Sử dụng các dung dịch chuẩn của các chất nghiên cứu có nồng độ thích hợp
để phân tích trên detector MS/MS và lựa chọn được các thông số tối ưu: - Chếđộ hóa hơi: APCI hay ESI và lựa chọn ion (+) hay ion (-) - Chếđộ theo dõi ion: MRM, SIM, TIC,...
- Các ion mẹ (procusor ion) và ion con (product ion),.... - Các thông số về năng lượng bắn phá theo từng chất - Nhiệt độ nguồn ion hóa và thế ion hóa
- Nhiệt độ và tốc độ của khí mang - Thế phân mảnh cho từng cặp ion
- Một số thông số khác: khí loại tạp, well time,....
b. Khảo sát và lựa chọn các điều kiện LC để tách các chất phân tích
- Chuẩn bị dụng cụ và máy móc
+ Thiết bị LC-MS/MS được hiệu chuẩn theo định kỳđểđảm bảo độ chính xác + Cột sắc ký được kiểm tra đánh giá hiệu lực cột định kỳ.
+ Các dụng cụ thí nghiệm được đảm bảo sạch sẽ trước khi sử dụng. - Chuẩn bị dung môi động
Pha dung môi động được pha chế chính xác và sử dụng trong một khoảng thời gian nhất định. Lọc dung môi sau khi pha chế (đặc biệt là các dung dịch đệm) qua màng lọc 0,45 µm, đuổi khí bằng cách chạy siêu âm.
- Chuẩn bị mẫu đo LC-MS/MS
+ Mẫu thử: xử lý theo qui trình nghiên cứu, cuối cùng qua màng lọc 0,45 µm. + Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn của các chất phân tích trong các loại dung môi thích hợp, pha loãng (nếu cần) để có được các nồng độ thích hợp.
- Phân tích thử nghiệm và lựa chọn các điều kiện sắc kí lỏng (LC):
Dựa vào bản chất của các chất cần phân tích, trên cơ sở nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tiến hành thử nghiệm và lựa chọn các thông số sau:
+ Pha tĩnh: bản chất pha tĩnh, các thông số của pha tĩnh.
+ Pha động: để phân tích đồng thời nhiều chất nên sử dụng chếđộ gradient: Dung môi hữu cơ: Acetonitril, methanol,... hay hỗn hợp dung môi khác
Dung môi phân cực: dung dịch acid (formic, acetic,...) hoặc dung dịch đệm Tốc độ pha động
+ Các thông số khác: nhiệt độ buồng cột, thể tích tiêm mẫu, ...
2.3.2. Nghiên cứu và lựa chọn quy trình xử lý mẫu a. Nghiên cứu và lựa chọn các điều kiện chiết mẫu a. Nghiên cứu và lựa chọn các điều kiện chiết mẫu
Sử dụng các nền mẫu trắng có thêm chuẩn ở nồng độ xác định và các điều kiện phân tích bằng LC-MS/MS đã lựa chọn được ở trên, tiến hành thử nghiệm và xác định được quy trình và các điều kiện chiết mẫu phù hợp với từng đối tượng mẫu:
- Thử nghiệm kỹ thuật chiết: lỏng-lỏng, rắn–lỏng, ....
- Thử nghiệm và lựa chọn dung môi chiết mẫu, số lần chiết mẫu,.... - Nghiên cứu các yếu tốảnh hưởng: nhiệt độ, độẩm, ánh sáng,...
- Các kỹ thuật phụ trợ: lắc vortex, siêu âm, lắc ngang,...và các thông số đi kèm: thời gian, tốc độ, cách thức,....
Dựa vào bản chất của các chất phân tích, bản chất của đối tượng mẫu cũng như tham khảo một số tài liệu [18], [35], [39], chúng tôi tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm một số quy trình, điều kiện chiết mẫu như sau:
+ Test 1: Chiết với Acetonitril, chiết 02 lần, có rung siêu âm hỗ trợ. Cân khoảng 2g mẫu đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 50ml có nắp kín. Thêm chính xác 0,2ml dung dịch chuẩn hỗn hợp các Quinolon 500ppb, lắc đều, để yên khoảng 1h. Thêm khoảng 30ml ACN, lắc đều, đem rung siêu âm 15 phút. Sau đó đem ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, lấy ra gạn phần dịch trong cho vào bình cô quay 100ml. Chiết lại lần 2 với 15ml ACN. Gộp dịch chiết thu được, đem cô quay chân không đến cạn. Hòa cặn trong 2ml ACN, lọc qua màng 0,45mcm và phân tích trên LC-MS/MS.
+ Test 2: Tiến hành các giai đoạn chiết mẫu tương tự như Test 1 nhưng thay ACN bằng hỗn hợp ACN/TCA 4% trong nước cất (70/30).
+ Test 3: Tiến hành các giai đoạn chiết mẫu tương tự như Test 1 nhưng thay ACN bằng hỗn hợp ACN/NaOH 0,1N trong nước cất (70/30).
b. Nghiên cứu và lựa chọn các điều kiện làm sạch mẫu
Sử dụng các nền mẫu trắng có thêm chuẩn ở nồng độ xác định và các điều kiện phân tích bằng LC-MS/MS đã lựa chọn được ở trên, tiến hành thử nghiệm và xác định được quy trình và các điều kiện làm sạch và làm giàu mẫu:
- Lựa chọn được loại cột SPE: HLB, C18-E, và các thông số cột tương ứng - Lựa chọn từng quy trình qua từng loại cột SPE tương ứng:
+ Các giai đoạn qua cột: hoạt hóa, nạp mẫu, rửa tạp và rửa giải + Các loại dung môi tùy theo từng giai đoạn qua từng loại cột + Thể tích và số lần qua cột của các loại dung môi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Một số nhận xét trong quá trình qua cột SPE
- Dựa vào bản chất của các chất phân tích, bản chất của đối tượng mẫu cũng như tham khảo một số tài liệu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu và thử ghiệm một số quy trình, điều kiện làm sạch và làm giàu mẫu như sau:
+ Cột SPE Sep-Pak C18-E : (500mg, 3ml) của Waters: Hoạt hóa cột SPE: 6ml methanol, 6ml nước cất. Nạp mẫu với tốc độ không quá 2ml/phút.
Loại tạp bằng 3ml nước cất, 3ml MeOH 10%/nước cất Rửa giải lấy chất phân tích bằng 2 x 2ml acetonitril. + Cột SPE Oasis HLB (200mg, 6ml) của Waters: Hoạt hóa cột SPE: 6ml methanol, 6ml nước cất. Nạp mẫu với tốc độ không quá 2ml/phút.
Loại tạp bằng 3ml nước cất, 3ml MeOH 10%/nước cất Rửa giải lấy chất phân tích bằng 2 x 2ml acetonitril. + Cột SPE Strata SCX (500mg, 3ml) của Phenomenex
Hoạt hóa cột SPE: 6ml methanol, 6ml dung dịch HCl 0,1N. Nạp mẫu với tốc độ không quá 2ml/phút.
Loại tạp bằng 3ml nước cất, 3ml methanol.
2.3.3. Thẩm định lại phương pháp đã xây dựng a. Xác định độ chọn lọc/độđặc hiệu a. Xác định độ chọn lọc/độđặc hiệu
Trên hệ thống LC-MS/MS, với mỗi chất phân tích lựa chọn được ít nhất 01 ion mẹ và 02 ion con, một ion con để định lượng, một ion con để định tính.
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu dung dịch chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn theo các điều kiện LC-MS/MS đã lựa chọn được. Kết quả phải đạt như sau: - Trên sắc đồ mẫu trắng không xuất hiện các pic có cùng thời gian lưu với pic của các chất phân tích trên sắc đồ mẫu dung dịch chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn. - Trên sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn có các pic có thời gian lưu tương tự như
trên sắc đồ của dung dịch chuẩn.
b. Xác định tính thích hợp của hệ thống
Tiến hành phân tích lặp lại ít nhất 06 lần dung dịch chuẩn trên hệ thống LC- MS/MS theo các điều kiện đã lựa chọn được như trên. Tính toán độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) của các giá trị thời gian lưu (tR) và diện tích pic (tỉ lệ diện tích píc nếu sử dụng nội chuẩn). Các giá trị RSD phải nhỏ hơn 2%.
c. Khảo sát khoảng tuyến tính
Để xác định khoảng tuyến tính của phương pháp, thực hiện phân tích dãy chuẩn với ít nhất 5 nồng độ pha từ 1ppb đến 500ppb. Nếu đồ thị tuyến tính trong khoảng nồng độ này (R2 ≥ 0,995) thì chấp nhận dãy nồng độ này, nếu không phải tiến hành phân tích lại dãy chuẩn hoặc thu hẹp dải nồng độ cho đến khi R2 ≥ 0,995.
d. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
- Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có chiều cao pic trung bình cao ít nhất gấp 3 lần chiều cao pic của mẫu trắng. Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ nhỏ nhất trong dãy chuẩn có chiều cao pic trung bình cao gấp 10 lần chiều cao pic của mẫu trắng, nghĩa là LOQ ≈ 3,3LOD
e. Độ lặp lại của phương pháp
Để thử nghiệm độ lặp lại của phương pháp, tiến hành phân tích mẫu theo các
trắng thêm chuẩn ở nồng độ xác định, tiến hành phân tích đồng thời ít nhất là 06 lần. Tính toán độ lặp lại của kết quả kết quả thu được thông qua độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD theo các công thức sau:
( )2 1 − − = ∑ n X Xi SD (%) = ×100 X SD RSD
Trong đó: SD: độ lệch chuẩn ; Xi: kết quả thu được trên mẫu thứ i X là kết quả trung bình của n lần
f. Độ thu hồi của phương pháp
Để thử nghiệm độ lặp lại của phương pháp, tiến hành phân tích mẫu theo các
điều kiện LC-MS/MS và quy trình xử lí mẫu đã lựa chọn được ở trên. Sử dụng mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ xác định, tiến hành phân tích đồng thời ít nhất là 06 lần Tính toán kết quả thu được của độ thu hồi theo công thức như sau:
= ×100
Spike X
X
R
Trong đó: R : độ thu hồi trung bình ; X là kết quả trung bình của n lần XSpike: nồng độ của dung dịch mẫu thêm chuẩn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.4. Thực nghiệm xác định quinolon trên mẫu thịt, cá
Tiến hành thu thập mẫu ngẫu nhiên tại một số chợ trên địa bàn Hà Nội và xử
lí mẫu theo các quy trình đã được nghiên cứu, lựa chọn ở trên. Phân tích các mẫu trên hệ thống LC-MS/MS với các điều kiện xác định.
Tính toán kết quả phân tích được đưa ra các nhận xét, đánh giá sơ bộ về
phương pháp phân tích và tình hình tồn dư một số chất nhóm Quinolon trong thực phẩm trên thị trường Hà Nội.
2.4. Tính toán kết quả, xử lí số liệu
Sử dụng phần mềm Analyst 1.5.1 đi kèm theo thiết bị LC-MS/MS để thu được các sắc đồ, tính toán diện tích pic,…..
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel trong máy tính : lập đường hồi quy tuyến tính, tính tỉ lệ thu hồi, độ lệch chuẩn tương đối,…..
- Một số cách tính kết quả :
- Áp dụng khi: + Diện tích và nồng độ chất đó có sự tương quan tuyến tính. + Độ phân giải đảm bảo nhưng hệ số dung lượng k' thay đổi. + Xác định được điểm đầu, điểm cuối của pic.
- Không áp dụng: Khi pic quá cao hoặc quá doãng, không đối xứng, đường nền nhiễu.
Dựa vào chiều cao pic
Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic là một đại lượng tỷ lệ với diện tích vì vậy trong các trường hợp không tính theo diện tích pic được thì có thể tính kết quả theo chiều cao pic nhưng với điều kiện là hệ số dung lượng k' hằng định.
Phương pháp dùng ngoại chuẩn
Có thể dùng 1 chuẩn nếu độ lặp lại tốt.
Có thể dùng đường chuẩn thiết lập bằng nhiều chuẩn có nồng độ khác nhau, nồng
độ dung dịch thửđược tính theo tỷ lệ thuận giữa diện tích pic hoặc chiều cao pic của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Phương pháp dùng nội chuẩn
Để giảm sai số và tăng độ lặp lại, người ta thường dùng một chuẩn thứ 2 thêm vào mẫu thử và mẫu chuẩn. Chất thêm vào này gọi là nội chuẩn. Trong cùng điều kiện sắc ký nó có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích nhưng được tách hoàn toàn và có nồng độ tương đương và cấu trúc hoá học tương tự.
Phương pháp thêm chuẩn
Áp dụng trong trường hợp chất chuẩn có nồng độ quá nhỏ hoặc bị ảnh hưởng bởi các chất khác.
Phương pháp tính theo % diện tích pic
Áp dụng trong trường hợp cần biết hàm lượng tính theo chế phẩm khô của nguyên liệu hoặc tỷ lệ tạp chất mà ta không có chất chuẩn. Kết quả chỉ là tương đối vì nó đòi hỏi mọi cấu tử trong hỗn hợp đều phải được rửa giải và được phát hiện như nhau
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả khảo sát và lựa chọn các thông số cho LC-MS 3.1.1. Xác định các thông số của detector khối phổ (MS) 3.1.1. Xác định các thông số của detector khối phổ (MS)
- Để đáp ứng yêu cầu của châu Âu (2002/657/EC) về phân tích dư lượng các chất kháng sinh trong thực phẩm, chúng tôi lựa chọn chế độ MRM, với mỗi chất sẽ
có 1 ion mẹ (precursor ion) và 2 ion con (product ion).
