Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou và cs, (1991) và kỹ thuật này đươc cải tiến bởi Cao va cs, (1992); Li và cs, (1996) [36]. Ngay lập tức, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển gen lúa japonica. Gần đây kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen cũng đã được áp dụng thành công với các giống lúa indica và nhiều giống japonica (Christou và cs, 1998; Datta và cs, 1999 [6]. Cheng và cs (1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào lúa Japonica sử dụng súng bắn gen [6].
Đây là kỹ thuât tương đối hiện đại và có hiệu quả. Khi sử dụng thiết bị (súng bắn gen) tạo được áp lực sẽ đẩy viên đạn được làm bằng kim loại trơ (vàng, tungsten, wolfram) đã bọc plasmid mang gen đã thiết kế, có kích thước vào khoảng 1μm, với vận tôc 130 m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen của tế bào chủ.
Hiệu quả chuyển gen vào lúa bằng phương pháp dùng súng bắn gen không những không phụ thuộc vào kiểu gen mà tần suất lại cao. Ở một vài trường hợp, tần
suất chuyển gen bằng phương pháp này ngang bằng với tần suất chuyển gen với cây hai lá mầm
1.6.2. Chuyển gen gián tiếp a. Chuyển gen gián tiếp nhờ virus
Đối với việc chuyển gen vào thực vật thì virus thực vật cũng được coi như là một vectơ. Virus làm vectơ chuyển gen phải có các tiêu chuẩn sau:
- Bộ gen có cấu trúc DNA
- Có độ thiệt hại thấp hoặc không hại - Phổ ký chủ rộng
- Có khả năng tải
- Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào
Có hai loại virus đảm nhận được vai trò làm vectơ chuyển gen là:
* Cauliflower Mosaic Virus (CaMV): virus hại cây họ cải đặc biệt là suplơ. DNA ngoại lai được đưa vào tế bào thực vật nhờ sự lây nhiễm lá bởi virus. Các CaMV có thể nhân lên trong bào tương một cách độc lập, không gây trở ngại cho tế bào vật chủ [1]. Song vectơ CaMV có một số hạn chế:
- Phổ ký chủ không rộng (chỉ ở các cây họ cải)
- Lượng DNA ngoại lai gắn vào ít, chỉ khoảng 250bp * Genini virus:
- Có phổ ký chủ rộng: cây một lá mầm, hai lá mầm
- Có nhược điểm lớn là hầu như không truyền được qua hạt. Do đó muốn nhân các cây chuyển gen trong trường hợp này phải nhân vô tính.
b. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Chuyển gen vào thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens được xem là
phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium.
1.7. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo phôi hóa tạo hệ thống tái sinh và chuyển gen vào sắn chuyển gen vào sắn
Năm 1996, 3 nhóm nghiên cứu độc lập đồng thời công bố kết quả chuyển gen thành công vào cây sắn (Li và cs, 1996; Raemakers và cs, 1996; Schöpke và cs, 1996). Li và cs đã đưa ra được phương pháp tái sinh hiệu quả cây con từ mô sẹo của cây sắn chuyển gen sau khi đồng nuôi cấy với Agrobacterium tumefaciens, mở ra hướng mới trong việc cải thiện chất lượng giống sắn và tạo giống mới, thông qua các phương pháp công nghệ sinh học [36]. Reamakersvà các cộng sự đã tạo được mô sẹo phôi hóa của các giống sắn TMS 60444, Adira 4, Thai 5 and M7, từ đó tạo được cây sắn hoàn chỉnh từ các mô này. Đặc biệt, nghiên cứu đã làm giảm đáng kể quá trình hình thành cây từ mô sẹo của giống sắn TMS60444 mang gen chuyển bằng cả 2 kĩ thuật, thông qua hệ thống Agrobacterium tumefaciens và súng bắn gen [48], [49]. Trong khi đó,
phương pháp của Schöpke và cộng sự đã thiết lập được quy trình chuyển gen vào cây sắn, thông qua kĩ thuật bắn gen mục tiêu vào mô sẹo nhằm tạo nguyên liệu cho quá trình chọn lọc tế bào mang gen chuyển và tạo cây chuyển gen từ các tế bào này. Thử nghiệm với các gen mã hóa cho neomycin phosphotransferase (nptII) và beta- glucuronidase (uidA) và nuôi trong môi trường chọn lọc sau đó phân tích phân tử, nghiên cứu đã chỉ ra rằng, DNA ngoại lai có thể tồn tại trong hệ gen của sắn một cách bền vững và lâu dài [56].
