Nghiên cứu mức độ cảm nhiễm và đặc điểm mô bệnh học của bệnh do ký sinh trùng perkinsus spp gây ra trên tu hài (lutraria rhynchaena), nghêu bến tre (meretrix lyrata)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN - o0o - KIỀU THỊ ÁI VÂN NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ CẢM NHIỄM VÀ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CỦA BỆNH DO KÝ SINH TRÙNG Perkinsus spp GÂY RA TRÊN TU HÀI (Lutraria rhynchaena), NGHÊU BẾN TRE (Meretrix lyrata) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THÙY GIANG KHÁNH HÒA, 06/ 2015 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án xin trân thành cảm ơn gửi lời tri ân sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Thùy Giang tận tình dạy, hướng dẫn cho suốt thời gian thực hoàn thành đồ án tốt nghiệp Đồng cảm ơn thầy Lê Thành Cường, cô Hứa Thị Ngọc Dung, chị Nguyễn Thị Bảo Vân tạo điều kiện học hỏi giúp đỡ thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô Viện Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang tận tình truyền đạt kiến thức cho suốt năm học Với vốn kiến thức tiếp thu không tảng trình nghiên cứu mà sở vững để áp dụng vào thực tiễn sau Cảm ơn giúp đỡ cán quản lý phòng thí nghiệm môn Bệnh học Thủy sản, cho phép, tạo điều kiện hỗ trợ cho địa điểm sở vật chất để thực thí nghiệm cảm nhiễm trình thực tập Gửi lời biết ơn nặng lòng tới bố mẹ gia đình, lời cảm ơn chân thành đến bạn bè người sát cánh bên lúc khó khăn Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 06 năm 2015 Sinh viên thực Kiều Thị Ái Vân ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .vi MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.1.1 Tình hình nuôi giới 1.1.2 Tình hình xuất nuôi Việt Nam 1.2 Một số đặc điểm sinh học nghêu Bến Tre tu hài 1.2.1 Hệ thống phân loại phân bố 1.2.2 Hình thái cấu tạo chung nghêu tu hài 1.3 Bệnh Perkinosis động vật nhuyễn thể 1.3.1 Một số đặc điểm ký sinh trùng Perkinsus 1.3.2 Bệnh Perkinosis 10 1.4 Những nghiên cứu bệnh Perkinosis nhuyễn thể hai mảnh vỏ 10 1.4.1 Thế giới 10 1.4.2 Việt Nam 12 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 15 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16 2.3 Vật liệu nghiên cứu 16 2.3.1 Môi trường 16 2.3.2 Hóa chất 16 2.3.3 Dụng cụ thiết bị 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1 Thu mẫu 18 2.4.2 Xử lý mẫu 18 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 20 iii Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết mức độ cảm nhiễm Perkinsus sp 22 3.2 Nghiên cứu mô bệnh học 23 3.2.1 Biến đổi bệnh lý quan nghêu Perkinsus sp ký sinh 23 3.2.2 Biến đổi bệnh lý tu hài 26 3.3 Kích thước bào tử Perkinsus sp phân lập 26 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC 35 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tổng sản lượng khai thác NTTS giới (FAO, 2014) Hình 1.2: Tu hài Hình 1.3: Nghêu Hình 1.5: Ký sinh trùng Perkinsus sp Hình 1.6: Vòng đời Perkinsus sp (Choi & Park, 2010) Hình 1.7: Bản đồ phân bố loài Perkinsus (Denise P., 2011) Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16 Hình 2.2a: Cách đo mẫu 18 Hình 2.2b: Cách tách vỏ 18 Hình 2.2c: Lấy thịt 18 Hình 2.2d: Cân thịt 18 Hình 2.3: Các bước thực phương pháp mô bệnh học 19 Hình 2.4: Cắt mẫu cố định mô 20 Hình 2.5: Đo đường kính 20 Hình 3.1: Mô mang bình thường 24 Hình 3.2: Mô mang nhiễm Perkinsus sp 24 Hình 3.3: Biểu mô bệnh học quan tiêu hóa chân (400x) 25 Hình 3.4: Mang tu hài bình thường 26 Hình 3.5: Mang tu hài bị nhiễm 26 Hình 3.6: Màu thành tế bào Perkinsus sau tuần nuôi cấy 27 Hình PL.1: Màu môi trường FTM sau đun 36 Hình PL.2: Nuôi cấy Perkinsus 37 Hình PL.3: Cho NaOH vào ống lắc mẫu 37 Hình PL.4: Bể ổn nhiệt 37 Hình PL.5: Các loại máy li tâm sử dụng 37 Hình PL.6: Loại bỏ dịch 38 Hình PL.7: Định lượng buồng đếm 38 v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Sản lượng khai thác nuôi trồng thủy sản giới 2012 Bảng 1.2: Sản lượng cụ thể đến năm 2020 Bảng 2.1: Các loại thuốc hóa chất 16 Bảng 2.2: Danh mục dụng cụ thiết bị sử dụng 17 Bảng 2.3: Thang đánh giá mức độ cảm nhiễm Perkinsus (Mackin, 1966) 21 Bảng 3.1: Một số tiêu sinh học mức độ nhiễm Perkinsus 22 Bảng PL.1: Chiều dài vỏ, trọng lượng mang nghêu nuôi cấy 38 Bảng PL.2: Chiều dài vỏ, trọng lượng thịt nghêu nuôi cấy 39 Bảng PL.3: Chiều dài vỏ, trọng lượng thịt, mang tu hài nuôi cấy 40 Bảng PL.4: Cường độ cảm nhiễm mang nghêu 41 Bảng PL.5: Cường độ cảm nhiễm thịt nghêu 42 Bảng PL.6: Cường độ cảm nhiễm mang tu hài 43 Bảng PL.7: Đường kính Perkinsus kí sinh nghêu 44 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CĐCN Cường độ cảm nhiễm FAO Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên hợp quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) FTM Fluid Thioglycolate Medium Min Giá trị nhỏ Max Giá trị lớn NTHMV Nhuyễn thể hai mảnh vỏ NTTS Nuôi trồng thủy sản PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gen) TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh sp Loài chưa xác định tên spp Nhiều loài chưa xác định tên % Phần trăm cm Centimet µm Microme MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) gồm nhiều loài có giá trị kinh tế sử dụng phổ biến hàm lượng dinh dưỡng chúng cao, đặc biệt hàm lượng Protein Hơn nữa, hàm lượng Lipit thấp, thức ăn dễ tiêu hóa, ngán, chống béo phì Chúng ăn sinh vật phù du mùn bã hữu cơ, theo phương thức ăn lọc nên có tác dụng làm sạch, chống ô nhiễm, thân thiện với môi trường đối tượng quan trọng nghề nuôi trồng thủy sản Nuôi động vật hai mảnh vỏ ngày phát triển Việt Nam giới chiếm tỷ trọng lớn nghề nuôi sản lượng lẫn giá trị Tuy nhiên, vài năm gần đây, tượng chết hàng loạt tu hài, nghêu dịch bệnh gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế môi trường Trong đó, ký sinh trùng Perkinsus cho nguyên nhân gây tình trạng chết thiệt hại lớn vùng nuôi nhuyễn thể Perkinsus ký sinh trùng đơn bào nội ký sinh nhuyễn thể, chủ yếu NTHMV Nhiều loài Perkinsus gây chết nhuyễn thể, lúc có dấu hiệu bệnh lý rõ rệt Tuy nhiên, Việt Nam thời điểm tại, thông tin xác mức độ cảm nhiễm ký sinh trùng Perkinsus đặc điểm bệnh lý học khiêm tốn Xuất phát từ yêu cầu thực tế đồng ý Viện nuôi trồng Thủy sản thực đề tài “Nghiên cứu mức độ cảm nhiễm đặc điểm mô bệnh học bệnh ký sinh trùng Perkinsus spp gây tu hài (Lutraria rhynchaena), nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata)” Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu mức độ cảm nhiễm đặc điểm biến đổi bệnh lý đặc trưng ký sinh Perkinsus spp gây tu hài (Lutraria rhynchaena), nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) làm sở cho nghiên cứu sâu Nội dung nghiên cứu (1) Xác định mức độ cảm nhiễm thông qua số cường độ cảm nhiễm tỷ lệ cảm nhiễm (2) Tìm hiểu biến đổi bệnh lý mô tế bào nhuyễn thể hai mảnh vỏ bị Perkinsus sp ký sinh Ý nghĩa nghiên cứu Xác định số liệu khoa học mức độ cảm nhiễm tác hại ký sinh trùng Perkinsus spp gây tu hài (Lutraria rhynchaena), nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) làm sở đề xuất hướng phòng tránh bệnh nghiên cứu ứng dụng khác Kết nghiên cứu hy vọng góp phần xác định đối tượng vật chủ Perkinsus đánh giá vai trò Perkinsus việc gây chết cho loài NTHMV hay không để từ đề hướng khắc phục Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.1.1 Tình hình nuôi giới Nghề nuôi NTHMV ngày phát triển mạnh, sản lượng nuôi trồng thủy sản liên tục tăng năm thập kỷ qua (hình 1.1) Theo tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO), năm 2010, sản lượng nuôi NTHMV tăng lên 12,91 triệu Trong đó, sản lượng nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ tăng gấp đôi từ 2,35 triệu lên 4,88 triệu (FAO, 2012) Hình 1.1: Tổng sản lượng khai thác NTTS giới (FAO, 2014) Trong năm 2012, nhuyễn thể đứng thứ sản lượng (15,2 triệu tấn) nhiều gấp đôi so với giáp xác (6,4 triệu tấn) Trong thực tế, sản phẩm từ nhuyễn thể (như ngọc trai) phần lớn xuất phát từ nước Châu Á Năm 2007, 80% sản lượng động vật nhuyễn thể giới có nguồn gốc từ Châu Á, số có 90% NTHMV (FAO, 2009) Bảng 1.1: Sản lượng khai thác nuôi trồng thủy sản giới 2012 (FAO, 2014) Nhóm loài Cá Giáp xác Nhuyễn thể Các loài khác Tổng Sản lượng khai thác (triệu tấn) 38,599 2,530 0,287 0,530 41,496 Nuôi trồng (triệu tấn) 5,552 3,917 14,884 0,335 24,687 Tổng sản lượng Triệu 44,151 6,447 15,171 0,865 66,633 % 66,3 9,7 22,8 1,3 100 Tổng giá trị Triệu USD 87 499 30 864 15 857 512 137 732 % 63,5 22,4 2,5 2,5 100 30 11 Ngô Anh Tuấn, 2012 Kỹ thuật nuôi động vật thân mềm Nhà xuất Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh, 2012 12 Ngô Thị Thu Thảo, (2008), “Một số đặc điểm ký sinh trùng Perkinsus sp lây nhiễm nghêu lụa Paphia undulate Kiên Giang Bà Rịa’’, Tạp chí Khoa học 2008 (1): 222-230 Trường Đại học Cần Thơ 13 Ngô Thị Ngọc Thủy, (2011), “Điều tra, nghiên cứu bệnh số đối tượng nhuyễn thể nuôi vùng ven biển Việt Nam”, Báo cáo tổng hợp chương trình khoa học công nghệ Bộ Khoa học Công nghệ 14 Ngọc Thúy, 2013 Một số kết nghiên cứu bước đầu tác nhân gây dịch bệnh Tu hài nuôi Việt Nam Trang thông tin điện tử Tổng Cục Thủy sản http://www.fistenet.gov.vn 15 Trang thông tin điện tử Tổng Cục Thủy sản, (2015), “Hà Tĩnh thiệt hại tỷ đồng tình trạng ngao chết hàng loạt”, http://www.fistenet.gov.vn 16 Trung tâm thông tin công nghiệp thương mại, (2014), “Xuất nhập khẩu”, http://www.asemconnectvietnam.gov.vn 17 Vasep, 2015, Xuất nhuyễn thể mảnh vỏ tăng trưởng nhẹ, http://vasep.com.vn/ B Tài liệu Tiếng Anh 18 Andrews, J.D., (1988), “Epizootiology of the disease caused by the oyster pathogen Perkinsus marinusand its effects on the oyster industry”, Am Fish Soc Spec Pub 18, pp 47–63 19 Andrea Ramilo, Noelia Carrasco, Kimberly S Reece, José M Valencia, Amalia Grau, Patricia Aceituno, Mauricio Rojas, Ignasi Gairin, M Dolores Furones, Elvira Abollo, Antonio Villalba, (2015), “Update of information on perkinsosis in NW Mediterranean coast: Identification of Perkinsus spp (Protista) in new locations and hosts”, Journal of Invertebrate Pathology 125, pp 37–41 20 Auzoux-Bordenave, S., A.M Vigario, F Ruano, I Domart-Coulon and D Doumenc, (1995), “In vitro sporulation of the clam pathogen Perkinsus atlanticus (Apicomplexa, Perkinsea) under various environmental conditions”, Journal of Shellfish Research 14, pp 469–475 21 Azevedo, C., (1989), “Fine structure of Perkinsus atlanticus n.sp (Apicomplexa, Perkinsea) under various environmental conditions”, J Shellfish Res 14, pp 469-475 31 22 Bower SM, Blackbourne J, Meyer GR, (1998), “Distribution, prevalence and pathogenicity of the protozoa Perkinsus quagwadi in Japanese scallops, Patinopecten yessoensis cultured in British Columbia, Canada”, Can J Zool 76, pp 954–959 23 Burreson E.M., Ragone Calvo L.M., (1996), “Epizootiology of Perkinsus marinus disease of oysters in Chesapeake Bay”, with emphasis on data since 1985 J Shellfish Res 15, pp 17-34 24 Carrasco, N., Rojas, M., Aceituno, P., Andree, K.B., Lacuesta, B., Furones, M.D., (2014), “Perkinsus chesapeaki observed in a new host, the European common edible cockle Cerastoderma edule, in the Spanish Mediterranean coast”, Journal of Invertebrate Pathology 117, pp 56–60 25 Casas S.M., Villalba A., Reece K.S., (2002), “Study of perkinsosis in the carpet shell clam Tapes decussatus in Galicia (NW Spain) I Identification of the aetiological agent and in vitro modulation of zoosporulation by temperature and salinity” Dis Aquat Org 50, pp 51-65 26 Choi K.S., Wilson E.A., Lewis D.H., Powell E.N., Ray S.M., (1989), “The energetic cost of Perkinsus marinus parasitism in oysters: quantification of the thioglycollate method”, Journal of Shellfish Research 8, pp 125–131 27 Choi, K.-S., K.-L Park, K.