Nghiên cứu mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh, phục vụ công tác chuyển gen ở sắn (manihot esculenta crantz) (manihot esculenta crantz)

1 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại Trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng và TS. Lê Hồng Điệp, những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên làm việc tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này. Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua. Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT. Tôi xin chân thành biết ơn sự hỗ trợ đó. Hà Nội, tháng 6 năm 2014 Học viên Tống Thị Hường i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về cây sắn 3 1. 1. 1. Nguồn gốc và phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây sắn 5 1.1.3. Giá trị của cây sắn 7 1.2. Tình hình sản xuất và sử dụng sắn trên thế giới và Việt Nam 8 1.2.1. Trên thế giới 8 1.2.2.Ở Việt Nam 9 1.3. Lịch sử phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 1.4. Nguyên lý và ứng dụng của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 14 1.4.1. Cơ sở lí thuyết 14 1.4.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 15 1.4.3. Các hướng ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 16 1.5. Môi trƣờng nuôi cấy tế bào mô thực vật 17 1.5.1. Các chất khoáng 17 1.5.2.Các vitamin 18 1.5.3. Các chất điều hoà sinh trưởng 19 1.6. Các phƣơng pháp chuyển gen ở thực vật 21 ii 1.6.1. Chuyển gen trƣc tiếp 21 a. Chuyển gen bằng xung điện 21 b. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) 22 c. Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (pollen tube) 22 d. Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile bombardment biolistics) 22 1.6.2. Chuyển gen gián tiếp 23 a. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus 23 b. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 23 1.7. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo phôi hóa tạo hệ thống tái sinh và chuyển gen vào sắn 24 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. Vật liệu nghiên cứu 27 2.1.1. Mẫu thực vật 27 2.1.2. Vi khuẩn và các vector 27 2.1.3. Môi trường nuôi cấy 28 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.2.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch 28 2.2.2. Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm 29 2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 29 2.2.4. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa 30 2.2.5. Phương pháp biến nạp 31 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Nghiên cứu tạo mẫu sạch 33 3.2. Nghiên cứu thí nghiệm tạo chồi, nhân cụm chồi và kéo dài chồi 36 iii 3.3. Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa từ chồi nách cây sắn 37 3.4. Kết quả tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa của giống TMS 60444 47 3.5. Kết quả chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa của giống TMS 60444 49 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Diện tích trồng sắn tại Việt Nam (x1000 ha) từ năm 1995 – 2012 [66] 9 Bảng 2. Sản lượng sắn (x 1000 tấn) trồng tại Việt Nam từ 1995 – 2012 [66] 10 Bảng 3.Các nhà máy sản xuất Ethanol và rượu từ sắn của Việt Nam năm 2012 [67] . 11 Bảng 4: Khái quát các bước tạo mô sẹo phôi hóa ở sắn 30 Bảng 5. Hệ số của các thí nghiệm tạo cụm chồi, thí nghiệm nhân cụm chồi và thí nghiệm kéo dài chồi 36 Bảng 6. Kết quả tạo mô sẹo từ chồi nách trên môi trường CIM 38 Bảng 7.Đánh giá chất lượng mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trường DKW 40 Bảng 8: Đánh giá tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi ở giai đoạn 28 ngày tuổi tại môi trường DKW 41 Bảng 9. Đánh giá khả năng tạo mô sẹo phôi hóa ở môi trường MMS 43 Bảng 10. Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa của các giống sắn nghiên cứu 46 Bảng 11. Đánh giá khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa 48 Bảng 12. Ảnh hưởng của Cefotaxime đến tỉ lệ sống và khả năng tái sinh từ mô sẹo phôi hóa của TMS 60444 (theo dõi sau 8 tuần) 55 Bảng 13. Ảnh hưởng của nồng độ OD 600 đến khả năng tiếp nhận gen của mô sẹo phôi hóa 51 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Hình thái cây sắn [47] 3 Hình 2. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 1995 – 2012 [66] 8 Hình 3. Sản lượng sắn (năm 2008) của các nước trên thế giới [65] 9 Hình 4. Các hệ thống đang được sử dụng để thu cây sắn biến đổi gen [59] 24 Hình 5: Tỷ lệ mẫu sống của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau 33 Hình 6: Tỷ lệ mẫu sạch của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau 34 Hình 7. Kết quả thí nghiệm tạo cụm chồi của giống HL 2004-28 sau 28 ngày nuôi cấy 37 Hình 8. Các cụm mô sẹo 2 tuần tuổi trong môi trường CIM 40 Hình 9. Khối mô sẹo của các giống trong môi trường DKW sau 2 tuần nuôi cấy 42 Hình 10. Khối mô sẹo HL 2004-28 (A); KM 140 (B); KM 419 (C) và TMS 60444 (D) ở giai đoạn 8 tuần tuổi tại môi trường MMS 45 Hình 11. Cụm mô sẹo phôi hóa tái sinh 48 Hình 12: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào sắn thông qua A. tumefaciens 50 Hình 13: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD 600 = 0,5 biểu hiện gen GFP. 53 Hình 14: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD 600 = 0,7 biểu hiện gen GFP. 53 Hình 15: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD 600 = 0,25 biểu hiện gen GFP. 54 vi DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu/viết tắt Tên đầy đủ AS Acetosyringone BAP 6-Benzyl amino purin GFP Green Flourescen Protein EC Embryogenic Callus FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations IAA Acid-β-indolacetic NAA Napthanele acetic acid 2,4D Axit 2,4 Diclorophenoxiaxetic ADN Acid deoxiribonucleic Picloram 4-Amino-3,5,6-trichloro-2-pyridinecarboxylic Glufosinate (RS)-2-Amino-4 (hydroxy(methyl)phosphonoyl)butanoic acid MS Murashige and Skoog OD Optical Density w/v Weight per volume 1 MỞ ĐẦU Biến đổi khí hậu làm nhiệt độ trái đất tăng lên, dẫn đến các hiện tượng hạn hán, lũ lụt xảy ra thường xuyên hơn, cùng với dịch bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng và phát triển cũng như năng suất cây trồng. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống của con người, đặc biệt là vấn đề an ninh lương thực, nhất là đối với con người ở những khu vực thường xảy ra thiên tai hoặc có điều kiện tự nhiên không thuận lợi. Trước tình hình đó, việc tạo ra các nguồn giống cây mới, nhất là cây lương thực có năng suất cao, phẩm chất tốt, thích nghi rộng với các điều kiện môi trường, càng trở nên cấp thiết. Công nghệ chọn giống trước đây chủ yếu được tiến hành bằng phép lai giữa các giống có các tính trạng khác nhau để thu được thế hệ con lai có tính trạng mong muốn. Tuy nhiên phương pháp này có những hạn chế nhất định khiến tiềm năng của nó bị giảm sút, chẳng hạn như thế hệ con lai bất thụ, hoặc chỉ giới hạn ở các cá thể cùng loài. Chọn tạo giống sắn bằng phương pháp đột biến cũng được xem là một trong các phương pháp nhằm khắc phục các hạn chế của phương pháp lai tạo nói trên. Hơn thế nữa, trong những năm gần đây, công nghệ sinh học thực vật đã đạt được một số thành tựu khả quan, cho phép các nhà chọn giống tạo ra giống mới có nhiều phẩm chất tốt từ những nguồn gốc khác nhau. Đặc biệt, công nghệ nuôi cấy mô sẹo phôi hóa (ký hiệu EC – embryogenic callus) không những có thể tạo ra những giống cây sạch bệnh, mà còn có thể nghiên cứu phát sinh hình thái phôi vô tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể, tạo cây trồng chuyển gen và bảo quản nguồn gen. Trong lĩnh vực cây lương thực, bên cạnh lúa, ngô và đậu tương, sắn là một loài đóng vai trò quan trọng góp phần ổn định nhu cầu lương thực của con người và giải quyết vấn đề an ninh lương thực trên thế giới, sắn cũng là nguồn nguyên liệu quan trọng cho các ngành công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học. Sắn được trồng nhiều nơi trên thế giới, cũng như ở Việt Nam. Tuy nhiên, do kĩ thuật thâm canh không đồng bộ dẫn đến tình trạng đất đai bị xói mòn, rửa trôi, kết hợp với các điều kiện môi trường không thuận lợi, sâu bệnh ngày càng nhiều, nên sắn có sản lượng thấp và chất lượng suy giảm. Vì vậy, để sản xuất cây sắn một cách bền vững thì cần phải tạo ra 2 được giống sắn sạch bệnh, năng suất cao và phải mang các đặc điểm thích hợp với điều kiện môi trường hiện tại. Nhu cầu về sản lượng sắn ngày càng tăng cao trong khi diện tích trồng sắn ngày càng giới hạn, khiến cho việc tạo giống tăng năng suất, sản lượng và chất lượng sắn củ càng trở nên cấp thiết. Việc sản xuất sắn bằng các giải pháp công nghệ sinh học chính là một trong các phương pháp hiệu quả nhất để giải quyết vấn đề này. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh, phục vụ công tác chuyển gen ở sắn (Manihot esculenta Crantz)” với mục đích nghiên cứu như sau: MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI - Tạo được lượng lớn nguồn nguyên liệu sắn vô trùng, phục vụ cho việc tạo mô sẹo phôi hóa. - Xác định được mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh từ mô sẹo phôi hóa. - Thăm dò khả năng chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa thông qua Agrobacterium tumefaciens. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về mức độ tạo mô sẹo phôi hóa, khả năng tái sinh, khả năng tiếp nhận gen từ Agrobacterium tumefaciens vào mô sẹo phôi hóa của sắn (Manihot esculenta Crantz). Ý nghĩa thực tiễn: Là cơ sở ứng dụng để chuyển gen quan tâm vào cây sắn (M. esculenta Crantz) nhằm tạo ra giống sắn mới có tính trạng mong muốn. Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT. 3 CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây sắn 1. 1. 1. Nguồn gốc và phân loại Cây sắn (Manihot esculanta Crantz) là cây đóng vai trò quan trọng trong kinh tế nông nghiệp của nước ta. Nó không chỉ đóng vai trò cung cấp nguồn thực phẩm cho con người, nguồn thức ăn cho chăn nuôi mà còn là mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ chốt, thu về nguồn ngoại tệ đáng kể cho đất nước [31]. Hình 1. Hình thái cây sắn [47] Tất cả 98 loài thuộc chi Manihot đều sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh đến nhiều khu vực khác nhau trên thế giới. Nguồn gốc thực sự của cây sắn vẫn chưa rõ ràng [14]. Sắn thuộc họ Euphorbiaceae bao gồm 7200 loài, được đặc trưng bởi các hệ thống tuyến mủ do các tế bào tiết mủ tạo thành. Hình thái của họ này rất đa dạng, từ nhóm thân cao như cao su đến nhóm thân bụi, cũng như các nhóm thực vật có giá trị kinh tế cao, như thầu dầu [19]. [...]... có công bố quốc tế về chuyển gen ở sắn tạo giống tăng năng suất và có khả năng kháng bệnh, nhưng chuyển gen ở các đối tượng cây trồng khác cho thấy tiềm năng tạo ra các giống sắn có năng suất và khả năng kháng bệnh cao bằng kĩ thuật biến nạp gen 25 Tại Việt Nam, việc nghiên cứu mô sẹo phôi hóa ở sắn vẫn còn khá hiếm Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tạo mô sẹo và các cấu trúc phôi từ thân và từ... sinh và chuyển gen vào sắn Năm 1996, 3 nhóm nghiên cứu độc lập đồng thời công bố kết quả chuyển gen thành công vào cây sắn (Li và cs, 1996; Raemakers và cs, 1996; Schöpke và cs, 1996) Li và cs đã đưa ra được phương pháp tái sinh hiệu quả cây con từ mô sẹo của cây sắn chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy với Agrobacterium tumefaciens, mở ra hướng mới trong việc cải thiện chất lượng giống sắn và tạo giống... non Hơn nữa, việc tạo thành công mô sẹo phôi hóa cho các giống sắn được trồng tại Việt Nam cho đến nay vẫn chưa được công bố Vì vậy, vấn đề nghiên cứu sự tạo mô sẹo phôi hóa cho giống mô hình TMS 60444 sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa cho các giống sắn Việt Nam 26 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật Ba giống sắn Việt Nam là HL... vitro, cây non có thể được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ Qua đó, cũng có hai phương pháp tương ứng để tái sinh cây con, bao gồm tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng và tái sinh gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo Trong tái sinh trực tiếp, cây con được tạo thành bởi quá... hệ gen của sắn một cách bền vững và lâu dài [56] Hình 4 Các hệ thống đang được sử dụng để thu cây sắn biến đổi gen [59] 24 Hình 4 mô tả 4 hệ thống hiện đang sử dụng để chuyển gen vào sắn [59] Bốn hệ thống này sử dụng 4 loại mô đích khác nhau làm đối tượng chuyển gen: Mô lá chưa trưởng thành, các cấu trúc phôi, mảnh lá mầm, và mô sẹo phôi hóa Mô lá chưa trưởng thành và các cấu trúc phôi chỉ có thể chuyển. .. một khó khăn với công tác tạo giống sắn bằng phương pháp chuyển gen vì lý do các giống sắn phản ứng khác nhau trong điều kiện nuôi cấy in vitro, đặc biệt là trong quá trình tạo mô đích phục vụ biến nạp Do đó, việc nghiên cứu khả năng tái sinh và tạo mô đích phục vụ biến nạp là cần thiết trên các giống sắn triển vọng [41] Một vài thành công của sắn chuyển gen bao gồm nhiều giống sắn mới với các đặc tính... của Schöpke và cộng sự đã thiết lập được quy trình chuyển gen vào cây sắn, thông qua kĩ thuật bắn gen mục tiêu vào mô sẹo nhằm tạo nguyên liệu cho quá trình chọn lọc tế bào mang gen chuyển và tạo cây chuyển gen từ các tế bào này Thử nghiệm với các gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase (nptII) và betaglucuronidase (uidA) và nuôi trong môi trường chọn lọc sau đó phân tích phân tử, nghiên cứu đã chỉ... kiện chiếu sáng 16h/ ngày ở 28°C Tính hệ số kéo dài chồi của các giống nghiên cứu sau 4 tuần nuôi cấy theo công thức sau: 2.2.3 Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa Các cây sắn cao khoảng 8cm được loại bỏ hết lá và cắt thành các đoạn dài 1,5-2 cm và có chứa mắt chồi và đưa vào môi trường CAM chứa BAP 10mg/l để kích thích tạo chồi Sau 2-4 ngày tách chồi nách và chuyển đến môi trường CIM có chứa picloram... các cây chuyển gen trong trường hợp này phải nhân vô tính b Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chuyển gen vào thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium 23 1.7 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo phôi hóa tạo hệ thống tái sinh và. .. các phương pháp công nghệ sinh học [36] Reamakersvà các cộng sự đã tạo được mô sẹo phôi hóa của các giống sắn TMS 60444, Adira 4, Thai 5 and M7, từ đó tạo được cây sắn hoàn chỉnh từ các mô này Đặc biệt, nghiên cứu đã làm giảm đáng kể quá trình hình thành cây từ mô sẹo của giống sắn TMS60444 mang gen chuyển bằng cả 2 kĩ thuật, thông qua hệ thống Agrobacterium tumefaciens và súng bắn gen [48], [49] Trong . tiến hành đề tài: Nghiên cứu mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh, phục vụ công tác chuyển gen ở sắn (Manihot esculenta Crantz) với mục đích nghiên cứu như sau: MỤC. - Tạo được lượng lớn nguồn nguyên liệu sắn vô trùng, phục vụ cho việc tạo mô sẹo phôi hóa. - Xác định được mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh từ mô sẹo phôi hóa. - Thăm dò khả. về mức độ tạo mô sẹo phôi hóa, khả năng tái sinh, khả năng tiếp nhận gen từ Agrobacterium tumefaciens vào mô sẹo phôi hóa của sắn (Manihot esculenta Crantz). Ý nghĩa thực tiễn: Là cơ sở ứng