Trong quá trình nghiên cứu xây dựng quy trình xác định dư lượng 4 loại quinolon (ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin, flumequin trong thực phẩm), thông qua các kết quả thử nghiệm, kết hợp với tham khảo một số tài liệu [18], [35], [39], chúng tôi đã lựa chọn được các thông số chạy máy quan trọng như sau: thể
tích tiêm mẫu 20µl, cột sắc ký Symmetry và tiền cột tương ứng , cột XBridge và tiền cột tương ứng; nhiệt độ buồng cột 350C ; tốc độ dòng 0,5 ml/phút cho cột XBridge và 1,0 ml/phút cho cột Symmetry; gradient pha động điều chỉnh phù hợp với từng loại cột. Cột Symmetry có ưu điểm là hiện nay được dùng chủ yếu trong các phòng thí nghiệm, giá thành rẻ hơn cột Xbridge nên tiện triển khai sử dụng trong các phòng thí nghiệm ở Việt Nam; cột Xbridge có ưu điểm là tiết kiệm dung môi và thời gian, cho hiệu quả tách tốt hơn nhưng nhược điểm là đắt tiền, phải có hệ
thống UPLC đi kèm do đó chúng tôi phát triển song song cả 2 loại cột này, tùy theo
điều kiện phòng thí nghiệm mà áp dụng loại cột nào.
Xác định được các thông số chung của detector MS cho 4 chất, xác định được các thông số tối ưu cho từng chất phân tích; detector MS cho tín hiệu tốt và có độ ổn định cao, có độ chọn lọc, độ đặc hiệu tin cậy để xác định dư lượng 4 chất nhóm Quinolon. Những kết quả được lựa chọn trên cũng giống với một số nghiên cứu: [13], [14], …[19]. Điểm khác biệt ởđây là chúng tôi đã sử dụng sắc ký lỏng ghép 2 lần khối phổ, chúng khắc phục được nhược điểm của ghép 1 lần khối phổ (không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, do kỹ
thuật ion hoá nhẹ nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử…) đồng thời tăng thêm
độ nhạy, độ chính xác. Theo chỉ thị của cộng đồng Châu Âu 2002/657/EC [22], để định danh hay khẳng định các chất bị cấm, các chất độc trong các mẫu phân tích, phương pháp kiểm nghiểm phải đạt được ít nhất là 4 điểm nhận danh (identification point kí hiệu là IP) và chỉ được quyền kết hợp tối đa ba kỹ thuật. Điều này có nghĩa là bắt buộc phải dùng phương pháp khối phổ để phân tích khẳng định các chất bị
cấm, các hóa chất bảo vệ thực vật và tồn dư kháng sinh, hormon trong thực phẩm. Hiện nay, các phòng thí nghiệm thế giới đang tập trung nghiên cứu phát triển hai kỹ
thuật chính để phân tích các chất này là LC-MS/MS và GC-MS/MS [20] do đó phương pháp nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với yêu cầu và xu hướng về kỹ
thuật của thế giới.
4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu
Xử lý mẫu trong phân tích thực phẩm là khâu hết sức quan trọng, một trong những yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phân tích. Tuỳ từng đối tượng mẫu, tuỳ từng chỉ tiêu phân tích mà phải có cách xử lý khác nhau, bảo quản mẫu sau xử lý khác nhau. Khi tiến hành phân tích dư lượng một số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm cần phải tiến hành xử lý mẫu qua 02 giai đoạn chính là chiết tách các chất cần phân tích ra khỏi nền mẫu và tiến hành làm sạch, loại tạp kết hợp làm giàu mẫu. Hàm lượng các chất cần phân tích rất nhỏ (chỉ khoảng vài chục ppb) nên 02 giai đoạn trên là cần thiết. Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu có thể được sử
dụng để phân tích tồn dư kháng sinh trong các nền mẫu khác nhau. Hai kỹ thuật phổ
biến được sử dụng trên thế giới và Việt Nam là kỹ thuật chiết lỏng-lỏng và kỹ thuật chiết pha rắn. Các nền mẫu trong nghiên cứu là các thực phẩm (chủ yếu là thịt và nội tạng động vật) đây là nền mẫu khá phức tạp nên thường phải sử dung phối hợp nhiều kỹ thuật xử lý mẫu để đạt hiệu quả cao. Dung môi được sử dụng chủ yếu là acetonitril [13], [14]...[22] hoặc hỗn hợp acetonitril: acid phosphoric 0,3%, hỗn hợp acetonitril : acid formic [13]. Một số nghiên cứu cũng sử dụng hỗn hợp acid acetic/ethanol hoặc acid formic/ethyl acetate để chiết mẫu cho kết quả tốt.. Qua nghiên cứu và thử nghiệm chúng tôi nhận thấy chiết mẫu bằng dung môi acetonitril/TCA 4% trong nước cất (70/30) kết hợp với qua cột chiết pha rắn SPE C18-E và SPE HLB sẽ cho hiệu quả xử lý mẫu tôt, đạt yêu cầu .
4.2. Thẩm định quy trình đã xây dựng
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hệ thống LC-MS/MS hiện đại được trang bị phần mềm tính toán độ tinh khiết pic sắc ký. Kết hợp với các thông số chạy
máy đã lựa chọn ở trên giúp phân biêt sắc ký đồ của 4 loại quinolon. Phương pháp xác định đồng thời 4 loại quinolon trong thực phẩm đạt yêu cầu vềđộ chọn lọc.
Phương pháp của chúng tôi có khoảng tuyến tính của ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là 5ppb-500ppb; flumequin là từ 2ppb đến 500ppb. So sánh kết quả trên với nghiên cứu của tác giả Jonas Augusto Rizzto Paschoal và cộng sự [29] cho thấy nghiên cứu của chúng tôi có khoảng tuyến tính của ciprofloxacin và enrofloxacin rộng hơn (ciprofloxacin tuyến tính trong khoảng 17ppb-300ppb, enrofloxacin tuyến tính trong khảng 21ppb-300ppb); so với nghiên cứu của A. Pena và công sự [13] (có của ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là 6,25 ppb đến 125ppb) thì nghiên của chúng tôi có khoảng tuyến tính của 3 loại quinolon này rộng hơn rất nhiều.
Giới hạn xác định và giới hạn định lượng trong nghiên cứu này được xác định của ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là 3ppb và 10ppb và flumequin là 1,2 ppb và 4 ppb. So sánh với phương pháp khác, phương pháp này có kết quả thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của Jonas Augusto Rizzato Paschoal và cộng sự [29] (ciprofloxacin 4ppb và 17 ppb, enrofloxacin 6ppb và 21ppb, flumequin 5ppb và 18ppb); và có kết quả tương đương so với kết quả nghiên cứu của Cun Li và cộng sự [19] (ciprofloxacin 3ppb và 10 ppb, enrofloxacin 3ppb và 10ppb) . Trong nghiên cứu của Verdon và cộng sự [41] sử dụng detector huỳnh quang có LOD khoảng 4- 11 mcg/kg và LOQ khoảng 13-36 mcg/kg. Như vậy sắc ký lỏng ghép nối với detector khối phổ có độ nhạy và tính đặc hiệu rất cao, đáp ứng được yêu cầu ngày càng khắt khe của thế giới về phân tích dư lượng.
