Nghiên cứu nuôi cấy tạo mô sẹo từ lá non của 2 giống mía Việt Nam 84 – 4137 và Suphanburi 7 trên môi trường MS. Bước đầu nghiên cứu chuyển gen

ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của: Tiến Sĩ Nguyễn Hữu Hổ – Phòng Công nghệ Gen Thực vật – Viện Sinh học Nhiệt đới – đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình về các vấn đề có liên quan trong đề tài. Kỹ sư Lê Tấn Đức – Phòng Công nghệ Gen Thực vật – Viện Sinh học Nhiệt đới – đã hướng dẫn và động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian làm việc. Các cán bộ phòng Công nghệ Gen Thực vật – Viện Sinh học Nhiệt đới – đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể sử dụng các trang thiết bị, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm. Tiến sĩ Nguyễn Đức Quang – Giám đốc trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía đường – Bến Cát – Bình Dương – đã giúp đỡ và hỗ trợ về các giống mía. Tiến sĩ Cao Anh Đương – Phó giám đốc trung tâm Nghiên cứu và phát triển mía đường – Bến Cát – Bình Dương – đã giới thiệu một số tài liệu về cây mía đường. Cha, mẹ và em tôi đã động viên tinh thần và giúp đỡ tôi về mặt kinh tế để tôi có thể an tâm thực hiện luận văn. Các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã giảng dạy để tôi có những kiến thức cần thiết. Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Đại học Bách Khoa Tp HCM – đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình làm việc. Xin gởi đến những người kể trên lời cảm ơn chân thành! iii TÓM TẮT Mía được xem là loại cây trồng cung cấp nguồn năng lượng cho con người, 70% lượng đường được tạo ra trên thế giới là từ mía. Khảo sát nuôi cấy tạo mô sẹo từ lá non của 2 giống mía VN84 – 4137 (Việt Nam) và Suphanburi 7 (Thái Lan), dùng môi trường cơ bản MS (có 500 mg/l casein, 30 g/l đường saccharose) với các nồng độ khác nhau của 2,4 – D, đã xác định được môi trường thích hợp nhất là môi trường có 4 mg/l 2,4 – D. Tiếp tục khảo sát tái sinh tạo chồi của 2 giống mía trên đã xác định được môi trường tối ưu cho tái sinh chồi/cây là môi trường MS (30 g/l sucrose) có bổ sung 2 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA với tỷ lệ tái sinh là 100% sau 30 ngày nuôi cấy. Nhằm mục đích phục vụ cho giai đoạn chuyển gen, khảo sát ảnh hưởng của PPT đã xác định được môi trường MS (có 500 mg/l casein, 30 g/l saccharose, 4 mg/l 2,4 – D) có bổ sung 4 mg/l PPT gây ức chế sự hình thành mô sẹo mới từ mô sẹo lá của giống mía VN84 – 4137. Bước đầu nghiên cứu chuyển gen (dùng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pCAMBIA 3301 mang gen kháng sâu cryIA(c), gen kháng chất trừ cỏ bar và gen chỉ thị gusA) đã thu nhận được một số dòng mô sẹo hình thành mới có sức chống chịu tốt đối với PPT; trước đó, thử nghiệm hóa mô tế bào GUS nhằm ghi nhận sự biểu hiện tạm thời của gen gusA sau giai đọan 2 ngày đồng nuôi cấy đã được thực hiện với kết quả dương tính qua xử lý mô với thuốc thử X-Gluc. iv MỤC LỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Tình hình sản xuất mía đường ở Việt Nam và trên Thế giới 3 2.1.1 Tình hình sản xuất mía đường trên Thế giới 3 2.1.2 Tình hình sản xuất mía đường ở Việt Nam 5 2.2 Một số đặc điểm hình thái cây mía 13 2.2.1 Thân mía 13 2.2.2 Lóng mía 14 2.2.3 Đốt mía 15 2.2.4 Mầm mía 16 2.2.5 Lá mía 17 2.2.6 Rễ mía 18 2.2.7 Hoa mía (bông cờ) 20 2.2.8 Hạt mía 21 2.3 Sâu hại mía 21 2.3.1 Sâu đục thân 4 vạch 22 2.3.2 Sâu đục thân mía mình tím 27 2.3.3 Sâu đục thân mình trắng (sâu đục ngọn) 31 2.4 Nuôi cấy mô thực vật 33 2.5 T-DNA vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sát nhập vào bộ gen của thực vật 35 CHƢƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 37 3.1 Các giống mía được sử dụng 37 v 3.1.1 Giống VN84 – 4137 37 3.1.2 Suphanburi 7 38 3.2 Vi khuẩn, plasmid và các gen được chuyển 39 3.2.1 Dòng vi khuẩn và plasmid 39 3.2.2 Gen chỉ thị gusA 39 3.2.3 Gen chọn lọc bar 40 3.2.4 Gen hữu dụng cryIA(c) 40 3.3 Phương pháp 41 3.3.1 Khảo sát sự hình thành mô sẹo 42 3.3.2 Khảo sát sự tạo chồi 43 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự hình thành mô sẹo 43 3.4 Phương pháp tạo cây chuyển gen 45 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ và BIỆN LUẬN 49 4.1 Thí nghiệm khảo sát sự hình thành mô sẹo 49 4.1.1 Sự hình thành mô sẹo của giống mía VN84 – 4137 (Việt Nam) 49 4.1.2 Sự hình thành mô sẹo của giống mía Suphanburi 7 (Thái Lan) 53 4.2 Thí nghiệm khảo sát sự hình thành chồi (tái sinh) 57 4.2.1 Sự hình thành chồi của giống mía VN84 – 4137 (Việt Nam) 57 4.2.2 Sự hình thành chồi của giống mía Suphanburi 7 (Thái Lan) 60 4.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự hình thành mô sẹo 65 4.4 Thí nghiệm chuyển gen 67 4.4.1 Sự biểu hiện của gen gusA 67 4.4.2 Tăng sinh mô sẹo sau chuyển gen trên môi trường chứa chất chọn lọc PPT 68 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 5.1 Kết luận 70 5.2 Đề nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 vi PHỤ LỤC 74 vii CÁC TỪ VIẾT TẮT BAP 6 – benzylaminopurine CAMBIA Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture. CCS Hàm lượng đường (độ đường) 2,4 – D 2,4 – dichlorophenoxyacetic acid NAA α – naphthylacetic acid PPT Phosphinothricin viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Diện tích, sản lượng và năng suất mía đường của một số nước trên Thế giới. 4 Bảng 2: Danh sách các giống mía đang sử dụng trong sản xuất 9 Bảng 3: Các giống mía mới được phép sản xuất thử từ năm 2006 11 Bảng 4: Danh sách các giống mía mới đang khảo nghiệm 12 Bảng 5: Một số giống mía mới đang khảo nghiệm có triển vọng ở các vùng sinh thái trồng mía trọng điểm 13 Bảng 7: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của 2,4 – D lên sự hình thành mô sẹo ở giống mía Suphanburi 7. 53 Bảng 8: Số liệu khảo sát sự tái sinh tạo chồi của giống mía VN84 – 4137. 58 Bảng 9: Số liệu khảo sát sự tái sinh chồi của giống mía Suphanburi 7 60 Bảng 10: Số liệu khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự hình thành mô sẹo 65 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1: Bản đồ các nước và khu vực có sản lượng mía cao trên Thế giới 3 Hình 2: Lóng mía 14 Hình 3: Đốt mía 15 Hình 4: Các bộ phận của lá mía 17 Hình 5: Bộ rễ mía 19 Hình 6: Hoa mía 20 Hình 7: Hạt mía 21 Hình 8: Phạm vi phân bố của sâu đục thân 4 vạch trên Thế giới 22 Hình9: Triệu chứng gây hại của sâu đục thân 4 vạch 23 Hình 10: Pha trứng của sâu đục thân 4 vạch 25 Hình 11: Pha sâu non của sâu đục thân 4 vạch 25 Hình 12: Pha nhộng sâu đục thân 4 vạch 26 Hình 13: Ngài trưởng thành sâu đục thân 4 vạch 26 Hình 14: Cơ quan sinh dục của sâu đục thân 4 vạch 27 Hình 15: Phạm vi phân bố của sâu đục thân mía mình tím trên Thế giới 27 Hình 16: Phạm vi phân bố của sâu đục thân mía mình tím ở Việt Nam. 28 Hình 17: Triệu chứng gây hại của sâu đục thân mía mình tím 29 Hình 18: Các pha của sâu đục thân mía mình trắng 32 Hình 19: Giống mía VN84 – 4137 37 Hình 20: Giống mía Suphanburi 7 38 Hình 21: Quy trình tạo cây chuyển gen 45 Hình 22: Ngọn mía trước khi được tách bỏ lớp lá già bên ngoài 46 Hình 23: Ngọn mía trước khi được khử trùng 47 x Hình 24: Hình dạng mẫu cấy mía 47 Hình 25: Các nghiệm thức của quá trình khảo sát sự hình thành mô sẹo của giống mía VN84 – 4137 (Việt Nam) 51 Hình 26: Mô sẹo từ giống mía VN84 – 4317 52 Hình 27: Các nghiệm thức của quá trình khảo sát sự hình thành mô sẹo của giống mía Suphanburi 7 (Thái Lan) 54 Hình 28: Mô sẹo của giống mía Suphanburi 7 – Thái Lan 56 Hình 29: Các nghiệm thức tái sinh tạo chồi của giống mía VN84 – 4137 58 Hình 30: Các mẫu tái sinh tạo chồi của giống mía VN84 – 4137 ở môi trường số 1 và môi trường số 4 59 Hình 31: Các nghiệm thức tái sinh tạo chồi của giống mía Suphanburi 7 60 Hình 32: Các mẫu tái sinh tạo chồi của giống mía Suphanburi 7 ở môi trường số 1 và môi trường số 4 61 Hình 33: Khối mô sẹo tái sinh chồi nhiều sau 30 ngày 62 Hình 34: Khối mô sẹo tái sinh chồi ít và mô sẹo tăng sinh sau 30 ngày 62 Hình 35: Các chồi phát triển sau 45 ngày 63 Hình 36: Các nghiệm thức của quá trình khảo sát ảnh hưởng của PPT lên sự hình thành mô sẹo 66 Hình 37: Sự biểu hiện của gen gusA của mô sẹo chuyển gen sau 2 ngày chuyển gen 67 Hình 38: Các mẫu mía sau khi chuyển gen và nuôi cấy trên môi trường chứa PPT 68 Hình 39: Khối mô sẹo mới hình thành sau chuyển gen. 69 Chương 1: Mở đầu 1 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU Cây mía và nghề làm mật, đường ở Việt Nam đã có từ xa xưa, nhưng công nghiệp mía đường mới được bắt đầu từ thế kỷ thứ XX. Nhờ vào cây mía và chính sách hỗ trợ của Đảng và nhà nước mà rất nhiều hộ dân đã có thêm thu nhập và ổn định đời sống, giúp cho bộ mặt nông thôn Việt Nam tại các vùng trồng mía được đổi mới. Hiện nay Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đang chuẩn bị trình Chính phủ phê duyệt tổng quan phát triển mía đường Việt Nam đến năm 2010 và tầm nhìn đến năm 2020. Đề ra các giải pháp chỉ đạo các địa phương xây dựng vùng nguyên liệu tập trung, thực hiện các giải pháp đồng bộ về quy hoạch, giống kỹ thuật thâm canh, đầu tư cơ sở hạ tầng áp dụng cơ giới hoá, để nâng nhanh năng suất, chất lượng mía. Đầu tư chiều sâu, mở rộng công suất nhà máy đường hiện có, nâng cao hiệu suất thu hồi và chất lượng sản phẩm, giảm chi phí chế biến, tăng năng lực cạnh tranh … Chương trình mía đường được chọn là chương trình khởi đầu để tiến hành công nghiệp hoá, hiện đại hoá nông nghiệp nông thôn, xoá đói, giảm nghèo, giải quyết việc