b. Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
3.5. Kết quả chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa của giống TMS60444
Sự dung hợp ADN ngoại lai phụ thuộc vào dạng tế bào thực vật và điều kiện nuôi cấy thích hợp của chúng [64]. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng mô sẹo phôi hóa làm nguyên liệu chuyển gen nhờ sự kết hợp với vi khuẩn A. Tumefaciens
Hình 12: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào sắn thông qua A. tumefaciens
Quy trình chuyển gen vào cây sắn được khái quát như sau:
Thân cây sắn in vitro được cắt thành các đoạn ngắn chứa chồi nách. Nuôi cấy đoạn thân 2 ngày trong tối tại môi trường CAM bổ sung BAP 10mg/L ở 28oC để chồi nách được phát triển. Ngắt chồi nách và chuyển đến môi trường CIM
Môi trường chứa picloram 12mg/l để chồi nách được cảm ứng tạo mô sẹo trong 2 tuần ở điều kiện 28oC và không có ánh sáng. Chọn khối mô sẹo đặc chắc và chuyển đến môi trường DKW chứa 12mg/l picloram để mô sẹo tiếp tục được cảm ứng và phát triển thành các khối mô sẹo mới trong thời gian 2 tuần ở điều kiện 28oC và không có ánh sáng. Tiếp tục lựa chọn các khối mô sẹo đặc chắc và cấy chuyển sang môi trường MMS chứa picloram 12mg/l để cảm ứng tạo được mô sẹo phôi hóa. Nuôi cấy mô sẹo phôi hóa trong môi trường MMS chứa picloram 12mg/l trong thời gian 8-10 tuần, cứ 2 tuần một lần mô sẹo phôi hóa được chuyển sang môi trường MMS và điều kiện nuôi cấy là không có ánh sáng ở 28oC để thu được lượng lớn mô sẹo phôi hóa tinh sạch.
Ngâm mô sẹo phôi hóa từ 2-4 phút trong dịch khuẩn chuẩn bị có chứa AS và đồng nuôi cấy tại môi trường MMS chứa AS + picloram 12mg/l trong thời gian 4 ngày ở nhiệt độ 28o
C với thời gian chiếu sáng là 16h/ ngày. Khối mô sẹo phôi hóa sau biến nạp sẽ được nuôi cấy trong môi trường tái sinh có bổ sung chất chọn lọc để tạo được cây sắn chuyển gen (Hình 12). Quy trình này tương tự như quy trình có trong các nghiên cứu của Zainuddin và cs, 2012; Michael Niklaus và cs, 2011. Mục tiêu chung của các quy trình là đều tạo được mô sẹo phôi hóa để làm nguồn nguyên liệu phục vụ cho chuyển gen mong muốn thông qua vi khuẩn Agrobacterium. Tuy nhiên, quy trình
nghiên cứu của chúng tôi có cải tiến một số thành phần môi trường ở giai đoạn cảm ứng tạo mô sẹo phôi hóa để chất lượng mô sẹo phôi hóa tạo ra tốt hơn.
a. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch khuẩn đến khả năng tiếp nhận gen của mô sẹo phôi hóa ở giai đoạn tái sinh
Nồng độ dung dịch khuẩn có ảnh rất lớn đến hiệu quả biến nạp. Nồng độ khuẩn quá cao sẽ dẫn đến khả năng khối mô sẹo phôi hóa bị nhiễm khuẩn trở lại là rất lớn, điều này sẽ làm ảnh hưởng đến khả năng sống và khả năng tái sinh của khối mô sẹo phôi hóa sau biến nạp. Nếu nồng độ khuẩn quá thấp thì hiệu quả biến nạp vào mô sẹo phôi hóa thấp. Nghiên cứu này thăm dò khả năng sống và khả năng tiếp nhận gen của khối mô sẹo phôi hóa khi được biến nạp bởi các nồng độ khuẩn khác nhau. Từ đó sẽ tìm ra nồng độ khuẩn thích hợp nhất để sử dụng cho các thí nghiệm biến nạp sau này.
Thử nghiệm khả năng biểu hiện gen GFP của cụm mô sẹo phôi hóa tái sinh ở các giá trị OD600 = 0,25; 0,5 và 0,7 cho thấy, tại giá trị OD600=0,5, mô sẹo phôi hóa biểu hiện gen GFP lớn nhất với tỷ lệ 11,5% tổng số mô sẹo được thử nghiệm. Tỷ lệ này cao gấp 4 và 2 lần tỷ lệ biểu hiện mô sẹo khi được xử lý trong dịch khuẩn có giá trị OD600 = 0,25 và 0,7 (Bảng 13)
CT OD600 Lần thí nghiệm Số cụm mô sẹo phôi hóaban đầu sử dụng cho biến nạp Tỷ lệ cụm mô sẹo phôi hóa biểu hiện gen GFP trong môi trƣờng tái sinh (%) Tỷ lệ trung bình đối với cụm mô sẹo phôi hóa biểu hiện gen GFP (%) 1 0,25 1 150 2 2,7 2 150 3,3 2 0,5 1 150 10,2 11,5 2 150 12,7 3 0,7 1 150 5,4 5 2 150 4,6
Tỷ lệ cụm mô sẹo phôi hóa biểu hiện gen GFP lớn nhất là 11,5% khi sử dụng dịch khuẩn có OD600 = 0,5 cho biến nạp, tỷ lệ này giảm đi rất nhiều khi sử dụng dịch khuẩn có OD600 = 0,25 và OD600 = 0,7 để biến nạp (Bảng 13). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của một số nhà khoa học Thụy Sĩ nghiên cứu về chuyển gen vào cây sắn [65].
Dưới đây là hình ảnh cụm mô sẹo phôi hóa biểu hiện genGFP sau biến nạp 16 tuần tuổi ở môi trường tái sinh MSN với các công thức OD600 khác nhau khi soi dưới kính hiển vi phát huỳnh quang.
Hình 13: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD600 = 0,5
biểu hiện gen GFP.
(A), (C): hình ảnh chồi tái sinh soi dưới ánh sáng trắng; (B), (D): hình ảnh chồi tái sinh soi dưới đèn phát huỳnh quang. Vùng khoanh đỏ là vị trí biểu hiện của gen GFP
Hình 14: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD600 = 0,7
Hình 15: Chồi tái sinh của cụm mô sẹo phôi hóa ngâm trong dịch khuẩn có OD600 = 0,25
biểu hiện gen GFP.
b. Ảnh hƣởng của Cefotaxime đến sự diệt khuẩn có trên mô sẹo phôi hóa và khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo phôi hóa
Sự ảnh hưởng của chất kháng sinh Cefotaxime đến tỉ lệ sống và khả năng tái sinh chồi của mô sẹo phôi hóa sắn được thể hiện khi bổ sung kháng sinh Cefotaxime từ nồng độ 300 đến 600 mg/l vẫn cho tỉ lệ sống của mô sẹo phôi hóa đạt 100% trên tất cả các công thức. Điều đó cho thấy mô sẹo phôi hóa có khả năng sống rất mạnh mặc dù đã bị ức chế bởi kháng sinh Cefotaxime. Kháng sinh Cefotaxime ức chế khả năng tái sinh và ảnh hưởng đến thời gian hình thành chồi từ mô sẹo phôi hóa. Điều này được thể hiện rõ qua các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển như: thời gian tạo chồi, màu sắc chồi… (Bảng 11). Khi không bổ sung Cefotaxime thì tỷ lệ mô sẹo phôi hóa sau biến nạp bị nhiễm khuẩn lại là 100%. Bổ sung Cefotaxime 400mg/l có tỷ lệ mô sẹo bị nhiễm khuẩn lại thấp (chỉ khoảng 10,2%), tỷ lệ tạo chồi đạt được 68,7% là cao nhất so với các nồng độ Cefotaxime còn lại, thời gian bắt đầu tạo chồi ngắn và số lá trên cụm mô sẹo nhiều (xem bảng 12). Khi bổ sung các nồng độ Cefotaxime 300mg/l vào môi trường nuôi cấy mô sẹo phôi hóa thì tỷ lệ tạo chồi và thời gian bắt đầu tạo chồi tương tự với nồng độ Cefotaxime 400mg/l nhưng tỷ lệ mô sẹo bị nhiễm khuẩn lại thì cao hơn. Bổ sung 500mg/l hoặc 600mg/l vào môi trường nuôi cấy mô sẹo phôi hóa thì tỷ lệ tạo chồi thấp hơn và thời gian tạo chồi dài hơn so với khi bổ sung các nồng độ
300mg/l và 400mg/l. Vì vậy nồng độ Cefotaxime 400mg/l là nồng độ thích hợp nhất để loại bỏ khuẩn trên cụm mô sẹo phôi hóa sau biến nạp.
Bảng 12. Ảnh hƣởng của Cefotaxime đến tỉ lệ sống và khả năng tái sinh từ mô sẹo phôi hóa
của TMS 60444(theo dõi sau 8 tuần)
CT Cefotaxime (mg/L) Số cụm mô sẹo phôi hóa
Các chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ cụm mô sẹo bị nhiễm khuẩn lại (%) Tỷ lệ tạo chồi (%) Thời gian bắt đầu tạo chồi (ngày) số lá/cụm (lá) CT1 0 50 100 10 30 2,2 CT2 300 50 20,3 65,7 25,6 3,7 CT3 400 50 10,2 68,7 26,3 3,1 CT4 500 50 5,6 24,5 27 2,1 CT5 600 50 0 14,7 30,3 1,5 CT6 700 50 0 0
Theo một số nghiên cứu, biến nạp gen được thực hiện khi tế bào thực vật đang phân chia mạnh và có sự tổ hợp ADN trong tế bào. Mặt khác, sự dung hợp ADN ngoại lai phụ thuộc vào dạng tế bào thực vật và điều kiện nuôi cấy thích hợp của chúng [64]. Trong nghiên cứu này, mô sẹo phôi hóa 15 ngày tuổi là thích hợp để chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Dựa vào bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens chỉ nhiễm vào các tế bào bị thương đang phân chia mạnh, do các tế bào này tiết ra các hợp chất có nguồn gốc phenol như acetosyringone (là một chất dẫn dụ vi khuẩn A. tumefaciens) cần thiết cho quá trình xâm nhập T-ADN của A. tumefaciens vào tế bào. Do đó, trước khi lây nhiễm với vi khuẩn, phải bổ sung thêm acetosyringone để kích thích sự xâm nhiễm của vi khuẩn vào mô sẹo phôi hóa. Các khối mô sẹo phôi hóa được đưa vào ống falcon 30ml chứa dung dịch vi khuẩn ở các nồng độ OD600 = 0,25; OD600 = 0,5 và OD600 = 0,7 có bổ sung acetosyringone 200M, lắc nhẹ 5 phút. Sau đó mẫu được lấy ra cho lên giấy
thấm khô và đặt vào môi trường MMS có bổ sung 200μM acetosyringone. Thời gian đồng nuôi cấy là 4 ngày ở nhiệt độ 240C, điều kiện chiếu sáng là 16h/ ngày. Đây là môi trường làm cho tế bào có khả năng phân chia mạnh, thành tế bào mỏng tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xâm nhập của vi khuẩn và nhiệt độ 24oC cũng là nhiệt độ tối ưu cho quá trình này.
Khả năng chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens phụ thuộc khá nhiều vào đối tượng cây trồng, nguồn mẫu lây nhiễm. Một số cây trồng, quá trình sinh trưởng đã sản sinh ra phytoxic là chất có khả năng ức chế sinh trưởng rất mạnh đối với vi khuẩn [27]. Khi được đồng nuôi cấy với mô sẹo phôi hóa của sắn, sự sinh trưởng của vi khuẩn A.
tumefaciens là khá mạnh và không phụ thuộc vào phương pháp lây nhiễm. Rõ ràng, trên đối tượng này, vi khuẩn A. tumefaciens dễ dàng sinh trưởng và phát triển. Đây là một thuận lợi cho quá trình lây nhiễm nhưng lại là khó khăn ở giai đoạn kế tiếp. Thông thường, nếu vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mạnh trong quá trình đồng nuôi cấy, quá trình phục hồi cũng như chọn lọc sau này sẽ rất khó khăn để loại bỏ được chính vi khuẩn này.
Trong quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens, việc bổ sung kháng sinh khi tiến hành diệt vi khuẩn A. tumefaciens có thể ảnh hưởng đến khả năng tái sinh [27], [44], [63]. Bên cạnh đó, cũng cần xác định được ngưỡng có tác dụng gây chết 100% của chất chọn lọc để làm cơ sở cho chọn lọc. Chính vì vậy, sự xác định ảnh hưởng của các yếu tố trên đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo phôi hóa của giống
TMS 60444 là rất quan trọng. Nguồn mẫu cấy là mô sẹo phôi hóa của khoai mì có thể
sử dụng kháng sinh Cefotaxime ở nồng độ từ 300 - 500mg/l để diệt vi khuẩn
A.tumefaciens.Sau 4 ngày đồng nuôi cấy, mô sẹo phôi hóa sẽ được rửa sạch 2 lần bằng
dung dịch 1/10MS lỏng có bổ sung Cefotaxime 500mg/l, sau đó tiếp tục chuyển mô sẹo phôi hóa vào môi trường MMS (là môi trường 1/10MS có bổ sung picloram 12mg/l) bổ sung Cefotaxime 400mg/l, theo dõi khối mô sẹo phôi hóa 1 tuần. Nếu có khối mô sẹo phôi hóa nào đó bị nhiễm khuẩn trở lại thì sẽ được rửa lại, tuy nhiên công đoạn này phải hạn chế đến mức tối đa vì nó ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi của mô sẹo phôi hóa ở giai đoạn tiếp theo. Những khối mô sẹo phôi hóa không bị nhiễm sẽ được tiếp tục chuyển sang môi trường MMS không có kháng sinh và sẽ được nuôi cấy trong 2-3 tuần nữa để tạo điều kiện cho những tế bào đã được biến nạp phân chia và
nhân lên với số lượng lớn sau đó chuyển sang môi trường tái sinh MSN giúp cho khối mô sẹo phôi hóa tái sinh tốt hơn.
KẾT LUẬN
1. Đã xác định được phương thức khử trùng mẫu sử dụng NaClO 0,7%, thời gian 15 phút tạo nguồn mẫu vô trùng cho nhân giống in vitro.
2. Đã xác định được thành phần môi trường và phản ứng của các giống trong tạo cụm chồi, nhân và kéo dài chồi:
+ Tạo cụm chồi: môi trường MS bổ sung BAP 3mg/l: giống HL 2004-28 đạt hệ số tạo cụm chồi cao nhất 4,28 và giống TMS 60444 đạt hệ số tạo cụm chồi thấp nhất 3,68.
+ Nhân cụm chồi: môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP: giống HL 2004-28 đạt hệ số nhân cụm chồi cao nhất 3,95 và giống TMS 60444 đạt hệ số nhân cụm chồi thấp nhất 3,37.
+ Kéo dài cụm chồi: môi trường MS bổ sung 0,2mg/l GA3: Hai giống KM 140 và KM 419 có hệ số kéo dài chồi khá cao (7,05 và 7,03). Giống TMS 60444 có hệ số kéo dài chồi thấp nhất là 5,12.
3. Đã xác định được khả năng tạo mô sẹo của 4 giống sắn nghiên cứu trong môi trường CIM bổ sung picloram 12mg/l: tỉ lệ tạo mô sẹo đạt 96,3% đối với giống TMS 60444; 88,7% đối với giống KM 140; 81,3% đối với giống KM 419 và 77,7% đối với giống HL 2004-28. Giống TMS 60444 cho chất lượng mô sẹo tốt nhất
4. Đã mô tả và xác định được khả năng tạo mô sẹo phôi hóa của giống TMS 60444 đạt 64,3% trên môi trường MMS bổ sung 12 mg/l picloram. Các giống sắn Việt Nam nghiên cứu không có khả năng tạo mô sẹo phôi hóa; 73,8% mô sẹo phôi hóa có khả năng bật chồi sau 20,7 ngày trên môi trường MSN bổ sung NAA 1mg/l và ra rễ trên môi trường CEM có chứa BAP 0,4 mg/l sau khoảng 69,8 ngày.
5. Bước đầu đã đánh giá được khả năng tiếp nhận gen của mô sẹo phôi hóa giống TMS 60444 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector pzy101- Asc:35s:GFP chứa gen chỉ thị GFP.
KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình tạo mô sẹo phôi hóa cho các giống sắn của Việt Nam và thử nghiệm các môi trường phù hợp để tái sinh chồi/cây từ mô sẹo phôi hóa.
- Tiếp tục thử nghiệm chuyển các gen mong muốn khác vào các giống sắn TMS 60444 và giống sắn của Việt Nam. Đánh giá sự tiếp nhận và biểu hiện của các gen ngoại lai đó qua GFP, PCR...
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bùi Lan Anh, Nguyễn Phan Cẩm Tú, Trần Nguyên Vũ, Bùi Văn Lệ(2008), “Xây dựng quy trình biến nạp gen bar- gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây khoai mì (Manihot esculenta Crantz) bằng phương pháp bắn gen”,Tạp chí phát triển
KH&CN, 11(1), tr. 90-95.
2. Phạm Văn Biên, Hoàng Kim(1995), Cây sắn, NXB Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 3. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật
trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp.
4. Nguyễn Đức Doanh (1998), “Tổng quan về cây chuyển gen từ 1986 – 1997”, Báo cáo hội nghị toàn quốc lần thứ nhất về công nghệ sinh học cây lúa, Huế. 5. Vũ Văn Kiên, Nguyễn Du Sanh (2011), Khảo sát sự phát sinh phôi thế hệ ở khoai
mì, Tạp chí phát triển KH&CN, 14(T3).
6. Trần Văn Minh(2003), Công nghệ sinh học thực vật, Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
7. Lã Tuấn Nghĩa, Trần Lan Hương, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (1995), “Bước đầu nghiên cứu chuyển gen vào cà chua qua Agrobacterium”,Tạp chí công nghệ sinh học ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 18 – 23.
8. Trần Ngọc Ngoạn (2007), Giáo trình cây sắn, NXB Nông nghiệp, Hà nội.
9. Nguyễn Quang Thạch (2007), Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Đại học
Sư phạm.
10. Đoàn Thị Phương Thùy, Bùi Trang Việt (2006), Tìm hiểu sự phát sinh phôi thế hệ từ mô sẹo có nguồn gốc lá khoai mì (Manihot esculenta Crantz) dòng cuống trầu,Tạp chí khoa học kĩ thuật Nông lâm nghiệp, (1), tr. 19-23.
11. Nguyễn Văn Uyển (1993), Tóm tắt lịch sử phát triển nuôi cấy mô thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
Tài liệu tiếng nƣớc ngoài
.
12. Abrahamian, P. and A. Kantharajah (2011), "Effect of Vitamins on In Vitro Organogenesis of Plant", American Journal of Plant Sciences, 2, pp. 669-674. 13. Akhter, J., M. Qutub, N. Burnham, and M. Akhtar (2001), "Genetically
modified foods: Health and safety issues", Annals of Saudi Medicine, 21(3-4), pp. 161-164.
14. Allem, A.C. (2002), "The Origins and Taxonomy of Cassava", in Cassava: