng

- Chuẩn bị dung môi động

Pha dung môi động được pha chế chính xác và sử dụng trong một khoảng thời gian nhất định Lọc dung môi sau khi pha chế (đặc biệt là các dung dịch đệm) qua màng

- Chuẩn bị mẫu đo LC-MS/MS

+ Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn của các chất phân tích trong các loại dung môi thích hợp, pha loãng (nếu cần) để có được các nồng độ thích hợp

- Phân tích thử nghiệm và lựa chọn các điều kiện sắc kí lỏng (LC):

Dựa vào bản chất của các chất cần phân tích, trên cơ sở nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tiến hành thử nghiệm và lựa chọn các thông số sau:

+ Pha tĩnh: bản chất pha tĩnh, các thông số của pha tĩnh

+ Pha động: để phân tích đồng thời nhiều chất nên sử dụng chế độ gradient: Dung môi hữu cơ: Acetonitril, methanol, hay hỗn hợp dung môi khác

Dung môi phân cực: dung dịch acid (formic, acetic, ) hoặc dung dịch đệm Tốc độ pha động

+ Các thông số khác: nhiệt độ buồng cột, thể tích tiêm mẫu,

2.3.2 Nghiên cứu và lựa chọn quy trình xử lý mẫu

a Nghiên cứu và lựa chọn các điều kiện chiết mẫu

Sử dụng các nền mẫu trắng có thêm chuẩn ở nồng độ xác định và các điều kiện phân tích bằng LC-MS/MS đã lựa chọn được ở trên, tiến hành thử nghiệm và xác định được quy trình và các điều kiện chiết mẫu phù hợp với từng đối tượng mẫu:

- Thử nghiệm kỹ thuật chiết: lỏng-lỏng, rắn–lỏng,

- Thử nghiệm và lựa chọn dung môi chiết mẫu, số lần chiết mẫu,

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng,

- Các kỹ thuật phụ trợ: lắc vortex, siêu âm, lắc ngang, và các thông số đi kèm: thời gian, tốc độ, cách thức,

Dựa vào bản chất của các chất phân tích, bản chất của đối tượng mẫu cũng như tham khảo một số tài liệu [18], [35], [39], chúng tôi tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm một số quy trình, điều kiện chiết mẫu như sau:

+ Test 1: Chiết với Acetonitril, chiết 02 lần, có rung siêu âm hỗ trợ Cân khoảng 2g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 50ml có nắp kín Thêm chính xác 0,2ml dung dịch chuẩn hỗn hợp các Quinolon 500ppb, lắc đều, để yên khoảng 1h Thêm khoảng 30ml ACN, lắc đều, đem rung siêu âm 15 phút Sau đó đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, lấy ra gạn phần dịch trong cho vào bình cô quay 100ml Chiết lại lần 2 với 15ml ACN Gộp dịch chiết thu được, đem cô quay chân không đến cạn Hòa cặn trong 2ml ACN, lọc qua màng 0,45mcm và phân tích trên LC-MS/MS

+ Test 2: Tiến hành các giai đoạn chiết mẫu tương tự như Test 1 nhưng thay ACN bằng hỗn hợp ACN/TCA 4% trong nước cất (70/30)

+ Test 3: Tiến hành các giai đoạn chiết mẫu tương tự như Test 1 nhưng thay ACN bằng hỗn hợp ACN/NaOH 0,1N trong nước cất (70/30)

b Nghiên cứu và lựa chọn các điều kiện làm sạch mẫu

Sử dụng các nền mẫu trắng có thêm chuẩn ở nồng độ xác định và các điều kiện phân tích bằng LC-MS/MS đã lựa chọn được ở trên, tiến hành thử nghiệm và xác định được quy trình và các điều kiện làm sạch và làm giàu mẫu:

- Lựa chọn được loại cột SPE: HLB, C18-E, và các thông số cột tương ứng

- Lựa chọn từng quy trình qua từng loại cột SPE tương ứng:

+ Các giai đoạn qua cột: hoạt hóa, nạp mẫu, rửa tạp và rửa giải

+ Các loại dung môi tùy theo từng giai đoạn qua từng loại cột

+ Thể tích và số lần qua cột của các loại dung môi

+ Một số nhận xét trong quá trình qua cột SPE

- Dựa vào bản chất của các chất phân tích, bản chất của đối tượng mẫu cũng như tham khảo một số tài liệu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu và thử ghiệm một

số quy trình, điều kiện làm sạch và làm giàu mẫu như sau:

+ Cột SPE Sep-Pak C18-E : (500mg, 3ml) của Waters:

Hoạt hóa cột SPE: 6ml methanol, 6ml nước cất

Nạp mẫu với tốc độ không quá 2ml/phút

Loại tạp bằng 3ml nước cất, 3ml MeOH 10%/nước cất

Rửa giải lấy chất phân tích bằng 2 x 2ml acetonitril

+ Cột SPE Oasis HLB (200mg, 6ml) của Waters:

Hoạt hóa cột SPE: 6ml methanol, 6ml nước cất

Nạp mẫu với tốc độ không quá 2ml/phút

Loại tạp bằng 3ml nước cất, 3ml MeOH 10%/nước cất

Rửa giải lấy chất phân tích bằng 2 x 2ml acetonitril

+ Cột SPE Strata SCX (500mg, 3ml) của Phenomenex

Hoạt hóa cột SPE: 6ml methanol, 6ml dung dịch HCl 0,1N

Nạp mẫu với tốc độ không quá 2ml/phút

Loại tạp bằng 3ml nước cất, 3ml methanol

2.3.3 Thẩm định lại phương pháp đã xây dựng

píc nếu sử dụng nội chuẩn) Các giá trị RSD phải nhỏ hơn 2%

c Khảo sát khoảng tuyến tính

Để xác định khoảng tuyến tính của phương pháp, thực hiện phân tích dãy chuẩn với ít nhất 5 nồng độ pha từ 1ppb đến 500ppb Nếu đồ thị tuyến tính trong

d Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

- Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có chiều cao pic trung bình cao ít nhất gấp 3 lần chiều cao pic của mẫu trắng Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có chiều cao pic trung bình cao gấp 10 lần chiều cao pic của mẫu trắng, nghĩa là LOQ ≈ 3,3LOD

e Độ lặp lại của phương pháp

Để thử nghiệm độ lặp lại của phương pháp, tiến hành phân tích mẫu theo các điều kiện LC-MS/MS và quy trình xử lí mẫu đã lựa chọn được ở trên Sử dụng mẫu

trắng thêm chuẩn ở nồng độ xác định, tiến hành phân tích đồng thời ít nhất là 06 lần Tính toán độ lặp lại của kết quả kết quả thu được thông qua độ lệch chuẩn SD

và độ lệch chuẩn tương đối RSD theo các công thức sau:

SD (%) = ×100

X

SD RSD

f Độ thu hồi của phương pháp

Để thử nghiệm độ lặp lại của phương pháp, tiến hành phân tích mẫu theo các điều kiện LC-MS/MS và quy trình xử lí mẫu đã lựa chọn được ở trên Sử dụng mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ xác định, tiến hành phân tích đồng thời ít nhất là 06 lần Tính toán kết quả thu được của độ thu hồi theo công thức như sau:

Spike

X X

R

XSpike: nồng độ của dung dịch mẫu thêm chuẩn

2.3.4 Thực nghiệm xác định quinolon trên mẫu thịt, cá

Tiến hành thu thập mẫu ngẫu nhiên tại một số chợ trên địa bàn Hà Nội và xử

lí mẫu theo các quy trình đã được nghiên cứu, lựa chọn ở trên Phân tích các mẫu trên hệ thống LC-MS/MS với các điều kiện xác định

Tính toán kết quả phân tích được đưa ra các nhận xét, đánh giá sơ bộ về phương pháp phân tích và tình hình tồn dư một số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm trên thị trường Hà Nội

2.4 Tính toán kết quả, xử lí số liệu

Sử dụng phần mềm Analyst 1.5.1 đi kèm theo thiết bị LC-MS/MS để thu được các sắc đồ, tính toán diện tích pic,…

Sử dụng phần mềm Microsoft Excel trong máy tính : lập đường hồi quy tuyến tính, tính tỉ lệ thu hồi, độ lệch chuẩn tương đối,…

- Một số cách tính kết quả :

Dựa vào diện tích pic

- Áp dụng khi: + Diện tích và nồng độ chất đó có sự tương quan tuyến tính

+ Độ phân giải đảm bảo nhưng hệ số dung lượng k' thay đổi + Xác định được điểm đầu, điểm cuối của pic

- Không áp dụng: Khi pic quá cao hoặc quá doãng, không đối xứng, đường nền nhiễu

Dựa vào chiều cao pic

Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic là một đại lượng tỷ lệ với diện tích

vì vậy trong các trường hợp không tính theo diện tích pic được thì có thể tính kết quả theo chiều cao pic nhưng với điều kiện là hệ số dung lượng k' hằng định

Phương pháp dùng ngoại chuẩn

Có thể dùng 1 chuẩn nếu độ lặp lại tốt

Có thể dùng đường chuẩn thiết lập bằng nhiều chuẩn có nồng độ khác nhau, nồng

độ dung dịch thử được tính theo tỷ lệ thuận giữa diện tích pic hoặc chiều cao pic của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Phương pháp dùng nội chuẩn

Để giảm sai số và tăng độ lặp lại, người ta thường dùng một chuẩn thứ 2 thêm vào mẫu thử và mẫu chuẩn Chất thêm vào này gọi là nội chuẩn Trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích nhưng được tách hoàn toàn và có nồng độ tương đương và cấu trúc hoá học tương tự

Phương pháp thêm chuẩn

Áp dụng trong trường hợp chất chuẩn có nồng độ quá nhỏ hoặc bị ảnh hưởng bởi các chất khác

Phương pháp tính theo % diện tích pic

Áp dụng trong trường hợp cần biết hàm lượng tính theo chế phẩm khô của nguyên liệu hoặc tỷ lệ tạp chất mà ta không có chất chuẩn Kết quả chỉ là tương đối

vì nó đòi hỏi mọi cấu tử trong hỗn hợp đều phải được rửa giải và được phát hiện như nhau

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả khảo sát và lựa chọn các thông số cho LC-MS

3.1.1 Xác định các thông số của detector khối phổ (MS)

- Để đáp ứng yêu cầu của châu Âu (2002/657/EC) về phân tích dư lượng các chất kháng sinh trong thực phẩm, chúng tôi lựa chọn chế độ MRM, với mỗi chất sẽ

có 1 ion mẹ (precursor ion) và 2 ion con (product ion)

- Thử nghiệm khảo sát cả hai kiểu ion hóa ESI và APCI cũng như ở cả chế độ

cường độ tín hiệu của các chất là tốt nhất Vì vậy chúng tôi lựa chọn chế độ ESI (+)

- Tiến hành thử nghiệm lần lượt với từng dung dịch chất phân tích (có nồng độ 50ppb)

và thử nghiệm với hỗn hợp của chúng trên hệ thống LC-MS/MS Kết quả thu được:

+ Các thông số chung:

Bảng 3.1 Thông số chung của detector khối phổ

+ Các thông số chi tiết cho từng chất

Bảng 3.2 Thông số chi tiết của 4 Quinolon

+

m/z

DP (volt) m/z CE (volt) CXP m/z CE (volt) CXP

3.1.2 Xác định các thông số của phần LC để tách các chất nhóm Quinolon

Dựa vào bản chất của các chất phân tích, bản chất của đối tượng mẫu cũng như tham khảo một số tài liệu, chúng tôi nghiên cứu một số điều kiện như sau:

- Pha tĩnh: tiến hành thử nghiệm trên hai cột sắc ký đều có bản chất C18 pha ngược

+ Cột Symmetry (250mm x 4,6mm; 5,0 µm) và tiền cột tương ứng (Waters) + Cột XBridge (150mm x 2,1mm; 3,5 µm) và tiền cột tương ứng (Waters)

- Pha động: sử dụng gradient giữa dung môi hữu cơ và dung dịch acid hữu cơ

+ Dung môi hữu cơ: thử nghiệm Acetonitril và Methanol

+ Dung dịch acid hữu cơ: thử nghiệm nước cất có chứa 0,1% các acid: acid acetic (AA) , acid formic (FA) , acid trichloacetic (TCA) và acid trifloacetic (TFA)

- Một số thống số HPLC khác được lựa chọn:

+ Tốc độ dòng 0,5 ml/phút cho cột XBridge và 1,0 ml/phút cho cột Symmetry

- Kết quả sau khi tiến hành khảo sát, thử nghiệm và lựa chon được như sau:

+ Gradient pha động khi sử dụng cột Symmetry:

Bảng 3.3 Gradient pha động khi sử dụng cột Symmetry

+ Gradient pha động khi sử dụng cột XBridge:

Bảng 3.4 Gradient pha động khi sử dụng cột XBridge

sắc ký mới Chúng tôi đã xác định điều kiện phân tích trên cả 2 loại cột này để thuận lợi hơn cho việc triển khai phương pháp về sau

3.2 Xác định kỹ thuật xử lý mẫu

3.2.1 Quy trình tách chiết các chất cần phân tích khỏi nền mẫu

Tiến hành khảo sát các quy trình chiết mẫu khác nhau, mỗi test làm

04 lần, sử dụng các mẫu trắng cho thêm một lượng chuẩn xác định :

Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Norfloxacin

Bảng 3.6: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Ciprofloxacin

Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Enrofloxacin

Bảng 3.8: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Flumequin