Từ các kết quả thực nghiệm thu được ở trên cho chúng ta thấy: khi xử lí mẫu qua cột SPE HLB :Norfloxacin có giá trị RSD là 5,33%, Ciprofloxacin có giá trị
RSD là 5,78%, Enrofloxacin có giá trị RSD là 5,07%, Flumequin có giá trị RSD là 3,11%. Khi xử lí mẫu qua cột SPE C18-E : Norfloxacin có giá trị RSD là 5,04%, Ciprofloxacin có giá trị RSD là 3,71%, Enrofloxacin có giá trị RSD là 6,72%, Flumequin có giá trị RSD là 5,97%. Kết quả này có thể so sánh được với độ lặp lại thu được trong nghiên cứu của tác giả O. Ballesteros và cộng sự [37] giá trị RSD
khoảng 4,9 %-7,5%; độ lặp lại thu được trong nghiên cứu của tác giả E. Rodriguez và cộng sự [21] Ciprofloxacin có giá trị RSD là 7%, Enrofloxacin có giá trị RSD là 5% và độ lặp lại thu được trong nghiên cứu của tác giả A. Pena và cộng sự [13] là :Norfloxacin có giá trị RSD là 7%, Ciprofloxacin có giá trị RSD là 6,5%, Enrofloxacin có giá trị RSD là 8,7% . Như vậy phương pháp của chúng tôi có độ lặp lại tốt hơn. Ngoài ra kết quả của nghiên cứu cũng đạt theo yêu cầu của AOAC [12] Nghiên cứu của chúng tôi còn cho thấy: độ thu hồi trung bình khi xử lí mẫu qua cột SPE HLB của Norfloxacin là 75,4%, Ciprofloxacin là 76,8%, Enrofloxacin là 93,5%, Fumequin là 95,4%; độ thu hồi trung bình khi xử lí mẫu qua cột SPE C18-E của Norfloxacin là 74,5%, Ciprofloxacin là 78,1%, Enrofloxacin là 77,0%, Flumequin là 80,5%). Kết quả trên của phương pháp gần tương đương với kết quả
nghiên cứu của tác giả Cun li và công sự [19] vềđộ thu hồi của enrofloxacin 95% và của tác giả A.pena và công sự [13] (có độ thu hồi trung bình của norfloxacin là 76%, ciprofloxacin là 75,8%. Kết quả của nghiên cứu đạt theo yêu cầu của AOAC [12]
KẾT LUẬN
Sau khi hoàn thành nghiên cứu này, trên cơ sở các kết quả phân tích thực nghiệm để xác định dư lượng 4 loại quinolon (ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin, flumequin) trong thực phẩm bằng kỹ thuật LC-MS/MS, chúng tôi thu
được các kết quả sau:
* Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời 4 loại quinolon trong thực phẩm tương ứng với 2 giai đoạn:
- Xử lý mẫu: Mẫu được chiết bằng hỗn hợp acetonitril/TCA 4% trong nước cất (70/30) ) kết hợp với qua cột chiết pha rắn SPE C18-E và SPE HLB sẽ cho hiệu quả xử lý mẫu tôt, đạt yêu cầu.
- Phân tích bằng LC-MS/MS: Thông số của detector khối phổ
+ Chếđộ ESI (+) cho cường độ tín hiệu của các chất là tốt nhất. + Các thông số chung:
Khí màn (Curtain gas) 15
Khí va chạm (Collision gas ) 7
Thế phun điện tử (Ionspray voltage ) 5000
Nhiệt độ mao quản (TEM) 4500C
Khí nguồn ion 1 (Ion source gas 1) 20
Khí nguồn ion 1 (Ion source gas 2) 20
Thếđầu vào (Entrance potential) 10
+ Các thông số chi tiết cho từng chất
Ion con 1 Ion con 2
Chất phân tích (M+H)+ m/z DP (volt) m/z CE CXP m/z CE CX P Ciprofloxacin 332 91 314 27 34 288 23 22 Norfloxacin 320 96 276 23 26 302 25 14 Enrofloxacin 360 41 316 25 18 342 27 20 Flumequin 262 106 202 43 26 244 25 28 Thông số của phần LC + Sử dụng cột C18
Cột XBridge (150mm x 2,1mm; 3,5 µm) và tiền cột tương ứng (Waters). + Dung môi hữu cơ: Acetonitril và H2O thay đổi theo gradient.