- Thử nghiệm khảo sát cả hai kiểu ion hóa ESI và APCI cũng như ở cả chếđộ
thu ion dương (M+H)+ và ion âm (M-H)+. Kết quả cho thấy: chế độ ESI (+) cho cường độ tín hiệu của các chất là tốt nhất. Vì vậy chúng tôi lựa chọn chếđộ ESI (+). - Tiến hành thử nghiệm lần lượt với từng dung dịch chất phân tích (có nồng độ 50ppb) và thử nghiệm với hỗn hợp của chúng trên hệ thống LC-MS/MS. Kết quả thu được:
+ Các thông số chung: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.1. Thông số chung của detector khối phổ
Khí màn (Curtain gas) 15 (áp suất/ thể tích) Khí va chạm (Collision gas ) 7 (áp suất/ thể tích) Thế phun điện tử (Ionspray voltage ) 5000 (volt)
Nhiệt độ mao quản (TEM) 4500C
Khí nguồn ion 1 (Ion source gas 1) 20 Khí nguồn ion 2 (Ion source gas 2) 20 Thếđầu vào (Entrance potential) 10 (volt) + Các thông số chi tiết cho từng chất
Bảng 3.2 Thông số chi tiết của 4 Quinolon
Ion con 1 Ion con 2
Chất phân tích (M+H)
+
m/z
DP
(volt) m/z CE (volt) CXP m/z CE (volt) CXP
Ciprofloxacin 332 91 314 27 34 288 23 22
Norfloxacin 320 96 276 23 26 302 25 14
Enrofloxacin 360 41 316 25 18 342 27 20
Flumequin 262 106 202 43 26 244 25 28
Ciprofloxacin d8 340 96 322 25 34 296 34 38
(Trong đó: DP-declustering potential; CE-collistion energy; CXP-collision cell exit potential). Nhận xét: Các thông số thu được trong quá trình tối ưu hóa detector MS theo từng chất phân tích và hỗn hợp các chất này sẽđược sử dụng để khảo sát các điều kiện khác của phương pháp.
3.1.2. Xác định các thông số của phần LC để tách các chất nhóm Quinolon
Dựa vào bản chất của các chất phân tích, bản chất của đối tượng mẫu cũng như
tham khảo một số tài liệu, chúng tôi nghiên cứu một sốđiều kiện như sau:
- Pha tĩnh: tiến hành thử nghiệm trên hai cột sắc ký đều có bản chất C18 pha ngược + Cột Symmetry (250mm x 4,6mm; 5,0 µm) và tiền cột tương ứng (Waters). + Cột XBridge (150mm x 2,1mm; 3,5 µm) và tiền cột tương ứng (Waters). - Pha động: sử dụng gradient giữa dung môi hữu cơ và dung dịch acid hữu cơ
+ Dung môi hữu cơ: thử nghiệm Acetonitril và Methanol.
+ Dung dịch acid hữu cơ: thử nghiệm nước cất có chứa 0,1% các acid: acid acetic (AA) , acid formic (FA) , acid trichloacetic (TCA) và acid trifloacetic (TFA) - Một số thống số HPLC khác được lựa chọn:
+ Thể tích tiêm mẫu 20µl, nhiệt độ buồng cột 350C
+ Tốc độ dòng 0,5 ml/phút cho cột XBridge và 1,0 ml/phút cho cột Symmetry.
- Kết quả sau khi tiến hành khảo sát, thử nghiệm và lựa chon được như sau: + Gradient pha động khi sử dụng cột Symmetry:
Bảng 3.3 Gradient pha động khi sử dụng cột Symmetry
Thời gian (phút) Acetonitril (FA 0,1%) H2O (FA 0,1%)
Bắt đầu 20% 80% 1,0 20% 80% 7,0 50% 50% 7,5 100% 0% 8,5 100% 0% 9,0 20% 80% 12,0 20% 80%
+ Gradient pha động khi sử dụng cột XBridge: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.4 Gradient pha động khi sử dụng cột XBridge
Thời gian (phút) Acetonitril (FA 0,1%) H2O (FA 0,1%)
Bắt đầu 20% 80%
1,0 50% 50%
7,0 70% 30%
7,5 20% 80%
10,0 20% 80%
- Nhận xét: Cột Symmetry là loại cột thông dụng, được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm còn cột XBridge đang được ứng dụng trong các thế hệ máy
sắc ký mới. Chúng tôi đã xác định điều kiện phân tích trên cả 2 loại cột này để
thuận lợi hơn cho việc triển khai phương pháp về sau.
3.2. Xác định kỹ thuật xử lý mẫu
3.2.1. Quy trình tách chiết các chất cần phân tích khỏi nền mẫu
Tiến hành khảo sát các quy trình chiết mẫu khác nhau, mỗi test làm 04 lần, sử dụng các mẫu trắng cho thêm một lượng chuẩn xác định :
Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm dung môi chiết mẫu khi phân tích Norfloxacin
Dung môi chiết C thêm vào -
(ng/l) Area Std/IS C thu được (ng/l) TB
100 1,990 69,2 100 1,991 69,6 100 1,190 66,2 Acetonitril 100 2,169 75,8 70,2 100 2,654 92,7 100 2,688 93,6