Nghiên cứu mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh, phục vụ công tác chuyển gen ở sắn (manihot esculenta crantz) (manihot esculenta crantz)

Đến năm 1902, Haberlandt đã đưa học thuyết trên vào thực nghiệm với nỗ lực tạo các phôi nhân từ các tế bào soma từ lá một số cây một lá mầm, tuy nhiên, những thí nghiệm của ông đã thất b

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại Trường

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Đồng và TS Lê Hồng Điệp, những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên làm việc tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào thực vật, Viện

Di truyền Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp

đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong quãng thời gian qua

Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT Tôi xin chân thành biết ơn sự hỗ trợ đó

Hà Nội, tháng 6 năm 2014 Học viên

Tống Thị Hường

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH v

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây sắn 3

1 1 1 Nguồn gốc và phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây sắn 5

1.1.3 Giá trị của cây sắn 7

1.2 Tình hình sản xuất và sử dụng sắn trên thế giới và Việt Nam 8

1.2.1 Trên thế giới 8

1.2.2.Ở Việt Nam 9

1.3 Lịch sử phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

1.4 Nguyên lý và ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

1.4.1 Cơ sở lí thuyết 14

1.4.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro 15

1.4.3 Các hướng ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 16

1.5 Môi trường nuôi cấy tế bào mô thực vật 17

1.5.1 Các chất khoáng 17

1.5.2.Các vitamin 18

1.5.3 Các chất điều hoà sinh trưởng 19

1.6 Các phương pháp chuyển gen ở thực vật 21

1.6.1 Chuyển gen trưc tiếp 21

a Chuyển gen bằng xung điện 21

b Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) 22

c Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (pollen tube) 22

d Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile bombardment biolistics) 22 1.6.2 Chuyển gen gián tiếp 23

a Chuyển gen gián tiếp nhờ virus 23

b Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 23

1.7 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo phôi hóa tạo hệ thống tái sinh và chuyển gen vào sắn 24

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Vật liệu nghiên cứu 27

2.1.1 Mẫu thực vật 27

2.1.2 Vi khuẩn và các vector 27

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch 28

2.2.2 Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm 29

2.2.3 Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 29

2.2.4 Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa 30

2.2.5 Phương pháp biến nạp 31

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Nghiên cứu tạo mẫu sạch 33

3.2 Nghiên cứu thí nghiệm tạo chồi, nhân cụm chồi và kéo dài chồi 36

3.3 Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa từ chồi nách cây sắn 37

3.4 Kết quả tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa của giống TMS 60444 47

3.5 Kết quả chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa của giống TMS 60444 49

KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Diện tích trồng sắn tại Việt Nam (x1000 ha) từ năm 1995 – 2012 [66] 9

Bảng 2 Sản lượng sắn (x 1000 tấn) trồng tại Việt Nam từ 1995 – 2012 [66] 10

Bảng 3.Các nhà máy sản xuất Ethanol và rượu từ sắn của Việt Nam năm 2012 [67] 11 Bảng 4: Khái quát các bước tạo mô sẹo phôi hóa ở sắn 30

Bảng 5 Hệ số của các thí nghiệm tạo cụm chồi, thí nghiệm nhân cụm chồi và thí nghiệm kéo dài chồi 36

Bảng 6 Kết quả tạo mô sẹo từ chồi nách trên môi trường CIM 38

Bảng 7.Đánh giá chất lượng mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trường DKW 40

Bảng 8: Đánh giá tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi ở giai đoạn 28 ngày tuổi tại môi trường DKW 41

Bảng 9 Đánh giá khả năng tạo mô sẹo phôi hóa ở môi trường MMS 43

Bảng 10 Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa của các giống sắn nghiên cứu 46

Bảng 11 Đánh giá khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa 48

Bảng 12 Ảnh hưởng của Cefotaxime đến tỉ lệ sống và khả năng tái sinh từ mô sẹo phôi hóa của TMS 60444 (theo dõi sau 8 tuần) 55

Bảng 13 Ảnh hưởng của nồng độ OD600 đến khả năng tiếp nhận gen của mô sẹo phôi hóa 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Hình thái cây sắn [47] 3Hình 2 Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 1995 – 2012 [66] 8Hình 3 Sản lượng sắn (năm 2008) của các nước trên thế giới [65] 9Hình 4 Các hệ thống đang được sử dụng để thu cây sắn biến đổi gen [59] 24Hình 5: Tỷ lệ mẫu sống của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau 33Hình 6: Tỷ lệ mẫu sạch của các giống sắn nghiên cứu ở các nồng độ NaClO khác nhau 34Hình 7 Kết quả thí nghiệm tạo cụm chồi của giống HL 2004-28 sau 28 ngày nuôi cấy 37Hình 8 Các cụm mô sẹo 2 tuần tuổi trong môi trường CIM 40Hình 9 Khối mô sẹo của các giống trong môi trường DKW sau 2 tuần nuôi cấy 42Hình 10 Khối mô sẹo HL 2004-28 (A); KM 140 (B); KM 419 (C) và TMS 60444 (D)

ở giai đoạn 8 tuần tuổi tại môi trường MMS 45Hình 11 Cụm mô sẹo phôi hóa tái sinh 48

Hình 12: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào sắn thông qua A tumefaciens 50

Hình 13: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD600 = 0,5 biểu hiện gen GFP 53Hình 14: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD600 = 0,7 biểu hiện gen GFP 53Hình 15: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD600 = 0,25 biểu hiện gen GFP 54

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Glufosinate (RS)-2-Amino-4 (hydroxy(methyl)phosphonoyl)butanoic acid

MỞ ĐẦU

Biến đổi khí hậu làm nhiệt độ trái đất tăng lên, dẫn đến các hiện tượng hạn hán,

lũ lụt xảy ra thường xuyên hơn, cùng với dịch bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng và phát triển cũng như năng suất cây trồng Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến đời sống của con người, đặc biệt là vấn đề an ninh lương thực, nhất là đối với con người ở những khu vực thường xảy ra thiên tai hoặc có điều kiện tự nhiên không thuận lợi Trước tình hình đó, việc tạo ra các nguồn giống cây mới, nhất là cây lương thực có năng suất cao, phẩm chất tốt, thích nghi rộng với các điều kiện môi trường, càng trở nên cấp thiết Công nghệ chọn giống trước đây chủ yếu được tiến hành bằng phép lai giữa các giống có các tính trạng khác nhau để thu được thế hệ con lai có tính trạng mong muốn Tuy nhiên phương pháp này có những hạn chế nhất định khiến tiềm năng của nó bị giảm sút, chẳng hạn như thế hệ con lai bất thụ, hoặc chỉ giới hạn ở các cá thể cùng loài Chọn tạo giống sắn bằng phương pháp đột biến cũng được xem là một trong các phương pháp nhằm khắc phục các hạn chế của phương pháp lai tạo nói trên Hơn thế nữa, trong những năm gần đây, công nghệ sinh học thực vật đã đạt được một số thành tựu khả quan, cho phép các nhà chọn giống tạo ra giống mới có nhiều phẩm chất tốt từ những nguồn gốc khác nhau Đặc biệt, công nghệ nuôi cấy mô sẹo phôi hóa (ký hiệu EC – embryogenic callus) không những có thể tạo ra những giống cây sạch bệnh,

mà còn có thể nghiên cứu phát sinh hình thái phôi vô tính, nhân sinh khối tế bào dịch lỏng, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần để tạo giống lai tứ bội thể, tạo cây trồng chuyển gen và bảo quản nguồn gen

Trong lĩnh vực cây lương thực, bên cạnh lúa, ngô và đậu tương, sắn là một loài đóng vai trò quan trọng góp phần ổn định nhu cầu lương thực của con người và giải quyết vấn đề an ninh lương thực trên thế giới, sắn cũng là nguồn nguyên liệu quan trọng cho các ngành công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học Sắn được trồng nhiều nơi trên thế giới, cũng như ở Việt Nam Tuy nhiên, do kĩ thuật thâm canh không đồng bộ dẫn đến tình trạng đất đai bị xói mòn, rửa trôi, kết hợp với các điều kiện môi trường không thuận lợi, sâu bệnh ngày càng nhiều, nên sắn có sản lượng thấp và chất lượng suy giảm Vì vậy, để sản xuất cây sắn một cách bền vững thì cần phải tạo ra

là một trong các phương pháp hiệu quả nhất để giải quyết vấn đề này Chính vì thế,

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mức độ tạo mô sẹo phôi hóa và khả năng

tái sinh cây hoàn chỉnh, phục vụ công tác chuyển gen ở sắn (Manihot esculenta

Crantz)” với mục đích nghiên cứu như sau:

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về

mức độ tạo mô sẹo phôi hóa, khả năng tái sinh, khả năng tiếp nhận gen từ

Agrobacterium tumefaciens vào mô sẹo phôi hóa của sắn (Manihot esculenta Crantz)

Ý nghĩa thực tiễn: Là cơ sở ứng dụng để chuyển gen quan tâm vào cây sắn (M

esculenta Crantz) nhằm tạo ra giống sắn mới có tính trạng mong muốn

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp, với sự hỗ trợ kinh phí từ Bộ Khoa học Công nghệ thông qua Hợp đồng Thực hiện nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo nghị định thư số: 08/2013/HĐ-NĐT

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây sắn

1 1 1 Nguồn gốc và phân loại

Cây sắn (Manihot esculanta Crantz) là cây đóng vai trò quan trọng trong kinh tế

nông nghiệp của nước ta Nó không chỉ đóng vai trò cung cấp nguồn thực phẩm cho con người, nguồn thức ăn cho chăn nuôi mà còn là mặt hàng nông sản xuất khẩu chủ chốt, thu về nguồn ngoại tệ đáng kể cho đất nước [31]

Hình 1 Hình thái cây sắn [47]

Tất cả 98 loài thuộc chi Manihot đều sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh đến nhiều khu vực khác nhau trên thế giới Nguồn gốc thực sự của cây sắn vẫn chưa rõ ràng [14] Sắn thuộc họ Euphorbiaceae bao gồm 7200 loài, được đặc trưng bởi các hệ thống tuyến mủ do các tế bào tiết mủ tạo thành Hình thái của họ này rất đa dạng, từ nhóm thân cao như cao su đến nhóm thân bụi, cũng như các nhóm thực vật có giá trị kinh tế cao, như thầu dầu [19]

Sắn sống tự nhiên ở vùng nhiệt đới, phân bố phổ biến từ 33° vĩ bắc đến 33° vĩ nam Trong số 98 loài đã được mô tả, chỉ có sắn được trồng trên diện rộng vì giá trị kinh tế của chúng Sắn được biết đến với hơn 100 tên gọi khác nhau, phụ thuộc vào địa

lý nơi chúng được trồng Ở Mỹ Latinh, sắn có tên gọi là yuca (theo tiếng Tây Ban Nha) hoặc mandioca (tiếng Bồ Đào Nha), trong khi tại Brazin, chúng được chia thành

2 loại, sắn ngọt (sweet cassava) hay sắn đắng (bitter cassava) theo người trồng [19]

Về nguồn gốc của sắn vẫn chưa khẳng định được chính xác, tuy nhiên, với những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định rằng sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ La-Tinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài người trồng cách đây

5000 năm Trung tâm phát sinh sắn ở Đông Bắc Brazin và một trung tâm khác ở Trung

Mỹ và Mexico Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật củ sắn đã được tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Venezuela, và khoảng 2000 năm trước công nguyên ở vùng ven biển Peru Trong khi đó, những lò nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước công nguyên đã được tìm thấy ở phía Bắc Colombia và những hạt tinh bột có tuổi khoảng năm 900-200 trước công nguyên trong những phần hóa thạch được phát hiện tại Mexico cùng một số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ cây sắn đã xuất hiện và được trồng như một loại cây nông nghiệp từ rất lâu đời [52], [53]

Sắn được người Bồ Đào Nha đưa vào châu Phi lần đầu tiên vào giữa thế kỷ 16 Trải qua thế kỷ 17 phát triển chậm chạp, sắn được du nhập vào đảo Bourbon và Ilede (Pháp) vào các năm 1738-1739, và đưa sang Madagasca vào năm 1875, Xri lanca (1786), Calcutta (1794) và một số nước phía đông châu Phi như Zambiar (1799), Uganda (1878) Ở châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ 17, Việt Nam

và một số nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ 18 [2].Tuy nhiên, mãi đến thế kỷ 19, nghề trồng sắn và tiêu thụ mới thực sự phát triển với sự du nhập các kỹ thuật chế biến ở Brazin bởi các nô lệ được phóng thích Từ đó đến nay, diện tích, năng suất

và sản lượng sắn ngày một tăng [8]

Rễ mọc ra từ hom thì đầu tiên mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống đất

Rễ sắn có hai chức năng chính là đồng hóa và dự trữ Rễ đồng hóa thường cắm sâu trong lòng đất có thể dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp cho cây vững chắc Rễ dự trữ (rễ củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành Khi cây mới ra rễ thì có rất nhiều rễ con nhưng sau đó chỉ một số rễ con được tập trung dinh dưỡng phát triển thành củ Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới 30 cm, có thể

có hoặc không có cuống củ [19]

Thân cây

Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1-3 m Chiều cao của cây phụ thuộc vào giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng Thân sắn có khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của cây Thân và cành già đã hóa gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng Số lượng thân phụ thuộc vào cách đặt hom và số mắt trên hom Về mặt cấu tạo, lớp cắt ngang thân sắn có bốn lớp: trong cùng là lõi xốp, tế bào rất lớn; tiếp đến là tầng gỗ; mô mềm của

vỏ và ngoài cùng là lớp biểu bìrất mỏng Khi nhân vô tính sắn người ta sử dụng các đoạn hom lấy từ thân cây, vì vậy ngoài việc lựa chọn các đoạn hom đẹp, sạch bệnh phải giữ cho lớp biểu bì không bị sây sát vì lớp này có chức năng bảo vệ cho hom không bị mất nước [19], [62]

Lá sắn

Lá sắn là loại lá đơn mọc xen kẽ trên thân, gồm hai phần cuống lá và phiến lá Cuống lá dài từ 3-30 cm với nhiều màu sắc khác nhau tùy theo giống (màu vàng, xanh vàng, hồng, đỏ tươi ) Phiến lá thường chia 5-7 thùy nhưng cũng có khi không chia

thùy Lá của những cây sắn mọc từ hạt thì phiến lá thường nguyên vẹn hoặc chia thùy không đều Các cây mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thùy của phiến lá thường giảm Cấu tạo phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin dày, tầng mô dậu, tầng

mô hổng và biểu bì Mặt dưới có rất nhiều khí khổng đường kính khoảng 30 µm và có khoảng 700 lỗ/mm2 [8], [62]

Hoa sắn

Hoa sắn là hoa đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm, có cuống mọc ra từ chỗ phân cành, ngọn thân Một số giống sắn không có hoa do không có sự phân hóa hoa hoặc do mầm hoa rụng đi Những cụm sinh ra từ những cành thấp thường rụng sớm Cụm hoa gồm một trục dài 2-10 cm và các trục bên hợp lại thành chùy [8], [19]

Hoa cái có năm lá đài và có màu sặc sỡ, ngoài rìa có lông Giữa hoa cái có một bầu hoa có 6 cánh, chứa 3 lá noãn nằm ở trên đài Trên bầu có 3 vòi nhụy ngắn với đầu nhụy uốn cong Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên một nửa chiều dài, nhẵn ở bên trong và có lông ở phía ngoài Có khoảng 8-10 nhị đực xếp thành hai vòng và mọc lên

từ các thùy của một đĩa phía dưới Bao phấn mềm, hạt phấn 3 ngăn, dày dính, màng ngoài hạt phấn có gai nhỏ

Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ phấn Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây Hoa đực thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào nửa cuối buổi chiều

Bao phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở được khoảng 2 giờ và mở hoàn toàn trước khi hoa nở 1 giờ; sau đó phát tán nhờ gió hoặc côn trùng với phạm vi thụ phấn là trong khoảng 30 cm Tuổi thọ của hạt phấn là một tuần còn thời gian tiếp nhận hạt phấn của đầu nhụy trong vòng 24 giờ Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang màu nâu, khô đi và rụng chậm nhất là sau 1 ngày Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ tinh kéo dài từ 8-19 giờ [8], [19]

Quả và hạt

Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1-1,5 cm Quả có 3 ngăn, được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa một hạt Màu sắc quả thường biến đổi từ lục nhạt, hơi vàng đến lục hay đỏ tía khá đậm Cuống quả phình lên ở chỗ tiếp xúc với quả Sau khi chín, quả tự mở chỉ còn lại trục giữa của quả.Hạt sắn hình trứng, tiết diện hơi giống hình tam giác Hạt có vân hoặc những vết màu nâu đỏ trên nền màu kem hoặc xám nhạt [8], [19]

1.1.3 Giá trị của cây sắn

Sắn là một trong 3 cây lương thực quan trọng nhất thế giới bên cạnh gạo và ngô [26] Củ sắn có hàm lượng tinh bột cao với khoảng 84-87% trọng lượng khô, là nguồn cung cấp carbonhydrate cho hơn 500 triệu người ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới cũng như hơn 1 tỷ người trên thế giới.Trong củ sắn cũng có một số loại axit amin chứa lưu huỳnh tuy lượng không nhiều và hàm lượng thấp các protein, chất béo, một số chất khoáng (P, K, Mg, ) và vitamin (B1, B2, ) [22], [25], [30] Tại Châu Á, Châu Phi và

Mỹ Latinh, có khoảng 600 triệu người có cuộc sống phụ thuộc vào cây sắn Ở những khu vực này, cây sắn được coi là cây lương thực xóa đói giảm nghèo quan trọng do là cây trồng phát triển tốt trên đất nghèo dinh dưỡng và có khả năng chịu hạn cao [8] Ở Đông Nam Á, sắn là một nguồn năng lượng chính cho người dân như tại Campuchia, Lào và Myanmar [12].Củ sắn cũng là nguồn thức ăn quan trọng để sản xuất thức ăn chăn nuôi [8]

Lá sắn chứa nhiều chất dinh dưỡng với hàm lượng protein cao hơn trong củ từ 7% trọng lượng tươi và 21-25% trọng lượng khô Hàm lượng lipit ở lá gấp 6 lần ở củ Ngoài ra, lá sắn chứa nhiều canxi, carotene, vitamin B1, vitamin C, nhiều axit amin không thay thế đặc biệt lizin và triptophan nhưng thiếu methionin Lá sắn được ủ chua làm thức ăn cho trâu, bò,… hoặc thức ăn tươi cho cá, tằm,… [35]

6-Bên cạnh vai trò cung cấp tinh bột làm thức ăn cho người và động vật, sắn còn góp phần vào sự đa dạng về kinh tế và tạo cơ hội cho phát triển công nghiệp công nghiệp nhẹ, công nghiệp thực phẩm và nhiên liệu sinh học với hơn 80 quốc gia có khả năng phát triển ngành công nghiệp từ sắn [8], [12] Tinh bột sắn được dùng để sản xuất các loại bánh, kẹo, bột ngọt, mì ăn liền, làm phụ gia dược phẩm và đặc biệt, sắn được

sử dụng làm nguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất cồn sinh học đem lại hiệu suất

và hiệu quả kinh tế cao.Thân sắn dùng để sản xuất nấm, nguyên liệu cho công nghiệp xenlulozơ và nguyên liệu để sản xuất một số sản phẩm khác như màng phủ sinh học, chất giữ ẩm, bao bì và phụ gia dược phẩm [8]

Tại Việt Nam, cây sắn đang được trồng rất rộng rãi và là cây lương thực được xếp vào hàng thứ ba sau lúa và ngô Cây sắn tạo ra lượng tinh bột cao nhất trong các cây lương thực, chủ yếu được sử dụng làm thức ăn cho gia súc, và làm hàng xuất khẩu

có giá trị kinh tế cao

1.2 Tình hình sản xuất và sử dụng sắn trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Trên thế giới

Sắn được trồng trên 100 nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp châu

Á, châu Phi và Mỹ Latin Diện tích, năng suất và sản lượng sắn trên thế giới có chiều hướng gia tăng từ năm 1995 đến 2011 (Hình 2)

Hình 2 Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 1995 – 2011 [66]

Năm 2011, sản lượng sắn thế giới đạt 252,2triệu tấn củ tươi so với 231,76triệu tấn năm 2010 và năm 1995 là 161,79 triệu tấn Nước sản xuất sắn nhiều nhất là Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu tấn) và Indonesia (19,92 triệu

0 50 100 150 200 250 300

tấn) Nước có năng suất sắn cao nhất là Ấn Độ (31,43 tấn/ha), kế đến là Thái Lan (21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân của thế giới là 12,87 tấn/ha Việt Nam đứng thứ mười về sản lượng sắn trên thế giới (9,38 triệu tấn) (hình 3) [65]

Hình 3 Sản lượng sắn (năm 2008) của các nước trên thế giới [65]

1.2.2.Ở Việt Nam

Việt Nam đứng thứ mười về sản lượng sắn trên thế giới (9,38 triệu tấn) Quy

mô trồng sắn ở Việt Nam khá nhỏ, chủ yếu ở vùng núi và trung du, với diện tích trung bình khoảng 0.27 ha/ thửa, trong đó, quy mô tại khu vực Đông Nam Bộ lớn nhất (0,85 ha) trong khi tại khu vực miền núi phía Bắc chỉ khoảng 0,2 ha Ở miền Bắc, sắn được trồng chủ yếu ở các khu vực có địa hình đồi núi và khoảng 68 % diện tích trồng sắn trên đất đá và tương ứng khoảng 12% trên đất cát [2] Ở Nam Việt Nam sắn được trồng chủ yếu trên đất cát xám, có địa hình tương đối bằng phẳng và nghèo chất dinh dưỡng Vùng duyên hải miền Trung và Đông nam bộ chiếm hơn 60% diện tích trồng sắn của toàn bộ khu vực phía nam, trong đó, hơn 30% sắn được trồng ở Tây Nguyên

và các tỉnh Đồng Nai, Bình Phước thuộc khu vực Đông Nam Bộ (Bảng 1)

Bảng 1 Diện tích trồng sắn tại Việt Nam (x1000 ha) từ năm 1995 – 2012 [66]

Sản lượng sắn ở Việt Nam bị suy giảm trong suốt những năm 1980-1990, nhưng trồng sắn đã tăng mạnh trong những năm gần đây (2000-2012) Sản lượng sắn năm 2000 chỉ đạt 1,99 triệu tấn đã tăng gấp 5 lần, đạt 9,74 triệu tấn vào năm 2012 (Bảng 2) Sự nhảy vọt này là do có sự tăng mạnh cả diện tích trồng (từ 237600 ha năm

2000 lên 550600 ha năm 2012) và năng suất (từ 8,66 tấn/ha năm 2000 lên 17,7 tấn/ha năm 2012) Sản lượng sắn ở các vùng miền Trung và khu vực Đông Nam Bộ chiếm đến 78% tổng sản lượng cả nước, đặc biệt là các tỉnh Gia Lai, Kon Tum, Đắk Nông,Đắk Lắk ở Tây Nguyên; Tây Ninh, Đồng Nai, Bình Phước, Bình Thuận ở khu vực Đông Nam Bộ; và các tỉnh Phú Yên,Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định ở khu vực duyên hải miền trung (Bảng 2)

Bảng 2 Sản lƣợng sắn (x 1000 tấn) trồng tại Việt Nam từ 1995 – 2012 [66]

Việt Nam đạt được tiến bộ nhanh trong việc áp dụng công nghệ mới trong chọn tạo và nhân giống cây trồng mới ở châu Á Tiến bộ nàylà kết quả của nhiều yếu tố, trong đó sự thành công trong lai tạo giống và ứng dụng công nghệ mới là những yếu tố góp phần chính Sự kết hợp giữa sản xuất trên diện rộng và phát triển các ngành công nghiệp chế biến tinh bột và ethanol đã tạo ra nhiều công ăn việc làm, tăng xuất khẩu, thu hút đầu tư nước ngoài và góp phần công nghiệp hóa và hiện đại hóa một số khu vực nông thôn Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN & PTNT) đã có kế hoạch duy trì diện tích sắn khoảng 450000 ha 2011-2015, và những nỗ lực đang được thực hiện để tăng năng suất củ tươi 16,9-20 tấn/ha vào năm 2011 và 23-24 tấn/ha vào năm 2015 bằng cách sử dụng công nghệ mới, đặc biệt là trong lai tạo (Bộ NN & PTNT 7256/TB-BNN-VP 25/12/2009) [26]

Việt Nam gần đây đã phát triển một chính sách E10 mà sẽ yêu cầu sản xuất từ

100 đến 150 triệu lít mỗi năm Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm 2025", nhằm mục đích để sản

xuất nhiên liệu sinh học và một phần thay thế nhiên liệu truyền thống Điều này sẽ đóng góp vào an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường Dầu khí Việt Nam có kế hoạch xây dựng ba nhà máy sắn dựa trên ethanol ở miền Bắc (Phú Thọ), miền Trung (Quảng Ngãi) và miền Nam Việt Nam (Bình Phước) với tổng công suất hàng năm dự kiến khoảng 300 triệu lít mỗi năm (Bảng 3) Sự kết hợp rộng rãi giữa sản xuất sắn tươi, chế biến sắn tinh bột và sản xuất ethanol đã tạo ra nhiều công ăn việc làm, tăng xuất khẩu, thu hút đầu tư nước ngoài, góp phần công nghiệp hóa và hiện đại hóa một

số khu vực nông thôn [68]

Bảng 3.Các nhà máy sản xuất Ethanol và rƣợu từ sắn của Việt Nam năm 2012 [67]

Công suất (triệu lít/ năm)

1.3 Lịch sử phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật được khởi nguồn từ học thuyết tế bào, được nêu bởi Schleiden và Schwan vào năm 1983 Đến năm 1902, Haberlandt đã đưa học thuyết trên vào thực nghiệm với nỗ lực tạo các phôi nhân từ các tế bào soma từ lá một số cây một lá mầm, tuy nhiên, những thí nghiệm của ông đã thất bại bởi các cây một lá mầm rất khó nuôi cấy và các tế bào này đã mất khả năng tái sinh Sau đó, Kotte

và Robins (năm 1922)đã lặp lại thí nghiệm này với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ Thành công bước đầu của thí nghiệm này đã mở ra giai đoạn phát triển mạnh mẽ của công nghệ nuôi cấy mô tế bào với thành công của White(1934) khi nuôi cấy thành công rễ cây cà chua

(Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước

chiết nấm men Sau đó, White đã thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại

làacid-β-Giai đoạn 1941-1957 là thời kì phát triển mạnh của các chất điều hòa sinh trưởng, khởi đầu là phát hiện tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi họ cà và cà rốt [11] Nhiều chất sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin được nghiên cứu và tổng hợp thành công như α-napthil acetic acid (NAA) và 2,4-dichloro phenoxy acetic (2,4-D), giúp cho việc tạo mô sẹovà phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật trước đây rất khó nuôi cấy, tạo ra những bước tiến rất quan trọng cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy mô, tế bào Năm 1955, kinetin đầu tiên là 6-furfurylaminopurine được phân lập, gộp với các chất có hoạt tính tương tự được phát hiện sau này thành nhóm cytokinin với chất đầu tiên được tách từ thực vật bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô [15], [40], [58].Năm 1962, Skoog và Murashige công

bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỉ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với việc hình thành các cơ quan của mô sẹo thuốc lá và được xác nhận trên nhiều cây khác nhau [43] Thành công của Skoog và Murashige dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô thực vật [16]

Trong thời gian từ 1954 đến 1959, kĩ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, được phát triển bởi Muir, Hildebrandt và Riker; Nickell (1956); Melches và Beckman (1959) Năm 1960, Bergman đã thu được một huyền phù không có tế bào dính cụm mà gồm hầu hết là tế bào đơn có khả năng sống, phân chia và tái tạo mô sẹo Cùng với Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong việc tạo dựng được một cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh tính toàn năng của tế bào thực vật Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trong các bình lên men dùng trong công nghiệp vi sinh và khả năng tái tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra những triển vọng mới trong việc tạo dòng tế bào đột biến, các dòng tế bào siêu sản xuất (over-production) một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao [32]

Năm 1960, Cooking đã dùng cellulase để phân hủy vỏ cellulose của vỏ tế bào thực vật, thu protoplast, mở đầu cho các kĩ thuật lai và dung hợp tế bào vào những năm 1970 [20] Bên cạnh đó, khả năng biến nạp của tế bào thực vật được đề xuất vào năm 1965 cho dù chúng gây ra nhiều tranh cãi về khả năng xâm nhập và biểu hiện cũng như tồn tại lâu dài của ADN ngoại lai Nhờ các plasmid, hàng loạt gene ngoại lai được chuyển vào nhiều họ thực vật Các phương pháp để đưa gene ngoại lai vào tế bào thực vật cũng trở nên đa dạng với những kĩ thuật hiện đại như sử dụng điện (electroporation), kĩ thuật vi tiêm (microinjection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), sử dụng súng bắn gene (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới ứng dụng và phát triển bên cạnh kĩ thuật chuyển gen truyền thốngbằng vi khuẩn

Agrobacterium [16]

Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân giống cây trồng và phục tráng cây trồng với thí nghiệm của Morel (1960) trên các loài địa lan (Cymbidium) Với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel có thể phục tráng, tạo các dòng vô tính không bị nhiễm bệnh virus Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị với khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và hàng loạt cây trồng có giá trị kinh tế cao như chuối, cà phê, cọ dầu, sắn, khoai tây, cây ăn quả có múi và đã có những đóng góp to lớn cho nông nghiệp thế giới

Hiện nay, công nghệ nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học

và vào nghiên cứu lí luận di truyền thực vật bậc cao Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn độc trong môi trường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin, chất sinh trưởng, nguồn cacbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng là những tiền đề được chuẩn bị trong giai đoạn trước

Ở Việt Nam, nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại Mặc dù còn rất nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên cứu để giải quyết trong những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi thai của nó và đang chuẩn bị những đóng góp tích cực vào lí luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn nông nghiệp

vô cùng lớn [42]

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực chất là kết quả của các

quá trình biệt hóa và phản biệt hóa Tất cả tế bào trong cơ thể thực vật đều bắt nguồn

từ tế bào phôi sinh Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào Ngược lại với quá trình biệt hóa, phản biệt hóa là quá trình tế bào đã phân hóa chuyển ngược về dạng phôi sinh và tái phân chia.Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi nằm trong khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy

ra theo một quá trình định sẵn [9]

Trong môi trường nuôi cấy phù hợp, có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, tế bào soma được kích thích giải biệt hóa thành tế bào toàn năng và phân chia tế bào tạo thành cụm mô sẹo Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa Sự phát sinh mô sẹo phụ thuộc chủ yếu vào tình trạng sinh lí của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy Sau khi tế bào phân chia và tăng sinh khối, quá trình biệt hóa bắt đầu và có sự xuất hiện các con đường trao đổi chất

dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học [17] Sự biệt hóa tế bào hình thành chất liệu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây, hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm sự tạo nên chồi và rễ [29]

Khả năng hình thành chồi phụ thuộc vào số lần cấy chuyền và hàm lượng các chất điều hòa sinh trưởng, trong đó, tỷ lệ cytokinin/auxin từ 10–100 đóng vai trò quyết định GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột, cần thiết trong hình thành chồi, tuy nhiên sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên môi trường không có chất kích thích sinh trưởng hoặc có cytokinin và không có auxin Ngược lại, quá trình tạo rễ cần auxin, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng Để tạo ra rễ thường dùng phlorolgucinol + IBA có hiệu quả hơn chỉ dùng auxin [6]

1.4.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro

Phương pháp nuôi cấy mô – tế bào có những ưu điểm đáng lưu ý như (1) Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao; (2) tạo được cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng

đã chọn lọc; (3) Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao; (4) Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội); (5) Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen; (6) Có khả năng sản xuất quanh năm; (7) Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém và (8) Hệ số nhân giống cực kì cao (thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36-1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà.Trong công tác giống cây trồng, vấn

đề chất lượng và số lượng giống được quan tâm hàng đầu Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus bởi (1) Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng thâm nhập; (2) Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus và (3) Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus[16], [17]

Tuy nhiên, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô – tế bào cũng có những nhược điểm nhất định, trong đó yêu cầu trang thiết bị đắt tiền và kĩ thuật cao, nên thường chỉ được áp dụng đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác Hơn nữa, cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm

sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm cũng là một trở ngại lớn Bên cạnh đó, khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền mô sẹo hay huyền phù tế bào nhiều lần và cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt trong quá trình chuyển cây ra thực địa Phương pháp nuôi cấy mô-tế bàođang được sử dụng để phục vụ cho những mục đích nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo, các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh và nhiều giống cây kinh tế khác

1.4.3 Các hướng ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong nhân giống in vitro, cây non có thể được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng

có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ Qua đó, cũng có hai phương pháp tương ứng để tái sinh cây con, bao gồm tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng và tái sinh gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo Trong tái sinh trực tiếp, cây con được tạo thành bởi quá trình phát động những điểm sinh trưởng đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây Các điểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài Cây con tạo ra theo con đường này hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tính trạng của cây mẹ Ngược lại, tái sinh gián tiếp không tạo thành cây ngay mà thông qua quá trình phát triển thành khối mô sẹo Hệ số nhân của hướng này vô cùng lớn bởi từ một khối mô sẹo có thể tạo

ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn thông qua kĩ thuật tạo phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhân tạo Tuy nhiên, nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền do quá trình phát sinh và phát triển của mô sẹo thường xuất hiện đột biến gen, gây ra bởi hiện tượng nội nguyên phân, là hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng những đặc tính di truyền trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống Ngoài việc cung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lí tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen

Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã chọn lọc người ta thường tái sinh cây theo hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là tạo ra nhiều biến dị để phục vụ cho việc chọnlọc và cải tạo giống cây trồng [3]

1.5 Môi trường nuôi cấy tế bào mô thực vật

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quyết định tăng trưởng, phát triển và biệt hóa của

tế bào – mô thực vật Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn cacbon, các vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng.Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu

cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA, …) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch trích nấm men…Tuy vậy, một số thành phần không thể thiếu trong mỗi môi trường nuôi cấy, bao gồm nước, chất khoáng, nguồn hidrocacbon và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Tất cả các thành phần này đều

có vai trò cực kì quan trọng, tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro [23]

Trong môi trường, các muối khoáng được chia thành các nguyên tố vi lượng và

đa lượng Các nguyên tố này là rất cần thiết cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/L nitrate và potassium Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy nguồn N cung cấp trong môi trường dưới cả 2 dạng nitrate và amonium (2-20 mmol/L) là tốt hơn cả Trong trường hợp chỉ dùng amonium,

thì cần phải bổ sung thêm một acid dạng mạch vòng (cycle acids), tricarboxylic acid hoặc một số acid khác nữa (dạng muối), như: citrate, succinate, hoặc malate sao cho mọi ảnh hưởng độc do nồng độ của amonium vượt quá 8 mmol/L trong môi trường được giảm bớt Khi các ion nitrate và amonium cùng hiện diện trong môi trường nuôi cấy, thì ion sau được sử dụng nhanh hơn Các nguyên tố khác, đóng vai trò vi lượng như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1-3 mmol/L [50]

1.5.2.Các vitamin

Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu Do đó, để mô có sức sinh trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin Các vitamin là rất cần thiết cho các phản ứng sinh hoá Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng Thực vật cần vitamin

để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô dược nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố hạn chế sự phát triển của chúng Các vitamin

được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol Thiamin với nồng độ biến thiên từ 0,1-10 mg/l là yếu

tố thiết yếu cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào Acid nicotinic và pyridoxine thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhưng cũng không cấn thiết cho sự tăng trưởng của tế bào nhiều loài thực vật Acid nicotinic thường được sử dụng với nồng

độ 0,1-5 mg/l, và pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1-10 mg/l Myo-inositol mặc

dù có bản chất là một carbohydrate nhưng có vai trò quan trọng, kích thích cho sự tăng trưởng của tế bào đa số loài thực vật Myo-inositol được phân tách ra thành acid ascorbic và peptine và được đồng hóa thành phosphoinositide và phosphatidylinositol

có vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào Myo-inositol thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ 50-5000 mg/l Một số vitamin, đặc biệt là nicotinic axit (vitamin B3), canxi pantothenate (vitamin B5) và biotin thường xuyên được sử dụng để nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy.Các vitamin khác như acid folic, acid ascorbic, panthothenic acid, vitamin E (tocopherol), riboflavin và p-aminobenzoic acid cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy khi nồng độ thiamin thấp và có vai trò kích thích sự sinh trưởng của thực vật trong giai đoạn khởi đầu nuôi cấy [12], [60]

1.5.3 Các chất điều hoà sinh trưởng

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết

để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho

mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây:

a Nhóm các auxin

Auxin là nhóm các hormone sinh trưởng thực vật có các hoạt tính kích thích phân chia tế bao như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn Auxin có tác dụng hoạt hóa các ion H+

trực tiếp hoặc gián tiếp (thông qua sự ảnh hưởng lên các enzyme) làm tăng tính đàn hồi của thành tế bào, tăng tính giản nỡ của tế bào trong phản ứng với áp suất trương.Vai trò chủ yếu của auxin là kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích thích sinh trưởng ở chồi đỉnh đồng thời gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên và kích thích

sự phân hoá của các mô dẫn (xylem and phloem) Auxin có các ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường

Auxin cũng có ảnh hưởng ở mức độ biểu hiện gen và kích thích quá trình tạo rễ Các auxin có thể là auxin tự nhiên hoặc tổng hợp, thường được dùng trong nuôi cấy

mô và tế bào để kích thích sự phân bào và sinh trưởng của mô sẹo (đặc biệt là 2,4-D và picloram), tạo phôi vô tính, tạo rễ,… Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào

và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với các cytokinin

Các auxin liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy

mô, auxin đã được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ Những auxin dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA (3-indolebutiric axid), IAA (3-indole acetic axid), NAA (Napthaleneaxetic axid), 2,4-D (2,4-D-Dichlorophenoxyaxetic axid),

chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi 2,4-D, picloram và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển mô sẹo Auxin thường hòa tan trong etanol hoặc NaOH pha loãng Picloram thường được sử dụng để cảm ứng và duy trì mô sẹo hoặc huyền phù tế bào của các loại cây lá rộng hoặc để cảm ứng sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi Picloram có hiệu quả đối với biên độ các kiểu di truyền rộng hơn [16], [17], [23], [24], [60]

và protein trong các mô nhất định.Trong nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia

tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ Chức năng chủ yếu của các cytokinin được khái quát như kích thích phân chia tế bào, tạo và nhân mô sẹo, làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào, ức chế sự hình thành rễ và ức chế quá trình già (hoá vàng

và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục [21], [28], [39]

Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin) và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino)purine (zeatin) Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Một số hợp chất được phát hiện trong thời gian gần đây có hoạt tính giống cytokinin là N,N’-diphenylurea (DPU), thidiaziron, N-2-chloro-4-puridyl-N-phenyl urea (CPPU) và một số dẫn xuất khác của diphenyl urea [37], [55]

Kinetin là một cytokinin được phân lập từ chế phẩm ADN cũ hoặc nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt độ cao hay đun sôi, có vai trò kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin) ở các mô không phân hóa Một hormone phân bào khác, được tinh chế và cho kết tinh thành

công từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô được gọi là zeatin.Tương tự các cytokinin khác, zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin Trong thực tiễn nuôi cấy mô người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì giá thành rất đắt, thường thay thế zeatin bằng kinetin hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo khác, đó là: - 6-Benzylaminopurine (BAP): Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi chất Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi [28], [40]

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo mô sẹo và

rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách Vấn đề quan trọng không kém là nồng độ của hai nhóm chất điều khiển sinh trưởng này Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng độ 5,0 ppm kích thích sự tạo

thành mô sẹo ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng độ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo chồi

1.6 Các phương pháp chuyển gen ở thực vật

Kỹ thuật chuyển gen đã và đang trở thành nhân tố quan trọng trong chương trình chọn tạo giống cây trồng Có thể chia nguyên lý chuyển gen làm 2 cách: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp

1.6.1 Chuyển gen trưc tiếp

a Chuyển gen bằng xung điện

Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trường cực mạnh Khi đặt các tế bào trần (protoplast) trong điện trường, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên sinh bị thay đổI, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng dẫn tới

sự hình thành lỗ hổng trên màng tế bào Một loạt các lỗ hổng trên màng tế bào được hình thành tuỳ thuộc vào điện trường, làm cho DNA bên ngoài môi trường được truyền qua lỗ hổng vào tế bào

Môt số tế bào thực vật có thể tiếp thụ DNA nhờ xung điện mà không cần xử lý trước như tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì Zang và cs,(1988) đưa ra cây lúa chuyển

gen từ tế bào trần sử dụng phương pháp xung điện [6] Sau một năm shimamoto và cs, (1989) đưa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên ở giống lúa japonica sử dụng phương pháp xung điện [6]

b Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)

Người ta sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng nhỏ DNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn Phương pháp này có ưu điểm là DNA đưa vào tế bào một cách chính xác, thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được Phương pháp này cần có thiết bị có độ chính xác cao, thao tác khéo léo, kỹ thuật

và kỹ năng của người thực hiện phải chính xác

c Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (pollen tube)

Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ nẩy mầm và hình thành ống phấn Lúc này tiêm gen mong muốn đi theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang gen chuyển vào Phương pháp này khá thành công, Đặc biệt trên cây lúa và cây bông

d Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile bombardment biolistics)

Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou và cs, (1991) và kỹ thuật này đươc cải tiến bởi Cao va cs, (1992); Li và cs, (1996) [36] Ngay lập tức, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển gen lúa japonica Gần đây kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen cũng đã được áp dụng thành công với các giống lúa indica và nhiều giống japonica (Christou và cs, 1998; Datta và

cs, 1999 [6] Cheng và cs (1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào lúa Japonica sử dụng súng bắn gen [6]

Đây là kỹ thuât tương đối hiện đại và có hiệu quả Khi sử dụng thiết bị (súng bắn gen) tạo được áp lực sẽ đẩy viên đạn được làm bằng kim loại trơ (vàng, tungsten, wolfram) đã bọc plasmid mang gen đã thiết kế, có kích thước vào khoảng 1μm, với vận tôc 130 m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen của tế bào chủ

Hiệu quả chuyển gen vào lúa bằng phương pháp dùng súng bắn gen không những không phụ thuộc vào kiểu gen mà tần suất lại cao Ở một vài trường hợp, tần

suất chuyển gen bằng phương pháp này ngang bằng với tần suất chuyển gen với cây hai lá mầm

1.6.2 Chuyển gen gián tiếp

a Chuyển gen gián tiếp nhờ virus

Đối với việc chuyển gen vào thực vật thì virus thực vật cũng được coi như là một vectơ Virus làm vectơ chuyển gen phải có các tiêu chuẩn sau:

- Bộ gen có cấu trúc DNA

- Có độ thiệt hại thấp hoặc không hại

- Phổ ký chủ rộng

- Có khả năng tải

- Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào

Có hai loại virus đảm nhận được vai trò làm vectơ chuyển gen là:

* Cauliflower Mosaic Virus (CaMV): virus hại cây họ cải đặc biệt là suplơ DNA ngoại lai được đưa vào tế bào thực vật nhờ sự lây nhiễm lá bởi virus Các CaMV

có thể nhân lên trong bào tương một cách độc lập, không gây trở ngại cho tế bào vật chủ [1] Song vectơ CaMV có một số hạn chế:

- Phổ ký chủ không rộng (chỉ ở các cây họ cải)

- Lượng DNA ngoại lai gắn vào ít, chỉ khoảng 250bp

* Genini virus:

- Có phổ ký chủ rộng: cây một lá mầm, hai lá mầm

- Có nhược điểm lớn là hầu như không truyền được qua hạt Do đó muốn nhân các cây chuyển gen trong trường hợp này phải nhân vô tính

b Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chuyển gen vào thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens được xem là

phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa vào khả năng

chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium

Li và cs đã đưa ra được phương pháp tái sinh hiệu quả cây con từ mô sẹo của cây sắn

chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy với Agrobacterium tumefaciens, mở ra hướng mới

trong việc cải thiện chất lượng giống sắn và tạo giống mới, thông qua các phương pháp công nghệ sinh học [36] Reamakersvà các cộng sự đã tạo được mô sẹo phôi hóa của các giống sắn TMS 60444, Adira 4, Thai 5 and M7, từ đó tạo được cây sắn hoàn chỉnh từ các mô này Đặc biệt, nghiên cứu đã làm giảm đáng kể quá trình hình thành cây từ mô sẹo của giống sắn TMS60444 mang gen chuyển bằng cả 2 kĩ thuật, thông

qua hệ thống Agrobacterium tumefaciens và súng bắn gen [48], [49] Trong khi đó,

phương pháp của Schöpke và cộng sự đã thiết lập được quy trình chuyển gen vào cây sắn, thông qua kĩ thuật bắn gen mục tiêu vào mô sẹo nhằm tạo nguyên liệu cho quá trình chọn lọc tế bào mang gen chuyển và tạo cây chuyển gen từ các tế bào này Thử

nghiệm với các gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase (nptII) và glucuronidase (uidA) và nuôi trong môi trường chọn lọc sau đó phân tích phân tử,

beta-nghiên cứu đã chỉ ra rằng, DNA ngoại lai có thể tồn tại trong hệ gen của sắn một cách bền vững và lâu dài [56]

Hình 4 Các hệ thống đang được sử dụng để thu cây sắn biến đổi gen [59]

Hình 4 mô tả 4 hệ thống hiện đang sử dụng để chuyển gen vào sắn [59] Bốn hệ thống này sử dụng 4 loại mô đích khác nhau làm đối tượng chuyển gen: Mô lá chưa trưởng thành, các cấu trúc phôi, mảnh lá mầm, và mô sẹo phôi hóa Mô lá chưa trưởng

thành và các cấu trúc phôi chỉ có thể chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

trong khi đó mảnh lá mầm hay mô sẹo phôi hóa có thể sử dụng thêm súng bắn gen để chuyển gen Sau khi chuyển gen, mô đích được tái sinh trên môi trường chọn lọc để tạo cây hoàn chỉnh mang gen cần chuyển Các đánh giá phân tích cả 4 hệ thống chuyển gen cho thấy mỗi hệ thống trên đều có những ưu, nhược điểm riêng Mặc dù vậy, các

nhà khoa học thường ưu tiên lựa chọn phương pháp chuyển gen sử dụng A tumefaciens thay vì súng bắn gen vì lí do sử dụng A tumefaciens có chi phí thấp hơn

và cho kết quả ổn định hơn Khoảng 50% số cây chuyển gen thu được thông qua A tumefaciens chỉ mang 1 bản gen cần chuyển trong khi con số này chỉ là 10% khi sử

chuyển gen vì lý do các giống sắn phản ứng khác nhau trong điều kiện nuôi cấy in vitro, đặc biệt là trong quá trình tạo mô đích phục vụ biến nạp Do đó, việc nghiên cứu

khả năng tái sinh và tạo mô đích phục vụ biến nạp là cần thiết trên các giống sắn triển

vọng [41]

Một vài thành công của sắn chuyển gen bao gồm nhiều giống sắn mới với các đặc tính khác nhau như: giảm hàm lượng cyanua [57], kháng sâu [34], tỉ lệ amylose thấp [33], kháng thuốc trừ cỏ [54] Mặc dù chưa có công bố quốc tế về chuyển gen ở sắn tạo giống tăng năng suất và có khả năng kháng bệnh, nhưng chuyển gen ở các đối tượng cây trồng khác cho thấy tiềm năng tạo ra các giống sắn có năng suất và khả năng kháng bệnh cao bằng kĩ thuật biến nạp gen

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu mô sẹo phôi hóa ở sắn vẫn còn khá hiếm Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tạo mô sẹo và các cấu trúc phôi từ thân và từ các mảnh lá non Hơn nữa, việc tạo thành công mô sẹo phôi hóa cho các giống sắn được trồng tại Việt Nam cho đến nay vẫn chưa được công bố Vì vậy, vấn đề nghiên cứu sự tạo mô sẹo phôi hóa cho giống mô hình TMS 60444 sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa cho các giống sắn Việt Nam

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Ba giống sắn Việt Nam là HL 2004-28, KM 140, KM 419 và giống sắn mô hình TMS 60444 được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu Các giống sắn được sử dụng để nghiên cứu có thời gian nuôi cấy trong ống nghiệm khoảng 6 tuần

2.1.2 Vi khuẩn và các vector

- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α làm vật nhận plasmid pzy101-Asc:35s:GFP

- Chủng vi khuẩn A tumefaciens LBA 4404 – AA3 có chứa plasmid Asc:35s:GFP mang gen chỉ thị GFP, (plasmid, vi khuẩn A tumefaciens LBA 4404 – AA3 và vi khuẩn E.coli DH5α do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp)

Sơ đồ vector pZY101:35S:GFP

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Các loại môi trường nuôi cấy mô sẹo được cải tiến dựa trên các loại môi trường

có trong nghiên cứu của Zainuddin và cs, 2012 [65]

- CAM: MS + vitamin + 2% saccharose + 1% agar (w/v) + CuSO4 2mM + 0,1% BAP (w/v)

- CIM: MS + vitamin + 2% saccharose (w/v) + 1% agar (w/v) + CuSO4 2mM + 12mg/l picloram

- DKW: Hỗn hợp muối bazo + 2% saccharose (w/v) + 1% agar (w/v) + CuSO4 2mM + vitamin + 12mg/l picloram

- MMS: 1/10 MS + vitamin + 2% saccharose (w/v) + 1% agar(w/v) + 12mg/l picloram

- MSN: MS + vitamin + 2% saccharose (w/v) + 2mM CuSO4 + 1% agar (w/v) +

1 mg/l NAA

- CEM: MS + vitamin + 2% saccharose (w/v) + 2mM CuSO4 + 1% agar (w/v) + 0,04% BAP (w/v)

- MS: Pha theo công thức của Murashige và Skoog, 1962

- Môi trường nuôi khuẩn (YEB): Bactopeptone 10g/l, Yeast extract 5g/l, NaCl 10g/l (môi trường đặc thêm agar 15g/l)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch

Cắt những đoạn thân non dài 1,5 – 2 cm và có chứa chồi nách, rửa bằng xà phòng dưới vòi nước chảy để loại bớt các vi sinh vật trên bề mặt thân Cho các đoạn thân vào bình tam giác và tiến hành khử trùng trong box cấy vô trùng

Đầu tiên rửa đoạn thân bằng nước cất vô trùng Sau đó khử trùng bề mặt của đoạn thân bằng cồn 70% trong vòng 30 giây và rửa sạch bằng nước cất vô trùng từ 3 -

5 lần Tiếp theo khử trùng bằng Javen (NaClO) ở nồng độ thí nghiệm là 0,5%, 0,7% và 1% trong khoảng thời gian 15 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi dùng que cấy

vô trùng lấy các đoạn thân cấy vào môi trường MS

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần 5 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 đoạn thân dài khoảng 1,5-2 cm và có chứa mắt chồi

2.2.2 Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm

- Tạo cụm chồi:Cây sắn hoàn chỉnh được loại bỏ hết lá, sau đó cắt thành các

đoạn từ 2-3 cm, mỗi đoạn cắt gồm một đến hai mắt chồi, vị trí cắt ở phía trên mắt chồi cách mắt chồi 0,2-0,5 cm Các đoạn cắt được cấy trong môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 3 mg/l BAP với điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày ở 28°C

- Chỉ tiêu theo dõi : dựa vào hệ số tạo cụm chồi của mỗi giống sau 4 tuần nuôi cấy được tính theo công thức sau:

- Nhân cụm chồi: Tách các chồi đơn từ cụm chồi và cấy vào môi trường MS +

1mg/l BAP + 20g/l đường với điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày ở 280 C Tính theo công thức tương tự công thức của hệ số tạo cụm chồi sau 3 tuần nuôi cấy

- Kéo dài cụm chồi: Chuyển cụm chồi của các giống đã được hình thành ở các

thí nghiệm trên vào môi trường MS cơ bản (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 0,2mg/l GA3, không agar với điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày ở 28°C Tính hệ số kéo dài chồi của các giống nghiên cứu sau 4 tuần nuôi cấy theo công thức sau:

2.2.3 Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa

Các cây sắn cao khoảng 8cm được loại bỏ hết lá và cắt thành các đoạn dài 1,5-2

cm và có chứa mắt chồi và đưa vào môi trường CAM chứa BAP 10mg/l để kích thích tạo chồi Sau 2-4 ngày tách chồi nách và chuyển đến môi trường CIM có chứa picloram 12 mg/l để cảm ứng tạo mô sẹo Khối mô sẹo 2 – 4 tuần tuổi được loại bỏ dịch nhày, tách nhỏ, và chuyển đến môi trường DKW có chứa picloram 12 mg/l để