+ Dung dịch acid hữu cơ: nước cất có chứa 0,1% acid formic (FA) + Thể tích tiêm mẫu 20µl, nhiệt độ buồng cột 350C
+ Tốc độ dòng 0,5 ml/phút cho cột XBridge và 1,0 ml/phút cho cột Symmetry.
* Phương pháp đã xây dựng được thẩm định cho thấy có tính chọn lọc, có độ ổn
định cao, có độ lặp lại và thu hồi tốt, có thể áp dụng vào thực tế. - Khoảng tuyến tính rộng:
+ Ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là 5ppb đến 500ppb + Flumequin là từ 2ppb đến 500ppb
- Giới hạn phát hiện :
+ Ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là 3ppb + Flumequin là 1,2 ppb
- Giới hạn định lượng :
+ Ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin là 10ppb + Flumequin là 4 ppb
- Độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp đáp ứng theo yêu cầu của AOAC
* Áp dụng quy trình phân tích đã xây dựng ở trên, chúng tôi đã phân tích 60 mẫu thực phẩm tại các chợ khác nhau trên địa bàn Hà nội để xác định dư lượng quinolon. Kết quả thu được là mẫu thịt gà và cá không có chứa dư lượng 4 loại quinolon trên trên. Một số mẫu thịt lợn có chứa dư lượng của 3 quinolon là (ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin) trong đó có mẫu thì đạt giới hạn cho phép về
KIẾN NGHỊ
Trong khuôn khổ luận văn, với thời gian và điều kiện hạn hẹp nên chúng tôi mới chỉ nghiên cứu trong phạm vi là xác định dư lượng 4 chất nhóm quinolon (ciprofloxacin, enrofloxacin, norfloxacin, flumequin) và ứng dụng quy trình đã xây dựng phân tích ngẫu nhiên trên 60 mẫu thịt và cá. Vì vậy mong muốn của chúng tôi là trong thời gian sắp tới phải mở rộng nghiên cứu phương pháp này thành phương pháp chung có thể áp dụng phân tích đồng thời các chất khác thuộc nhóm quinolon và các nhóm kháng sinh khác nữa; đồng thời ứng dụng quy trình đã xây dựng phân tích trên nhiều loại đối tượng thực phẩm khác với số lượng mẫu lớn hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Võ Thị Trà An (2001): “Tình hình sử dụng kháng sinh và dư lượng kháng sinh
trong thịt gà tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp của thành phố Hồ Chí Minh”,luận
văn thạc sỹ, ĐH Nông Lâm TP HCM.
2. Bộ y tế (2009), “Hóa phân tích”, Nhà xuất bản Y học.
3. Lê Thị Ngọc Diệp (2001): “Một số kết quả khảo sát tình hình sử dụng thuốc kháng
sinh trong chăn nuôi gà và tồn dư kháng sinh trong thịt, trứng gà trên địa bàn Hà
Nội”, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
4. Phạm Kim Đăng và công sự (2008): “Ứng dụng phương pháp ELISA để phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực Bắc
Bộ”, Tạp chí Khoa học và phát triển, Tập VI, số 3, trường ĐH Nông nghiệp HN.
5. Đại học dược Hà Nội (2004), Hóa dược tập 2, NXB Y học Hà Nội.
6. Nguyễn Thị Thanh Nga (2011), “Nghiên cứu quy trình xác định dư lượng
ciprofloxacin và enprofloxacin trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC-MS/MS”,
luận văn thạc sỹ, Đại học KHTN, Thành phố Hồ Chí Minh.
7. Thái Phan Quỳnh Như (2005): Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, Viện Kiểm nghiệm- Bộ Y tế.
8. Trần Minh Phú và cộng sự (2008): “Xác định thời gian tồn lưu Enrofloxacin trên các tra”, tạp chí khoa học 215 -218, trường Đại học Cần Thơ.
9. Bộ Nông nghiệp (2009) Thông tư 03/2012/TT-BNNPTNT ngày 16/01/2011 sửa đổi,
bổ sung Thông tư số 15/2009/TT-BNN ngày 17/3/2009 của Bộ Nông nghiệp và Phát
triển nông thôn ban hành Danh mục thuốc, hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế
sử dụng
10. Bộ thuỷ sản (2005), Quyết định số 07/2005/QD-BTS ban hành ngày 24/02/2005
quy định danh mục 17 loại kháng sinh cấm sử dụng và danh mục 34 loại hạn chế sử
dụng trong đó có nhóm Quinolon
11. Bộ thuỷ sản (2005), Quyết định số 26/2005/QD-BTS ban hành ngày 18/8/2005 bổ
sung nhóm Quinolon vào danh mục cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thủy sản
Tiếng anh
12. AOAC International (2007): Validation and Qualification in Analytical Laboratories, Second Edition.
13. A. Pena, L. J. G. Silva, A. Pereira & L. Meisel, C. M. Lino (2010), “Determination of fluoroquinolone residues in poultry muscle in Portugal”, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 397, pp. 2615–2621.
14. Alexandra Junza, Rameshwari Amatya, Rafael Pérez-burgos, Gultekin Gokce, Edyta Grzelak, Dolores Barrón, José Barbosa (2010), “Residues of β-lactams and quinolones in tissues and milk samples. Confirmatory analysis by liquid chromatography–mass spectrometry”, Ovidius University Annals of Chemistry, 21(2),
pp. 109-122.
15. B. Delepine, D. Hurtaud-Pessel, P. Sanders (1998), “Simultaneous determination of six quinolones in pig muscle by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry”, The Analyst, 123, pp. 2743-2747.
16. Chui-Shiang Chang, Wei-Hsien Wang, Chin-En Tsai (2008), “Simultaneous determination of eleven quinolones antibacterial residues in marine products and animal tissues by Liquid chromatography with Fluorescence detection”, Journal of Food and Drug Analysis, 16(6), pp. 87-96.
17. Chui-Shiang Chang, Wei-Hsien Wang, Chin-En Tsai (2010), “Simultaneous determination of 18 quinolone residues in marine and livestock products by liquid chromatography/tandem mass spectrometry”, Journal of Food and Drug Analysis,
18(2), pp. 87-97.
18. Chung-Wei Tsai, Chan-Shing Lin, Wei-Hsien Wang (2012), “Multi-residue determination of sulfonamide and quinolone residues in fish tissues by High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)”,
Journal of Food and Drug Analysis, 20(3), pp. 674-680.
19. Cun Li (2008), “Simultaneous determination of fluoroquinolones and sulfonamides in chicken muscle by LC with fluorescence and uv detection”,
20. D. Barrón, E. Jiménez-Lozano, S. Bailac, J. Barbosa (2003), “Simultaneous determination of flumequine and oxolinic acid in chicken tissues by solid phase extraction and capillary electrophoresis”, Analytica Chimica Acta, 477, pp. 21–27. 21. E. Rodriguez, M.C. Moreno-Bondi, M.D. Marazuela (2008), “Development and validation of a solid-phase extraction method coupled to liquid chromatography with fluorescence detection for the determination of fluoroquinolone residues in powdered infant formulae Application to the analysis of samples from the Spanish and Latin American market”, Journal of Chromatography A, 1209, pp. 136–144.
22. European Commission (2002) “Commission decision 2377/90/EC”
23. European Commission (1996) “Council directive 96/23/EC”
24. Ghislain Follet, (1997), Antibiotic resistance in the EU Science, Politics and Policy. Number 3&3. 2000, p.148-155
25. Fatima Tamtam, Fabien Mercier, Joëlle Eurin, Marc Chevreuil, Barbara Le Bot (2009), “Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry performance evaluation for analysis of antibiotics in natural waters”, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 393, pp. 1709-1718.
26. Florentina Cañada-Cañada, Anunciacion Espinosa-Mans illa, Ana Jiménez Girón and Arsenio Muñoz de la Peña (2012), “Simultaneous determination of the residues of