b. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
1.7. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo phôi hóa tạo hệ thống tái sinh và
chuyển gen vào sắn
Năm 1996, 3 nhóm nghiên cứu độc lập đồng thời công bố kết quả chuyển gen thành công vào cây sắn (Li và cs, 1996; Raemakers và cs, 1996; Schöpke và cs, 1996). Li và cs đã đưa ra được phương pháp tái sinh hiệu quả cây con từ mô sẹo của cây sắn chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy với Agrobacterium tumefaciens, mở ra hướng mới trong việc cải thiện chất lượng giống sắn và tạo giống mới, thông qua các phương pháp công nghệ sinh học [36]. Reamakersvà các cộng sự đã tạo được mô sẹo phôi hóa của các giống sắn TMS 60444, Adira 4, Thai 5 and M7, từ đó tạo được cây sắn hoàn chỉnh từ các mô này. Đặc biệt, nghiên cứu đã làm giảm đáng kể quá trình hình thành cây từ mô sẹo của giống sắn TMS60444 mang gen chuyển bằng cả 2 kĩ thuật, thông qua hệ thống Agrobacterium tumefaciens và súng bắn gen [48], [49]. Trong khi đó,
phương pháp của Schöpke và cộng sự đã thiết lập được quy trình chuyển gen vào cây sắn, thông qua kĩ thuật bắn gen mục tiêu vào mô sẹo nhằm tạo nguyên liệu cho quá trình chọn lọc tế bào mang gen chuyển và tạo cây chuyển gen từ các tế bào này. Thử nghiệm với các gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase (nptII) và beta- glucuronidase (uidA) và nuôi trong môi trường chọn lọc sau đó phân tích phân tử, nghiên cứu đã chỉ ra rằng, DNA ngoại lai có thể tồn tại trong hệ gen của sắn một cách bền vững và lâu dài [56].
Hình 4 mô tả 4 hệ thống hiện đang sử dụng để chuyển gen vào sắn [59]. Bốn hệ thống này sử dụng 4 loại mô đích khác nhau làm đối tượng chuyển gen: Mô lá chưa trưởng thành, các cấu trúc phôi, mảnh lá mầm, và mô sẹo phôi hóa. Mô lá chưa trưởng thành và các cấu trúc phôi chỉ có thể chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
trong khi đó mảnh lá mầm hay mô sẹo phôi hóa có thể sử dụng thêm súng bắn gen để chuyển gen. Sau khi chuyển gen, mô đích được tái sinh trên môi trường chọn lọc để tạo cây hoàn chỉnh mang gen cần chuyển. Các đánh giá phân tích cả 4 hệ thống chuyển gen cho thấy mỗi hệ thống trên đều có những ưu, nhược điểm riêng. Mặc dù vậy, các nhà khoa học thường ưu tiên lựa chọn phương pháp chuyển gen sử dụng A. tumefaciens thay vì súng bắn gen vì lí do sử dụng A. tumefaciens có chi phí thấp hơn
và cho kết quả ổn định hơn. Khoảng 50% số cây chuyển gen thu được thông qua A. tumefaciens chỉ mang 1 bản gen cần chuyển trong khi con số này chỉ là 10% khi sử
dụng súng bắn gen.
Năm 2009, Bull và cộng sự phát triển phương pháp cải tiến kết hợp sử dụng A.
Tumefaciens để chuyển gen vào phôi mô sẹo phôi hóa cho tần suất biến nạp và tái sinh cây chuyển gen cao hơn hẳn các phương pháp cũ. Cho đến nay, phương pháp này vẫn là phương pháp được sử dụng phổ biến để chuyển gen mong muốn vào cây sắn [18].
Cũng như chọn tạo giống ở các cây trồng khác, một trong các vấn đề quan trọng đối với chọn giống sắn là làm sao tích hợp được gen đích mong muốn vào một nguồn gen phù hợp. Đây cũng là một khó khăn với công tác tạo giống sắn bằng phương pháp chuyển gen vì lý do các giống sắn phản ứng khác nhau trong điều kiện nuôi cấy in vitro, đặc biệt là trong quá trình tạo mô đích phục vụ biến nạp. Do đó, việc nghiên cứu
khả năng tái sinh và tạo mô đích phục vụ biến nạp là cần thiết trên các giống sắn triển vọng [41].
Một vài thành công của sắn chuyển gen bao gồm nhiều giống sắn mới với các đặc tính khác nhau như: giảm hàm lượng cyanua [57], kháng sâu [34], tỉ lệ amylose thấp [33], kháng thuốc trừ cỏ [54]. Mặc dù chưa có công bố quốc tế về chuyển gen ở sắn tạo giống tăng năng suất và có khả năng kháng bệnh, nhưng chuyển gen ở các đối tượng cây trồng khác cho thấy tiềm năng tạo ra các giống sắn có năng suất và khả năng kháng bệnh cao bằng kĩ thuật biến nạp gen.
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu mô sẹo phôi hóa ở sắn vẫn còn khá hiếm. Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tạo mô sẹo và các cấu trúc phôi từ thân và từ các mảnh lá non. Hơn nữa, việc tạo thành công mô sẹo phôi hóa cho các giống sắn được trồng tại Việt Nam cho đến nay vẫn chưa được công bố. Vì vậy, vấn đề nghiên cứu sự tạo mô sẹo phôi hóa cho giống mô hình TMS 60444 sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa cho các giống sắn Việt Nam.
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU