b. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
3.3. Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa từ chồi nách cây sắn
a. Xác định khả năng tạo mô sẹo của các giống sắn nghiên cứu
Nghiên cứu sử dụng 300 chồi nách của mỗi giống sắn nghiên cứu, sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trường CIM thì tỉ lệ tạo mô sẹo của các giống sắn nghiên cứu đạt được lần lượt như sau: 96,3% đối với giống TMS 60444; 88,7% đối với giống KM 140; 81,3% đối với giống KM 419 và 77,7% đối với giống HL 2004-28 (bảng 6).
Bảng 6. Nghiên cứu tạo mô sẹo từ chồi nách trên môi trƣờng CIM
Tên giống Lần thí nghiệm Tổng số chồi nách nuôi cấy Số chồi tạo mô sẹo Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ tạo mô sẹo trung bình (%) TMS 60444 1 100 95 95 96,3 2 100 97 97 3 100 97 97 KM 140 1 100 86 86 88,7 2 100 93 93 3 100 87 87 KM 419 1 100 83 83 81,3 2 100 79 79 3 100 82 82 HL 2004-28 1 100 77 77 77,7 2 100 80 80 3 100 76 76
Như vậy, khi nuôi cấy chồi nách trong thời gian 2 tuần tại môi trường CIM có chứa picloram 12mg/l thì nhận thấy cả bốn giống sắn nghiên cứu đều cảm ứng tạo mô sẹo. Tuy nhiên trong số các giống nêu trên thì giống TMS 60444 là giống đạt tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhất. Trong 3 giống có nguồn gốc Việt Nam thì giống KM 140 là giống sắn có tiềm năng nhất vì giống sắn này đạt tỷ lệ mô sẹo cao hơn 2 giống còn lại. Giống HL 2004-28 có tỷ lệ đạt mô sẹo thấp nhất.
Hầu hết các mô hay cơ quan thực vật đều có thể sử dụng để nuôi cấy cho việc tạo mô sẹo, tuy nhiên mức độ thành công lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau.
Ngoài điều kiện môi trường nuôi cấy thì giống thực vật là một trong các yếu tố quan trọng quyết định đến sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật. Bộ phận được sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy mô cũng là yếu tố quyết định hiệu quả của quá trình nuôi cấy. Về lý thuyết,bất kỳ bộ phận nào thu được từ bất kỳ loài thực vật nào cũng có thể được sử dụng để tạo ra các mô sẹo, tuy nhiên mức độ thành công của quá trình tạo mô sẹo phụ thuộc vào tính chất đặc trưng của chúng. Thân cây, lá, rễ, hoa, hạt giống và các bộ phận khác của cây đều có thể được sử dụng, tuy nhiên những bộ phận cây non thường được sử dụng và cho hiệu quả cao nhất. Trong nghiên cứu này, chồi nách từ thân cây sắn in vitro được nuôi cấy để nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa của các giống sắn bởi khả năng sinh trưởng nhanh hơn hẳn so với các bộ phận khác trong quá trình nuôi cấy mô.
Mô sẹo của các giống nghiên cứu trông khá tương tự nhau khi ở giai đoạn 2 tuần tuổi trong môi trường CIM. Tất cả các cụm mô sẹo tạo thành từ chồi nách đều có màu vàng nhạt và độ nhày cao. Các khối mô sẹo bắt đầu có sự phân hóa thành các hình dạng mô phôi khác nhau (Xem hình 8).
Hình 8. Các cụm mô sẹo 2 tuần tuổi trong môi trường CIM
Sau khi mô sẹo được hình thành từ chồi ở môi trường CIM trong 2 tuần tuổi thì mô sẹo sẽ được loại bỏ hết các dịch nhầy và được chuyển đến môi trường DKW, nuôi mô sẹo trong môi trường DKW sau thời gian 2 tuần nhận thấy các khối mô sẹo của các giống sắn nghiên cứu có sự thay đổi về màu sắc, hình dạng, kích thước. Mô sẹo các giống đều vàng hơn sau 2 tuần nuôi cấy. Khối mô sẹo của giống TMS 60444 là có màu vàng tươi, khối mô sẹo của các giống HL 2004-28 và KM 419 có màu vàng nhạt, khối mô sẹo của giống KM 140 có màu vàng đậm hơn các khối mô sẹo của các giống sắn khác (Hình 9). Về kích thước, giống TMS 60444 có hệ số gia tăng kích thước cao nhất đạt được là 2, sự gia tăng kích thước của giống KM 140 và KM 419 là tương đương nhau, giống HL 2004-28 có sự gia tăng kích thước thấp nhất. Về độ nhày, giống TMS 60444 và KM 140 có độ nhày thấp nhất, giống KM 419 và HL 2004-28 có độ nhày cao và chiếm đến 50%-60% kích thước của toàn bộ khối mô sẹo (Bảng 7).
Bảng 7. Đánh giá chất lƣợng mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng DKW
STT Tên giống Màu sắc mô sẹo Hệ số gia tăng kích thƣớc Độ nhày(%)
1 HL 2004-28 Vàng nhạt 1,3 60%
2 KM 140 Vàng đậm 1,6 20%
3 KM 419 Vàng nhạt 1,5 50%
- Hệ số gia tăng kích thước được tính bằng tỷ lệ giữa kích thước khối mô sẹo hiện tại và kích thước khối mô sẹo ban đầu
- Độ nhày được tính bằng tỷ lệ giữa kích thước khối nhày và kích thước toàn bộ khối mô sẹo
Các khối mô sẹo đều có khả năng phát sinh các dạng phôi khác nhau. Tuy nhiên ở mỗi giống sắn khác nhau thì các dạng phôi thế hệ tạo ra với số lượng và hình dạng khác nhau. Ở giai đoạn 28 ngày tuổi tại môi trường DKW, khối mô sẹo của giống TMS 60444 phát sinh dạng phôi hình cầu với tỷ lệ nhiều nhất, tiếp đến là giống KM 140,giống sắn KM 419 có tỷ lệ phôi hình thuỷ lôi lớn nhất, giống HL 2004-28 có tỷ lệ phôi dạng lá mầm là lớn nhất.
Bảng 8: Đánh giá tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi ở giai đoạn 28 ngày tuổi tại môi trƣờng DKW
Giống sắn Tỷ lệ mô sẹo
phát sinh phôi (%) Tỷ lệ phôi hình cầu (%) Tỷ lệ phôi hình thủy lôi (%) Tỷ lệ phôi hình lá mầm (%) TMS 60444 95,2 72,7 20,4 4,3 KM 140 80,6 53,1 30,2 10,7 KM 419 71,1 33,5 52,3 13,2 HL 2004-28 55,3 19,7 20,5 50,8
Hình 9. Khối mô sẹo của các giống trong môi trường DKW sau 2 tuần nuôi cấy
Trong 4 giống được nghiên cứu thì giống TMS 60444 cho chất lượng mô sẹo tốt nhất thể hiện ở các đặc điểm hình thái như khối mô sẹo có màu vàng tươi, sự gia tăng sinh khối nhanh và độ nhày thấp. Chất lượng mô sẹo của giống HL 2004-28 xấu nhất vì khối mô sẹo của giống này có sự gia tăng sinh khối chậm và độ nhày cao. Dựa vào các biểu hiện trên nên giống TMS 60444 sẽ được lựa chọn làm giống chuẩn để đánh giá chất lượng mô sẹo của các giống còn lại ở các giai đoạn môi trường tiếp theo. Với 3 giống nghiên cứu có nguồn gốc Việt Nam thì nhận thấy giống KM 140 ở giai đoạn môi trường DKW 2 tuần tuổi mang các đặc điểm hình thái tương đương với giống TMS 60444. Do đó, giống KM 140 được xác định là giống có tiềm năng tạo mô sẹo phôi hóa.
b. Xác định khả năng tạo mô sẹo phôi hóa của các giống sắn nghiên cứu
Khối mô sẹo ở môi trường DKW 2 tuần tuổi sau khi được loại bỏ dịch nhày sẽ được chuyển đến môi trường MMS có chứa picloram 12mg/l. Sau 2-5 tuần nuôi cấy khối mô sẹo trong môi trường MMS (cứ 2 tuần/ lần sẽ chuyển khối mô sẹo sang môi trường nuôi cấy MMS mới) thì thấy khối mô sẹo phôi hóa bắt đầu được cảm ứng hình thành từ khối mô sẹo của giống TMS 60444. Các giống còn lại không có sự hình thành mô sẹo phôi hóa ở giai đoạn môi trường hiện tại. Ở giai đoạn môi trường này khối mô sẹo phôi hóa hình thành và bắt đầu sinh trưởng tạo ra các quần thể tế bào khá đồng nhất về mặt hình dạng và kích thước. Đó là các cụm tế bào có hình trứng cá, màu vàng tươi, rời rạc và hầu như không có dịch nhày. Các cụm tế bào của khối mô sẹo phôi hóa có khả năng phân chia và tăng sinh khi được chuyển sang môi trường MMS mới (Bảng 9).
Bảng 9. Đánh giá khả năng tạo mô sẹo phôi hóa ở môi trƣờng MMS
Tên giống Tình trạng tạo mô sẹo phôi hóa trong môi trường MMS ở các độ tuổi khác nhau
3 tuần tuổi 5 tuần tuổi 8 tuần tuổi
HL 2004-28 Khối mô màu vàng đậm, gồm các quần thể tế bào không đồng nhất về mặt hình dạng và kích thước
Khối mô màu vàng đậm, và có hiện tượng phân hóa rõ rệt thành các phôi với các hình dạng và kích thước khác nhau
Khối mô hóa màu nâu đậm, có nhiều dịch nhày và sau đó mất nước và khô dần
KM 140 Khối mô màu vàng tươi, phân hóa thành các quần thể tế bào với các loại hình dạng và kích thước khác nhau
Khối mô có màu vàng đậm dần và ngày càng phân hóa rõ rệt thành các phôi với các hình dạng và kích thước khác nhau
Khối mô hóa màu nâu đậm, không có hiện tượng gia tăng kích thước
KM 419 Khối mô có màu vàng tươi, phân hóa thành các quần thể tế bào với các loại hình dạng và kích thước khác nhau
Khối mô có màu vàng đậm dần và ngày càng phân hóa rõ rệt thành các phôi với các hình dạng và kích thước khác nhau
Khối mô hóa màu nâu đậm, sau đó mất nước và khô dần còn khối dịch nhày tăng thêm TMS 60444 Khối mô màu vàng
tươi, phân hóa dần thành các phôi với hình dạng kích thước khác nhau
Khối mô màu vàng tươi, một phần trong khối mô bắt đầu bở dần thành các cụm tế bào tách rời, hình thành quần thể tế bào đồng nhất về mặt hình dạng và kích thước. Bước đầu đánh dấu sự xuất hiện của khối mô sẹo phôi hóa
Khối mô sẹo phôi hóa tiếp tục sinh trưởng và phát triển với các đặc điểm: màu vàng tươi, có sự gia tăng sinh khối rõ rệt và hình thành nên các cụm tế bào hình trứng cá sắp xếp rời rạc cạnh nhau
Dưới đây là một số hình ảnh về tình trạng mô sẹo phôi hóa của các giống ở môi trường MMS tại giai đoạn 8 tuần tuổi:
Hình 10. Khối mô sẹo HL 2004-28 (A); KM 140 (B); KM 419 (C) và TMS 60444 (D) ở giai đoạn 8 tuần tuổi tại môi trường MMS
Nghiên cứu 4 giống sắn bao gồm 3 giống sắn có nguồn gốc Việt Nam và 1 giống sắn có nguồn gốc Châu Phi. Kết quả cho thấy: khi nuôi cấy khối mô sẹo (Khối callus) trên môi trường MMS và kéo dài thời gian thì cả 3 giống sắn có nguồn gốc Việt Nam (HL 2004-28, KM 140, KM 419) đều có biểu hiện bên ngoài khá tương tự nhau. Đó là ở giai đoạn tuần tuổi thứ 8 trong môi trường MMS, khối mô sẹo bị hóa nâu dần và không có sự gia tăng sinh khối (Hình 11). Trái ngược với 3 giống sắn có nguồn gốc Việt Nam, giống sắn TMS 60444 có nguồn gốc từ Châu Phi có khối mô sẹo bở dần ở tuần tuổi thứ 5 và ở tuần tuổi thứ 8 trong môi trường MMS khối mô sẹo có sự gia tăng sinh khối nhanh, bao gồm các cụm tế bào hình trứng cá nằm rời rạc,hầu như không còn dịch nhày, khá đồng nhất về mặt hình dạng, màu sắc, kích thước (Hình 10). Điều này chứng tỏ nền di truyền của từng giống sắn có ảnh hưởng lớn đến khả năng hình thành và phát triển mô sẹo phôi hóa. Với các nghiên cứu trên thế giới, trải qua một thời gian dài tìm hiểu về sự hình thành các cấu trúc phôi từ mô sẹo, thì gần đây các nghiên cứu đều tập trung vào việc tạo ra mô sẹo phôi hóa. Nhờ sự phát hiện ra cấu trúc này mà các nhà khoa học trên thế giới đã cải tạo thành công nhược điểm của một số giống sắn hiện có bằng công nghệ sinh học hiện đại [65]. Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu sử dụng thân non hoặc các mảnh lá non ở cây sắn để tạo mô sẹo và các cấu trúc phôi [1], [5], [10]. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào phát hiện ra cấu trúc mô sẹo phôi hóa của sắn. Các nghiên cứu về sắn tại Việt Nam mới chỉ dừng lại ở việc tạo phôi soma nên khi sử dụng các nguyên liệu trên để chuyển gen thì thường cho hiệu quả thấp. Nghiên cứu này đã tìm ra cấu trúc mô sẹo phôi hóa của giống TMS 60444. Kết
quả này sẽ là cơ sở để tiếp tục có các định hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích tạo được cấu trúc mô sẹo phôi hóa của các giống sắn đang trồng phổ biến tại Việt Nam. Môi trường MMS được cải tiến dựa trên môi trường dinh dưỡng MS cơ bản có bổ sung 12 mg/l picloram được thử nghiệm để nuôi cấy mô sẹo của 4 giống sắn: TMS 60444, KM 140, KM 419, HL 2004-28. Kết quả cho thấy, môi trường này phù hợp với giống TMS 60444 trong khi không thích ứng với giống 3 giống sắn còn lại, thể hiện ở khả năng sinh trưởng của mô sẹo TMS 60444 ở các giai đoạn sau trong khi mô sẹo của 3 giống còn lại bị thoái hóa và chết dần. Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa trung bình của giống TMS 60444 lên đến 64,3% nhưng các giống còn lại đều có tỷ lệ 0% (Bảng 10).
Bảng 10. Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa của các giống sắn nghiên cứu
Tên giống Lần thí nghiệm Số chồi Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa
(%)
Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa trung bình
(%) TMS 60444 1 100 95 63 64,3 2 100 97 65 3 100 97 65 KM 140 1 100 86 0 0
2 100 93 0 3 100 87 0 KM 419 1 100 83 0 0 2 100 79 0 3 100 82 0 HL 2004-28 1 100 77 0 0 2 100 80 0 3 100 76 0
Như vậy, chồi nách của thân cây sắn in vitro là một trong những bộ phận trên cây sắn có khả năng tạo mô sẹo chất lượng nhất [65]. Do đó, chúng được sử dụng được để nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa của các giống sắn. Bên cạnh đó, các mô hay cơ quan khác cũng có thể được sử dụng để nuôi cấy tạo mô sẹo, tuy nhiên mức độ thành công lại phụ thuộc vào các yếu tố khác như giống sắn, hệ thống môi trường nuôi cấy [10]. Trên thế giới, các nhà khoa học cũng đã sử dụng các bộ phận khác nhau trên thân cây sắn để tạo mô sẹo và các loại phôi soma. Họ cho rằng việc tạo ra loại phôi soma chất lượng là yếu tố rất quan trọng để cải tạo các giống sắn bằng các phương pháp công nghệ sinh học [45].