làm cho lao động nông nghiệp. Còn ngành mía đường được giao “không phải là ngành kinh tế vì mục đích lợi nhuận tối đa mà là ngành kinh tế xã hội”. Tuy nhiên, vấn đề mà người dân cũng như các nhà máy sản xuất đường từ mía ở Việt Nam là về nguyên liệu mía. Điều này dẫn đến việc hầu hết các nhà máy sản xuất đường ở các tỉnh thành đều Bộ Nông nghiệp phải có những chính sách điều chỉnh vùng trồng mía để họ có nguyên liệu phục vụ sản xuất, tránh tình trạng có những lúc tranh mua mía, có những lúc người dân lại điêu đứng trước tình cảnh các công ty không chịu mua nguyên liệu trong khi mía đã đến thời kỳ thu hoạch. Nhưng đó cũng chưa phải là lý do chính khiến cho người dân trồng mía hiên nay đang có ý định từ bỏ việc trồng mía nguyên liệu mà một phần là do thiên tai, sâu bệnh cũng khiến cho mía bị thất thu. Việc trồng mía để lưu trữ giống đang dần trở nên khó khăn bởi các yếu tố tác động từ nhiên nhiên, môi trường, sâu bệnh sẽ làm ảnh hưởng đến chất lượng của giống mía. Như vậy, phải đòi hỏi những kỹ thuật viên có kinh nghiệm, xuất sắc trong vấn đề lưu trữ và giữ giống mía. Những công việc đó so với sự phát triển như vũ bão của công nghệ – khoa học hiện đại đã trở nên kém hiệu quả, trong khi chúng ta có thể lưu trữ và bảo quản giống một cách dễ dàng bằng các phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật. [...]... ROC16 75 – 100 70 – 90 11 – 12 11 – 12 Bắc Trung bộ, Trung Trung bộ, Tây Nguyên, Tây Nam bộ Bắc Trung bộ, Trung Trung bộ, Nam Trung bộ, Đông Nam bộ, Tây Nam bộ 15 ROC 22 80 – 100 11 – 12 Bắc Trung bộ, Trung Trung bộ, Tây Nam bộ 16 VN84- 422 80 – 120 11 – 12 Miền núi phía Bắc, Tây Nam bộ, Đông Nam bộ 17 VN8 441 37 70 – 100 12 – 13 Nam Trung bộ, Trung Trung bộ, Tây Nguyên, Đông Nam bộ, Tây Nam bộ 18 VN851 4 27 ... Phil80-13, VN96- 07, VN96-08, KK2, K88- 92 Vùng Tây Nam bộ 1 (Hậu Giang – Sóc Trăng) C1 324 -74 , CR74 -25 0, RB 72 - 454, ROC24, ROC 27, QĐ18, VĐ54-1 42, VĐ85- 177 , Suphanburi 7 Vùng Tây Nam bộ 2 (Long An – Bến Tre) C1 324 74 , C85 -21 2, C1 32- 81, C86- 12, K88-65, VĐ85- 177 2. 2 Một số đặc điểm hình thái cây mía 2. 2.1 Thân mía Thân mía là đối tượng thu hoạch, là nguyên liệu chính để thu đường, và cũng chứa bộ phận làm giống trồng... Chương 2: Tổng quan tài liệu 2. 2.5 Lá mía Lá mía mọc thành 2 hàng so le, đối nhau, hoặc theo đường vòng trên thân mía (tùy giống) Mỗi đốt có một lá Lá mía dính vào thân ở phía dưới đai rễ, khi lá rụng tạo thành sẹo lá hay vết lá Lá mía có 2 bộ phận chính: phiến lá và bẹ lá Bẹ lá ôm chặt vào thân cây Chỗ tiếp giáp giữa bẹ lá và phiến lá thường gọi là cổ lá Ở đó có đai dày, lưỡi lá (hoặc lá thìa) và tai lá. .. 80 – 110 11 – 12 Trung Trung bộ, Nam Trung bộ, Tây Nam bộ, Đông Nam bộ, Tây Nguyên 19 VN851859 75 – 130 10 – 11 Trung Trung bộ, Đông Nam bộ, Tây Nam bộ 20 K84 -20 0 80 – 120 11 – 12 Đông Nam bộ, Tây Nam bộ Tây Nguyên, Trung Trung bộ, 21 DLM24 80 – 110 10 – 11 10 Nam Trung bộ, Tây Nam bộ, Đông Nam bộ Chương 2: Tổng quan tài liệu Bảng 3: Các giống mía mới được phép sản xuất thử từ năm 20 06 TT Giống mía. .. VN96- 07; VN96-08; C1 328 1; C89-148; C90-530; Co 671 ; FR91-3 97; K88-65; K88- 92; K90-54; K 92- 11; K95-156; K95 -20 5; K9 529 6; KK2; KU00-1-58; KU00-1-61; KU00-1- 92; LK 92- 11; VĐ85- 177 ; VĐ54-1 42; C1 324 -74 ; C1 32- 81; C8 521 2; C86- 12; C86-456; C89-148; C90-501; Co 671 ; 6 Tây Nam bộ CR74 -25 0; Đại Ưu Đường; K88-65; K95-156; KK2; KU00-1-61; KU60-1; KU60-3; QĐ18 (QĐ90-95); Q 21 (QĐ94-119); RB 72 - 454; ROC24; ROC26; ROC 27; Suphanburi. .. VĐ85- 177 ; Ty70- 17; B83-10; C1 32- 81; C140-81; C85 -21 2; C89-148; CP 72 - 208; CR74 -25 0; FR91-3 97; K88-65; K95-156; LK 92- 11; Mex105; Phil80-13; ROC 27; Suphanburi 7; Ty70- 17; 4 Tây Nguyên B83-10; K95-156; KK2; KU00-1-58; KU00-1- 92; U-thong 4; U-thong 5; U-thong 6; 52 VĐ00 -23 6; Ty70- 17; ROC 27; Q 21 (QĐ94-119); Q 24 (QĐ94116); QĐ95-168; Quế Dẫn P8; Phil80-13; VĐ93-159; 5 Đông Nam bộ Viên Lâm 1; Viên Lâm 2; Viên... núi và trung du Bắc bộ 11 Chương 2: Tổng quan tài liệu Bảng 4: Danh sách các giống mía mới đang khảo nghiệm TT Vùng khảo nghiệm 1 Miền núi phía Bắc 2 Bắc Trung bộ Giống mía Ty70- 17; C111 -79 ; C1 324 -74 ; C1 32- 81; C85 -21 2; CR74 -25 0; RB 72 - 454; Ty70- 17; VN96-09; B83-10; C1 32- 81; C89-148; C90- 1 27 ; C96- 675 ; Đại Ưu Đường; DB 72 - 6613; FR91-3 97; FR94-0498; K88-65; K93 -23 6; K95-156; KK2; QĐ18 (QĐ90-95); ROC 27; 3... (%) 1 C85 -21 2 80 12 2 C85-391 >100 14 3 C85 -28 4 95 Vùng được phép sản xuất thử 13 Nam Trung Bộ, Đông Nam bộ và Tây Nguyên Tây Nguyên 4 C111 -79 100 14 5 C1 324 -74 110 13 – 15 6 CR74 -25 0 95 13 Đông Nam bộ 7 C86-456 75 13 Tây Nam bộ (úng phèn) 8 DLM24 >80 11 9 VN851 4 27 >90 13 >85 11 10 VN851859 Trung Trung bộ và Nam Trung bộ 11 ROC 22 >85 12 – 14 12 VĐ85-1 92 80 Trung Trung bộ >13 Bắc Trung bộ 13 ROC23 >80... Suphanburi 7; 12 Chương 2: Tổng quan tài liệu Bảng 5: Một số giống mía mới đang khảo nghiệm có triển vọng ở các vùng sinh thái trồng mía trọng điểm Vùng sinh thái Giống mía Miền Núi phía Bắc C1 324 -74 , VN85-1 4 27 , DLM24, RB 72 - 454, TY70 17 Vùng Bắc Trung bộ C89-148, FR91-3 97, C1 32- 81, C90- 1 27 , VN96-09 Vùng Duyên Hải Trung bộ Vùng Đông Nam bộ C89-148, C85 -21 2, CR74 -25 0, LK 92- 11, Phil80-13, ROC 27, Suphanburi 7 Phil80-13,... giống mía mới sau khi nghiên cứu và chuyển giao ra sản xuất Bảng 2: Danh sách các giống mía đang sử dụng trong sản xuất TT Giống mía Năng suất (tấn/ha) CCS (%) Vùng sản xuất chính 1 My5514 >80 9 – 11 Trung bộ, Tây Nguyên và Đông Nam bộ 2 F156 >80 10 – 11 Trung bộ và Tây Nguyên 3 Comus >100 9 – 10 4 Hòa Lan tím >100 10 – 12 5 Hòa Lan >100 10 – 12 6 F134 80 12 Tây Nguyên 7 H39-3633 >70 11 – 12 Đông Nam . người, 70% lượng đường được tạo ra trên thế giới là từ mía. Khảo sát nuôi cấy tạo mô sẹo từ lá non của 2 giống mía VN84 – 4137 (Việt Nam) và Suphanburi 7 (Thái Lan), dùng môi trường cơ bản MS (có. mg/l 2,4 – D) có bổ sung 4 mg/l PPT gây ức chế sự hình thành mô sẹo mới từ mô sẹo lá của giống mía VN84 – 4137. Bước đầu nghiên cứu chuyển gen (dùng dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. thành mô sẹo 66 Hình 37: Sự biểu hiện của gen gusA của mô sẹo chuyển gen sau 2 ngày chuyển gen 67 Hình 38: Các mẫu mía sau khi chuyển gen và nuôi cấy trên môi trường chứa PPT 68 Hình 39: Khối mô