Hình 4 mô tả 4 hệ thống hiện đang sử dụng để chuyển gen vào sắn [59]. Bốn hệ thống này sử dụng 4 loại mô đích khác nhau làm đối tượng chuyển gen: Mô lá chưa trưởng thành, các cấu trúc phôi, mảnh lá mầm, và mô sẹo phôi hóa. Mô lá chưa trưởng thành và các cấu trúc phôi chỉ có thể chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
trong khi đó mảnh lá mầm hay mô sẹo phôi hóa có thể sử dụng thêm súng bắn gen để chuyển gen. Sau khi chuyển gen, mô đích được tái sinh trên môi trường chọn lọc để tạo cây hoàn chỉnh mang gen cần chuyển. Các đánh giá phân tích cả 4 hệ thống chuyển gen cho thấy mỗi hệ thống trên đều có những ưu, nhược điểm riêng. Mặc dù vậy, các nhà khoa học thường ưu tiên lựa chọn phương pháp chuyển gen sử dụng A. tumefaciens thay vì súng bắn gen vì lí do sử dụng A. tumefaciens có chi phí thấp hơn
và cho kết quả ổn định hơn. Khoảng 50% số cây chuyển gen thu được thông qua A. tumefaciens chỉ mang 1 bản gen cần chuyển trong khi con số này chỉ là 10% khi sử
dụng súng bắn gen.
Năm 2009, Bull và cộng sự phát triển phương pháp cải tiến kết hợp sử dụng A.
Tumefaciens để chuyển gen vào phôi mô sẹo phôi hóa cho tần suất biến nạp và tái sinh cây chuyển gen cao hơn hẳn các phương pháp cũ. Cho đến nay, phương pháp này vẫn là phương pháp được sử dụng phổ biến để chuyển gen mong muốn vào cây sắn [18].
Cũng như chọn tạo giống ở các cây trồng khác, một trong các vấn đề quan trọng đối với chọn giống sắn là làm sao tích hợp được gen đích mong muốn vào một nguồn gen phù hợp. Đây cũng là một khó khăn với công tác tạo giống sắn bằng phương pháp chuyển gen vì lý do các giống sắn phản ứng khác nhau trong điều kiện nuôi cấy in vitro, đặc biệt là trong quá trình tạo mô đích phục vụ biến nạp. Do đó, việc nghiên cứu
khả năng tái sinh và tạo mô đích phục vụ biến nạp là cần thiết trên các giống sắn triển vọng [41].
Một vài thành công của sắn chuyển gen bao gồm nhiều giống sắn mới với các đặc tính khác nhau như: giảm hàm lượng cyanua [57], kháng sâu [34], tỉ lệ amylose thấp [33], kháng thuốc trừ cỏ [54]. Mặc dù chưa có công bố quốc tế về chuyển gen ở sắn tạo giống tăng năng suất và có khả năng kháng bệnh, nhưng chuyển gen ở các đối tượng cây trồng khác cho thấy tiềm năng tạo ra các giống sắn có năng suất và khả năng kháng bệnh cao bằng kĩ thuật biến nạp gen.
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu mô sẹo phôi hóa ở sắn vẫn còn khá hiếm. Các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tạo mô sẹo và các cấu trúc phôi từ thân và từ các mảnh lá non. Hơn nữa, việc tạo thành công mô sẹo phôi hóa cho các giống sắn được trồng tại Việt Nam cho đến nay vẫn chưa được công bố. Vì vậy, vấn đề nghiên cứu sự tạo mô sẹo phôi hóa cho giống mô hình TMS 60444 sẽ là tiền đề cho việc nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa cho các giống sắn Việt Nam.
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Mẫu thực vật
Ba giống sắn Việt Nam là HL 2004-28, KM 140, KM 419 và giống sắn mô hình TMS 60444 được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu. Các giống sắn được sử dụng để nghiên cứu có thời gian nuôi cấy trong ống nghiệm khoảng 6 tuần.
2.1.2. Vi khuẩn và các vector
- Chủng vi khuẩn E.coli DH5α làm vật nhận plasmid pzy101-Asc:35s:GFP - Chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA 4404 – AA3 có chứa plasmid pzy101- Asc:35s:GFP mang gen chỉ thị GFP, (plasmid, vi khuẩn A. tumefaciens LBA 4404 – AA3 và vi khuẩn E.coli DH5α do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp).
2.1.3. Môi trường nuôi cấy
Các loại môi trường nuôi cấy mô sẹo được cải tiến dựa trên các loại môi trường có trong nghiên cứu của Zainuddin và cs, 2012 [65].
- CAM: MS + vitamin + 2% saccharose + 1% agar (w/v) + CuSO4 2mM + 0,1% BAP (w/v).
- CIM: MS + vitamin + 2% saccharose (w/v) + 1% agar (w/v) + CuSO4 2mM + 12mg/l picloram.
- DKW: Hỗn hợp muối bazo + 2% saccharose (w/v) + 1% agar (w/v) + CuSO4 2mM + vitamin + 12mg/l picloram.
- MMS: 1/10 MS + vitamin + 2% saccharose (w/v) + 1% agar(w/v) + 12mg/l picloram
- MSN: MS + vitamin + 2% saccharose (w/v) + 2mM CuSO4 + 1% agar (w/v) + 1 mg/l NAA.
- CEM: MS + vitamin + 2% saccharose (w/v) + 2mM CuSO4 + 1% agar (w/v) + 0,04% BAP (w/v).
- MS: Pha theo công thức của Murashige và Skoog, 1962.
- Môi trường nuôi khuẩn (YEB): Bactopeptone 10g/l, Yeast extract 5g/l, NaCl 10g/l (môi trường đặc thêm agar 15g/l).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp khử trùng tạo mẫu sạch
Cắt những đoạn thân non dài 1,5 – 2 cm và có chứa chồi nách, rửa bằng xà phòng dưới vòi nước chảy để loại bớt các vi sinh vật trên bề mặt thân. Cho các đoạn thân vào bình tam giác và tiến hành khử trùng trong box cấy vô trùng.
Đầu tiên rửa đoạn thân bằng nước cất vô trùng. Sau đó khử trùng bề mặt của đoạn thân bằng cồn 70% trong vòng 30 giây và rửa sạch bằng nước cất vô trùng từ 3 - 5 lần. Tiếp theo khử trùng bằng Javen (NaClO) ở nồng độ thí nghiệm là 0,5%, 0,7% và 1% trong khoảng thời gian 15 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi dùng que cấy vô trùng lấy các đoạn thân cấy vào môi trường MS
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần 5 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 đoạn thân dài khoảng 1,5-2 cm và có chứa mắt chồi.
2.2.2. Phương pháp nhân giống trong ống nghiệm
- Tạo cụm chồi:Cây sắn hoàn chỉnh được loại bỏ hết lá, sau đó cắt thành các đoạn từ 2-3 cm, mỗi đoạn cắt gồm một đến hai mắt chồi, vị trí cắt ở phía trên mắt chồi cách mắt chồi 0,2-0,5 cm. Các đoạn cắt được cấy trong môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 3 mg/l BAP với điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày ở 28°C.
- Chỉ tiêu theo dõi : dựa vào hệ số tạo cụm chồi của mỗi giống sau 4 tuần nuôi cấy được tính theo công thức sau:
- Nhân cụm chồi: Tách các chồi đơn từ cụm chồi và cấy vào môi trường MS + 1mg/l BAP + 20g/l đường với điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày ở 280 C. Tính theo công thức tương tự công thức của hệ số tạo cụm chồi sau 3 tuần nuôi cấy.
- Kéo dài cụm chồi: Chuyển cụm chồi của các giống đã được hình thành ở các thí nghiệm trên vào môi trường MS cơ bản (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung 0,2mg/l GA3, không agar với điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày ở 28°C. Tính hệ số kéo dài chồi của các giống nghiên cứu sau 4 tuần nuôi cấy theo công thức sau:
2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo phôi hóa
Các cây sắn cao khoảng 8cm được loại bỏ hết lá và cắt thành các đoạn dài 1,5-2 cm và có chứa mắt chồi và đưa vào môi trường CAM chứa BAP 10mg/l để kích thích tạo chồi. Sau 2-4 ngày tách chồi nách và chuyển đến môi trường CIM có chứa picloram 12 mg/l để cảm ứng tạo mô sẹo. Khối mô sẹo 2 – 4 tuần tuổi được loại bỏ dịch nhày, tách nhỏ, và chuyển đến môi trường DKW có chứa picloram 12 mg/l để
chọn lọc các khối mô sẹo chất lượng. Tiếp tục lựa chọn các khối mô sẹo chất lượng và chuyển sang môi trường MMS có chứa picloram 12 mg/l để tăng sinh khối mô sẹo và tạo mô sẹo phôi hóa. Mô sẹo phôi hóa được tạo thành sẽ được lựa chọn và chuyển sang môi trường MMS mới chứa picloram 12 mg/l để tăng sinh khối. Các bước tiến hành thí nghiệm được tóm tắt qua bảng sau:
Bảng 4: Khái quát các bƣớc tạo mô sẹo phôi hóa ở sắn
Stt Giai đoạn Môi
trƣờng
Hormone Thời
gian
Chu kì sáng:tối (nhiệt độ)
1 Tạo vật liệu khởi đầu MS - 4-8 tuần 16h:8h (28°C) 2 Tạo chồi nách CAM BAP 10mg/L 2-4 ngày 0h:24h (28°C)
3 Tạo mô sẹo CIM Picloram
12mg/L
2 - 4 tuần
0h:24h (28°C) 4 Tạo mô sẹo phôi hóa DKW Picloram
12mg/L
2 - 4 tuần
0h:24h (28°C) 5 Tạo và nhân mô sẹo
phôi hóa 1/10MS (MMS) Picloram 12mg/L 4 – 10 tuần 0h:24h (28°C)
Sự lựa chọn cấu trúc mô sẹo chất lượng và các cụm mô sẹo phôi hóa được thực hiện dưới kính hiển vi soi nổi Leica (Đức) với độ phóng đại 6 lần.
Sự hình thành mô sẹo phôi hóa được đánh giá dựa vào thời gian tạo mô sẹo, sự gia tăng sinh khối mô sẹo trong các môi trường nuôi cấy, độ nhày của khối mô sẹo, màu sắc mô sẹo, tính đồng nhất của quần thể tế bào trong mô sẹo.
Tỷ lệ tạo mô sẹo được tính bằng số cụm mô sẹo trên số chồi ban đầu.
Tỷ lệ tạo mô sẹo phôi hóa được tính bằng số cụm mô sẹo phôi hóa trên số chồi ban đầu.
2.2.4. Nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa
Mô sẹo phôi hóa được hình thành ở môi trường MMS bổ sung picloram 12mg/l sẽ được chuyển sang môi trường MSN chứa NAA 1mg/l. Nuôi ở 28°C với điều kiện chiếu sáng 16h/ngày trong 8 tuần, chu kì cấy chuyển 2 tuần/lần.Sau 8 tuần trong môi trường MSN lại tiếp tục cấy chuyển mô sẹo phôi hóa sang môi trường CEM chứa BAP 0,4mg/l. Nuôi ở 28°C trong 4-8 tuần, 2 tuần cấy chuyển 1 lần. Sau khi mô sẹo phôi hóa tạo được chồi và rễ thì sẽ chuyển cây tái sinh đến môi trường MS cơ bản để phát triển thành cây hoàn chỉnh.
2.2.5. Phương pháp biến nạp
2.2.5.1. Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa a. Chuẩn bị dung dịch khuẩn cho biến nạp
A. tumefaciens mang plasmid có các gen cần chuyển đã được chuẩn bị
sẵn. Nuôi một khuẩn lạc vi khuẩn A.tumefaciens mang plasmid cần chuyển trong 10ml môi trường YEB (lỏng) có bổ sung 25mg/l rifampicin, 50mg/l streptomycin, 50mg/l spectomycin, 50mg/l gentamycin và glycerol 2% nuôi lắc 100 vòng/phút ở 280C trong thời gian 48 giờ (OD600 = 0,7 - 1).
Ly tâm A.tumefaciens với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn A.tumefaciens rồi hòa cặn trong MMS lỏng có chứa acetosyringone 200µM và đo OD
của dung dịch pha loãng ở các giá trị OD600 = 0,25, OD600 = 0,5 và OD600 = 0,7. Các dung dịch có OD600 này sẽ được sử dụng để ngâm mô sẹo phôi hóa.
b. Qui trình biến nạp
Các cụm mô sẹo phôi hóa từ 14-20 ngày tuổi có màu vàng tươi và tơi xốp được chọn và tách ra để sử dụng cho thí nghiệm biến nạp
Đổ dịch vi khuẩn đã chuẩn bị vào ống fancol 50ml có chứa mô sẹo phôi hóa , sau đó để trên máy lắc ở nhiệt độ phòng, khoảng 5 phút. Loại bỏ dung dịch, thấm khô mô sẹo phôi hóa bằng giấy lọc tuyệt trùng. Sau đó, chuyển mô sẹo phôi hóa sang môi trường đồng nuôi cấy (môi trường MMS có bổ sung AS (acetosyringone) 200µM) trong 4 ngày ở điều kiện chiếu sáng 16h/ ngày và nhiệt độ 280C.
c. Loại bỏ vi khuẩn sau biến nạp
Khối mô sẹo được biến nạp sau 4 ngày đồng nuôi cấy tiến hành rửa mô phôi để loại bỏ vi khuẩn. Rửa mô bằng dung dịch MMS đã khử trùng có bổ sung kháng sinh Cefotaxime để diệt khuẩn. Sau đó, thấm khô mô phôi bằng giấy thấm tiệt trùng và chuyển chúng sang môi trường nhân mô sẹo (MMS) có bổ sung Cefotaxime ở các nồng độ từ 0, 300, 400, 500, 600, 700 mg/l. Sau một tuần thấy mô sẹo phôi hóa không
bị nhiễm khuẩn trở lại thì cấy chuyển sang môi trường MMS không có kháng sinh và tiếp tục nuôi cấy trong 2 – 3 tuần nữa.
Xác định nồng độ Cefotaxime thích hợp để chọn lọc mô sẹo phôi hóa sau biến