b. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa
Các cây sắn cao khoảng 8cm được loại bỏ hết lá và cắt thành các đoạn dài 1,5-2 cm và có chứa mắt chồi và đưa vào môi trường CAM chứa BAP 10mg/l để kích thích tạo chồi. Sau 2-4 ngày tách chồi nách và chuyển đến môi trường CIM có chứa picloram 12 mg/l để cảm ứng tạo mô sẹo. Khối mô sẹo 2 – 4 tuần tuổi được loại bỏ dịch nhày, tách nhỏ, và chuyển đến môi trường DKW có chứa picloram 12 mg/l để
chọn lọc các khối mô sẹo chất lượng. Tiếp tục lựa chọn các khối mô sẹo chất lượng và chuyển sang môi trường MMS có chứa picloram 12 mg/l để tăng sinh khối mô sẹo và tạo mô sẹo phôi hóa. Mô sẹo phôi hóa được tạo thành sẽ được lựa chọn và chuyển sang môi trường MMS mới chứa picloram 12 mg/l để tăng sinh khối. Các bước tiến hành thí nghiệm được tóm tắt qua bảng sau:
Bảng 4: Khái quát các bƣớc tạo mô sẹo phôi hóa ở sắn
Stt Giai đoạn Môi
trƣờng
Hormone Thời
gian
Chu kì sáng:tối (nhiệt độ)
1 Tạo vật liệu khởi đầu MS - 4-8 tuần 16h:8h (28°C) 2 Tạo chồi nách CAM BAP 10mg/L 2-4 ngày 0h:24h (28°C)
3 Tạo mô sẹo CIM Picloram
12mg/L
2 - 4 tuần
0h:24h (28°C) 4 Tạo mô sẹo phôi hóa DKW Picloram
12mg/L
2 - 4 tuần
0h:24h (28°C) 5 Tạo và nhân mô sẹo
phôi hóa 1/10MS (MMS) Picloram 12mg/L 4 – 10 tuần 0h:24h (28°C)
Sự lựa chọn cấu trúc mô sẹo chất lượng và các cụm mô sẹo phôi hóa được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi Leica (Đức) với độ phóng đại 6 lần.
Sự hình thành mô sẹo phôi hóa được đánh giá dựa vào thời gian tạo mô sẹo, sự gia tăng sinh khối mô sẹo trong các môi trường nuôi cấy, độ nhày của khối mô sẹo, màu sắc mô sẹo, tính đồng nhất của quần thể tế bào trong mô sẹo.
Tỷ lệ tạo mô sẹo được tính bằng số cụm mô sẹo trên số chồi ban đầu.
Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa được tính bằng số cụm mô sẹo phôi hóa trên số chồi ban đầu.