b. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
2.2.5. Phương pháp biến nạp
2.2.5.1. Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa a. Chuẩn bị dung dịch khuẩn cho biến nạp
A. tumefaciens mang plasmid có các gen cần chuyển đã được chuẩn bị
sẵn. Nuôi một khuẩn lạc vi khuẩn A.tumefaciens mang plasmid cần chuyển trong 10ml môi trường YEB (lỏng) có bổ sung 25mg/l rifampicin, 50mg/l streptomycin, 50mg/l spectomycin, 50mg/l gentamycin và glycerol 2% nuôi lắc 100 vòng/phút ở 280C trong thời gian 48 giờ (OD600 = 0,7 - 1).
Ly tâm A.tumefaciens với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn A.tumefaciens rồi hòa cặn trong MMS lỏng có chứa acetosyringone 200µM và đo OD
của dung dịch pha loãng ở các giá trị OD600 = 0,25, OD600 = 0,5 và OD600 = 0,7. Các dung dịch có OD600 này sẽ được sử dụng để ngâm mô sẹo phôi hóa.
b. Qui trình biến nạp
Các cụm mô sẹo phôi hóa từ 14-20 ngày tuổi có màu vàng tươi và tơi xốp được chọn và tách ra để sử dụng cho thí nghiệm biến nạp
Đổ dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào ống fancol 50ml có chứa mô sẹo phôi hóa , sau đó để trên máy lắc ở nhiệt độ phòng, khoảng 5 phút. Loại bỏ dung dịch, thấm khô mô sẹo phôi hóa bằng giấy lọc tuyệt trùng. Sau đó, chuyển mô sẹo phôi hóa sang môi trường đồng nuôi cấy (môi trường MMS có bổ sung AS (acetosyringone) 200µM) trong 4 ngày ở điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày và nhiệt độ 280C.
c. Loại bỏ vi khuẩn sau biến nạp
Khối mô sẹo được biến nạp sau 4 ngày đồng nuôi cấy tiến hành rửa mô phôi để loại bỏ vi khuẩn. Rửa mô bằng dung dịch MMS đã khử trùng có bổ sung kháng sinh Cefotaxime để diệt khuẩn. Sau đó, thấm khô mô phôi bằng giấy thấm tiệt trùng và chuyển chúng sang môi trường nhân mô sẹo (MMS) có bổ sung Cefotaxime ở các nồng độ từ 0, 300, 400, 500, 600, 700 mg/l. Sau một tuần thấy mô sẹo phôi hóa không
bị nhiễm khuẩn trở lại thì cấy chuyển sang môi trường MMS không có kháng sinh và tiếp tục nuôi cấy trong 2 – 3 tuần nữa.
Xác định nồng độ Cefotaxime thích hợp để chọn lọc mô sẹo phôi hóa sau biến nạp thông qua tỉ lệ cụm mô sẹo phôi hóa sống sót mà không bị nhiễm khuẩn và đặc điểm mô sẹo phôi hóa trong môi trường tái sinh có bổ sung các dải nồng độ Cefotaxime khác nhau
Sử dụng công thức xác định tỷ lệ số cụm mô sẹo phôi hóa sống sót và không bị nhiễm sau biến nạp theo công thức sau :
(Số cụm mô sẹo phôi hóa sống sót, không bị nhiễm sau biến nạp/ số cụm mô sẹo phôi hóa ban đầu)x 100%
2.2.5.2. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp và chọn lọc cây chuyển gen
Các mô sống sót sau 3 - 4 tuần nuôi cấy tại MMS được chuyển sang môi trường tái sinh cây (MSN) ở nhiệt độ 280C thời gian chiếu sáng 16h/ ngày đêm và cường độ chiếu sáng 2000 lux. Sau 8 tuần, các cụm chồi thật xuất hiện từ các cụm mô sẹo phôi hóa sẽ được tách ra và cấy chuyển sang môi trường tạo rễ (CEM) có bổ sung 3mg/l glufosinate để tiếp tục chọn lọc. Sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo rễ, các cây tái sinh được sử dụng làm nguyên liệu để tách chiết ADN.
Tỷ lệ cây tái sinh mang gen = (Số cây sống sót biểu hiện gen GFP/ Tổng số cụm mô sẹo phôi hóa ban đầu) x 100%
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN