Sử dụng các nền mẫu trắng có thêm chuẩn ở nồng độ xác định và các điều kiện phân tích bằng LC-MS/MS đã lựa chọn được ở trên, tiến hành thử nghiệm và xác định được quy trình và các điều kiện chiết mẫu phù hợp với từng đối tượng mẫu:
- Thử nghiệm kỹ thuật chiết: lỏng-lỏng, rắn–lỏng, ....
- Thử nghiệm và lựa chọn dung môi chiết mẫu, số lần chiết mẫu,.... - Nghiên cứu các yếu tốảnh hưởng: nhiệt độ, độẩm, ánh sáng,...
- Các kỹ thuật phụ trợ: lắc vortex, siêu âm, lắc ngang,...và các thông số đi kèm: thời gian, tốc độ, cách thức,....
Dựa vào bản chất của các chất phân tích, bản chất của đối tượng mẫu cũng như tham khảo một số tài liệu [18], [35], [39], chúng tôi tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm một số quy trình, điều kiện chiết mẫu như sau:
+ Test 1: Chiết với Acetonitril, chiết 02 lần, có rung siêu âm hỗ trợ. Cân khoảng 2g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 50ml có nắp kín. Thêm chính xác 0,2ml dung dịch chuẩn hỗn hợp các Quinolon 500ppb, lắc đều, để yên khoảng 1h. Thêm khoảng 30ml ACN, lắc đều, đem rung siêu âm 15 phút. Sau đó đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, lấy ra gạn phần dịch trong cho vào bình cô quay 100ml. Chiết lại lần 2 với 15ml ACN. Gộp dịch chiết thu được, đem cô quay chân không đến cạn. Hòa cặn trong 2ml ACN, lọc qua màng 0,45mcm và phân tích trên LC-MS/MS.
+ Test 2: Tiến hành các giai đoạn chiết mẫu tương tự như Test 1 nhưng thay ACN bằng hỗn hợp ACN/TCA 4% trong nước cất (70/30).
+ Test 3: Tiến hành các giai đoạn chiết mẫu tương tự như Test 1 nhưng thay ACN bằng hỗn hợp ACN/NaOH 0,1N trong nước cất (70/30).
b. Nghiên cứu và lựa chọn các điều kiện làm sạch mẫu
Sử dụng các nền mẫu trắng có thêm chuẩn ở nồng độ xác định và các điều kiện phân tích bằng LC-MS/MS đã lựa chọn được ở trên, tiến hành thử nghiệm và xác định được quy trình và các điều kiện làm sạch và làm giàu mẫu:
- Lựa chọn được loại cột SPE: HLB, C18-E, và các thông số cột tương ứng - Lựa chọn từng quy trình qua từng loại cột SPE tương ứng:
+ Các giai đoạn qua cột: hoạt hóa, nạp mẫu, rửa tạp và rửa giải + Các loại dung môi tùy theo từng giai đoạn qua từng loại cột + Thể tích và số lần qua cột của các loại dung môi
+ Một số nhận xét trong quá trình qua cột SPE
- Dựa vào bản chất của các chất phân tích, bản chất của đối tượng mẫu cũng như tham khảo một số tài liệu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu và thử ghiệm một số quy trình, điều kiện làm sạch và làm giàu mẫu như sau:
+ Cột SPE Sep-Pak C18-E : (500mg, 3ml) của Waters: Hoạt hóa cột SPE: 6ml methanol, 6ml nước cất. Nạp mẫu với tốc độ không quá 2ml/phút.
Loại tạp bằng 3ml nước cất, 3ml MeOH 10%/nước cất Rửa giải lấy chất phân tích bằng 2 x 2ml acetonitril. + Cột SPE Oasis HLB (200mg, 6ml) của Waters: Hoạt hóa cột SPE: 6ml methanol, 6ml nước cất. Nạp mẫu với tốc độ không quá 2ml/phút.
Loại tạp bằng 3ml nước cất, 3ml MeOH 10%/nước cất Rửa giải lấy chất phân tích bằng 2 x 2ml acetonitril. + Cột SPE Strata SCX (500mg, 3ml) của Phenomenex
Hoạt hóa cột SPE: 6ml methanol, 6ml dung dịch HCl 0,1N. Nạp mẫu với tốc độ không quá 2ml/phút.
Loại tạp bằng 3ml nước cất, 3ml methanol.
2.3.3. Thẩm định lại phương pháp đã xây dựng a. Xác định độ chọn lọc/độđặc hiệu