-W Lee and K Matsuoka, (2002), “Infection intensity, prevalence and Perkinsus sp in the Manila clam, Ruditapes philippinarum, in Isahaya bay”, Jpn J Shellfish Res 21, pp 119– 125 28 Choi, K.S., Park, K.I., (2010), “Review on the protozoan parasite Perkinsus olseni (Lester and Davis 1981) infection in Asian waters”, In: Ishimatsu, A., Lie, H.J (Eds.), Coastal Environmental and Ecosystem Issues of the East China Sea Nagasaki University, Terrapub, Tokyo, pp 269–281 29 Darriba, S., Ramilo, A., Abollo, E., Villalba, A., (2010), “Detection of Perkinsus olseni infecting the cockle Cerastoderma edulein Galicia (NW Spain) Aquaculture Europe (2010 Porto)”, Aquaculture Europe 10: Sea farming tomorrow Eur Aquacult Soc 170, pp 356–357 30 Denise Petty, (2011), Perkinsus Infections of Bivalve Molluscs, University of Florida IFAS Extension, http://edis.ifas.ufl.edu/index.jsp 32 31 Dungan CF, Hamilton RM, (1995), Use of a tetrazolium-based cell proliferation assay to measure effects of in vitro conditions on Perkinsus marinus (Apicomplexa) proliferation J Eukaryot Microbiol 42:379–388 32 Elandaloussi, L.M., Carrasco, N., Roque, A., Andree, K., Furones, M.D., (2009), “First record of Perkinsus olseni, a protozoan parasite infecting the commercial clam Ruditapes decussatusin Spanish Mediterranean waters”, J Invertebr Pathol 100, pp 50–53 33 FAO, 2009, Fisheries and Aquaculture Department 2009 34 FAO, 2012, Fisheries and Aquaculture Department 2012 35 FAO, 2014, The State of World Fisheries and Aquaculture 2014 36 Hamaguchi, M N Suzuki, H Usuki and H Ishioka, (1998), “Perkinsus protozoan infection in the shortnecked clam, Tapes (=Ruditapes) philippinarum, in Japan”, Fish Pathology 33, pp 473–480 37 Howard, D W., E J Lewis, B J Keller, and C S Smith 2004 Histological techniques for marine bivalve mollusks and crustaceans NOAA Technical Memorandum NOS NCCOS 5, 218 pp 38 Jorgen Hylleberg & Rirchard N.Kilburm, (2003), Marine Molluscs of Viet Nam, Tropical marine molluscs programme (TMMP) 39 Lassalle, G., de Montaudouin, X., Soudant, P., Paillard, C., (2007), “Parasite coinfection of two sympatric bivalves, the Manila clam (Ruditapes philippinarum) and the, cockle (Cerastoderma edule) along a latitudinal gradient”, Aquat Living Resour, 20, pp 33–42 40 Laurence M Elandaloussi, Noèlia Carrasco, Ana Roque, Karl Andree, M Dolores Furones, (2009), “First record of Perkinsus olseni, a protozoan parasite infecting the commercial clam Ruditapes decussatus in Spanish Mediterranean waters”, Journal of Invertebrate Pathology 100, pp 50–53 41 La Peyre M, Casas S, La Peyre J., (2006), Salinity effects on viability, metabolic activity, and cellular proliferation of three Perkinsusspecies Dis Aquat Org 71:59–74 42 Levine, N D., (1978), “Perkinsus gen n and other new taxa in the protozoan phylum Apicomplexa” J Parasitol 64(3):549 33 43 Mackin, J.G., Owen, H.M., Collier, A., (1950), “Preliminary note on the occurrence of a new protistan parasite, Dermocystidium marinumn sp in Crassostrea virginica(Gemlin)” Science 111, pp 328–329 44 Mackin J.G., Boswell J.L., (1956), “The lyfe cycle and relationships of Dermocystidium marinum”, Proc Natl Shellfish Assoc 46, pp 112-115 45 Mackin J G, (1962), “Oyster diseases caused by Dermocvslulium manniim and other organisms in Louisiana”, Piibl Inst Mar Sci Univ Tex 7, pp 132-229 46 Mackin, J.G., Ray, S.M., 1966, The taxonomic relationships of Dermocystidium marinum Mackin, Owen and Collier J Invertebr Pathol 8, pp 544-545 47 Maeno, Y., T Yoshinaga and K Nakajima (1999), “Occurrence of Perkinsus species (Protozoa, Apicomplexa) from Manila clam, Tapes philippinarum, in Japan”, Fish Pathology, 34, pp 127–131 48 Moss, J.A., J Xiao, C.F Dungan and K.S Reece, (2008), “Description of Perkinsus beihaiensis n sp., a new Perkinsus sp parasite in oysters of southern China”, Journal of Eukaryotic Microbiology 55, pp 117-130 49 Navas, J.I., 1992 Castillo, M.C., Vera, P., Ruiz-Rico, M., (1992), “Principal parasites observed in clams, Ruditapes decussatus (L.), Ruditapes philippinarum (Adams et Reeve), Venerupis pullastra (Montagu), and Venerupis aureus (Gmelin), from Huelva coast (S.W Spain)”, Aquaculture 107, pp 193-199 50 OIE, 2012 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2012 51 Park K., Choi K.S., Choi J.W., 1999, “Epizootiology of Perkinsus sp found in the manila clam Ruditapes philippinarum in Komsoe Bay’’, Korea J Korean Fish Soc, 32, pp 303-309 52 Park, K.I and K.S Choi, (2001), “Spatial distribution of the protozoan parasite, Perkinsus sp found in the Manila clam, Ruditapes philippinarum, in Komsoe Bay, Korea”, J Kor Fish Soc, 32, pp 303-309 53 Perkins F.O., (1996), “The structure of Perkinsus marinus (Mackin, Owen and Collier 1950) Levine, 1978 with comments on taxonomy and phylogeny of Perkinsus spp”, J Shellfish Res, 15, pp 67-87 34 54 Perkinosis to the European shellfish industry, Vigo, Spain, 12-14 Septermber 2008, (Eds Villalba A.) Centro Tecnológico del Mar -Fundación CETMAR, Spain, pp 79-109 55 Prokop, J F, (1950), “Infection and culture procedures employed in the study of Dermocytidium marinum”, Report submitted to Texas A&M Research Foundation, Galveston Texas (mimeographed) 56 Ray, S- M (1954a), “Biological studies of Dermocystidium marinum” Rice Institute Pamphlet, Special Issue The Rice Institute Houston, Texas, November, pp 111-114 57 Ray, S M, (1952a), “Cultural studies of Dermocystidium marinum with special reference to diagnosis of this parasite in oysters” M.S thesis The Rice Institute, Houston, Texas 3014, pp 360-361 58 Ray, S M, (1952b), “A culture technique for the diagnosis of infection with Dermocystidium marinum in oysters”, Natl Shellfish Assoc Convention Addresses, pp 9-13 59 Rodriguez, F., Navas, J.I., (1995), “A comparison of gill and hemolymph assays for the thioglycollate diagnosis of Perkinsus atlanticus (Apicomplexa, Perkinsea) in clam, Ruditapes decussatus (L.) and Ruditapes philippinarum (Adams and Reeve)”, Aquaculture 132, pp 145-152 60 Sparks, A K, (1985), Synopsis of Invertebrate Pathology-exclusive of Insects, Elsevier Science Publishers B.V,, Amsterdam 61 Stein J E & J G Mackin, (1957), “An evaluation of the culture method used in deteniiining the intensity of Dermocystidium marinum in the oyster C virginiea”, Texas A&M Res Found Project 23, Tech Rept 22, pp 1-5 62 Supannee L., Kashane C E., Upatham S., Choi K.S., Sawangwong P., Kruatrachue M., (2004), “Occurrence of Perkinsus sp in Undulated surf clams Paphia undulata from the Gulf of Thailand”, Disease of Aquaculture Organisms 60, pp 165 –171 63 Thao T.T Ngo, Kwang-Sik Choi, (2004), “Seasonal changes of Perkinsus and Cercaria infections in the Manila clam Ruditapes philippinarum from Jeju, Korea”, Aquaculture 239, pp 57 – 68 64 The fish site (2011), Perkinsus Infections Of Bivalve Molluscs 35 65 Villalba, A., K.S Reece, M.C Ordás, S.M Casas and A Figueras (2004), “Perkinsosis in molluscs: A review”, Aquatic Living Resources 17, pp 411-432 66 Villalba, A., Gestal, C., Casas, S.M., Figueras, A., (2011), “Perkinsosis en moluscos In: Enfermedades de Moluscos Bivalvos de Interés en Acuicultura”, Fundación Observatorio Español de Acuicultura, Madrid, pp 181–242 67 Waki, T., Shimokawa, J., Watanabe, S., Yoshinaga, T., Ogawa, K., (2012), “Experimental challenges of wild Manila clams with Perkinsus species isolated from naturally infected wild Manila clams” J Invertebr Pathol 111, pp 50–55 68 William S F and Leah M O., (1996), “A whole-oyster procedure for diagnosis of Perkinsus marinus disease using Ray’s Fluid Thioglycolate culture Medium”, pp 109-117 36 PHỤ LỤC Cách pha môi trường hóa chất Cách pha môi trường nuôi cấy Môi trường FTM: 29,7g Muối NaCl: 20g Nước cất: lít Đun hồn hợp môi trường FTM bếp khuấy từ môi trường chuyển màu vàng nhẹ (lưu ý: môi trường chuyển màu sôi nhanh) (hình 1.1) Hấp tiệt trùng giữ môi trường bóng tối, tránh oxi Hình PL.1: Màu môi trường FTM sau đun nhiệt độ phòng Dung dịch Davidson Nước biển: 1200 ml Formaline: 800 ml Ethanol 99,5%: 1200 ml Glycerin: 400 ml Acid acetic: 400 ml NaOH 2M: NaOH: 80g Nước cất: 1000ml Dung dịch Phosphate buffered saline (PBS) gốc: NaCl: 80g KCl: 2g Na2HPO4: 14,4g KH2PO4: 2,4g Nước cất: 800ml Cho thêm nước đủ 1000ml PBS gốc Khi dùng PBS gốc pha lên 10 lần 37 Quy trình nuôi cấy Quy trình nuôi cấy Perkinsus (Choi et al.) 1) Ủ ống nghiệp chứa mẫu môi trường tủ nuôi cấy tuần (hình 2.1) 2) Cho NaOH 2M đến mức 14 ml ống tube15ml (đối với thí nghiệm dùng mang nghêu/tu hài) đến mức 30 ml ống tube 45 ml thịt tu hài (hình 2.2), sau lắc mẫu cho máy lắc (hình 2.2) 3) Ủ ống nghiệm bể ổn nhiệt 60oC 30 – 40 phút (hình 2.3) 4) Ly tâm 3.000rpm phút (hình 2.4) 5) Bỏ phần dịch phía (hình 2.5) 6) Lập lại quy trình từ bước đến vài lần phần tiêu hủy hoàn toàn 7) Bổ sung dung dịch PBS Sử dụng buồng đếm hồng cầu để định lượng Perkinsus (hình 2.6) Hình PL.2: Nuôi cấy Perkinsus Hình PL.4: Bể ổn nhiệt Hình PL.3: Cho NaOH vào ống lắc mẫu Hình PL.5: Các loại máy li tâm sử dụng 38 Hình PL.7: Định lượng buồng đếm Hình PL.6: Loại bỏ dịch Bảng số liệu Bảng PL.1: Chiều dài vỏ, trọng lượng mang nghêu nuôi cấy STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Chiều dài(cm) 4,20 4,33 3,96 3,96 4,07 4,15 3,77 3,62 3,93 3,92 3,94 4,00 4,19 3,77 4,25 3,70 3,95 3,80 4,12 3,97 3,98 4,05 4,03 3,80 3,93 4,06 3,62 3,70 4,38 PCơ thịt ban đầu(g) 2,7818 2,6274 3,7648 3,5993 3,4999 3,2873 3,9222 2,8318 3,0107 4,1586 3,5636 3,3856 3,8579 3,6932 3,7736 2,3690 2,8877 2,4570 3,0363 2,8969 3,8366 3,4521 3,4050 2,9342 2,5246 4,2179 2,0087 3,6536 3,4799 PMang (g) 0,1608 0,1817 0,3174 0,3940 0,2802 0,2263 0,3829 0,3046 0,3898 0,4238 0,3981 0,2972 0,4280 0,2567 0,2037 0,2382 0,2138 0,2550 0,2369 0,2225 0,3008 0,2910 0,2283 0,2729 0,1868 0,1305 0,3840 0,2398 0,2543 39 30 4,05 3,4514 0,2207 Bảng PL.2: Chiều dài vỏ, trọng lượng thịt nghêu nuôi cấy STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Chiều dài(cm) 3,89 3,40 3,77 3,86 3,91 3,85 4,12 4,08 3,50 3,80 3,99 3,51 3,80 3,67 4,15 3,62 3,46 3,14 3,42 3,50 3,41 3,70 3,43 3,66 4,05 3,52 4,49 4,58 3,47 4,23 P Toàn thân (g) P Không mang (g) 4,2672 2,1256 2,3858 2,8016 2,6049 2,5877 2,8403 3,3968 2,7934 3,1441 3,0332 3,0322 3,5272 3,0893 2,9842 2,3580 2,2765 2,5430 2,5893 1,5288 3,6115 2,2135 1,8727 2,7456 2,8653 2,7760 2,5341 2,4550 2,3569 3,7236 3,8956 1,9555 2,1990 2,6247 2,3786 2,4147 2,6677 3,1076 2,5716 2,9043 2,7972 2,3090 3,3294 2,8452 2,8040 2,1166 2,1200 2,3022 2,4361 1,3980 3,3020 2,0292 1,6876 2,5377 2,6420 2,5654 2,1068 2,2216 2,0853 3,3456 40 Bảng PL.3: Chiều dài vỏ, trọng lượng thịt, mang tu hài nuôi cấy STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Chiều dài(cm) 6,42 6,20 7,19 5,55 6,00 6,70 6,86 6,14 6,07 6,89 6,56 6,50 6,23 6,89 6,14 5,62 6,77 6,00 5,32 6,23 6,37 6,93 5,94 P Toàn thân(g) P Mang (g) P Còn lại (g) 13,9165 12,2537 18,5247 10,7555 12,5922 13,3730 18,0809 10,7042 11,4644 18,4302 14,0528 20,2895 10,0004 11,7084 11,7493 7,7987 13,9872 16,3287 8,1001 9,8207 8,3819 16,1802 11,9553 0,2373 0,3973 0,3348 0,6254 0,2318 0,2454 0,3631 0,2350 0,2066 0,3576 0,2751 0,1977 0,2651 0,2750 0,1682 0,1793 0,2363 0,4378 0,1240 0,1750 0,2991 0,2371 0,3365 10,6052 9,5152 13,2834 7,0546 10,0375 10,5342 12,8945 8,3041 8,3317 13,0165 10,2365 14,2733 8,5982 9,0514 9,1182 5,9326 10,7689 12,0875 5,8698 7,4294 5,9925 13,0067 9,4403 41 Bảng PL.4: Cường độ cảm nhiễm mang nghêu STT 4 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 Thể tích Trung Tổng số PBS chứa TWWT(g) bình Perkinsus Perkinsus 0,5 1.250 0,1608 0,5 1.250 0,1817 2,5 6.250 0,3174 1,75 4.375 0,3940 0,2802 0,2263 1 2.500 0,3829 0,5 1.250 0,3046 0,25 625 0,3898 0,25 625 0,4238 1,5 3.750 0,3981 1 2.500 0,2972 0,4280 0,2567 0,2037 0,25 625 0,2382 0,25 625 0,2138 0,5 1.250 0,2550 0,25 625 0,2369 0,25 625 0,2225 0,3008 0,2910 0,2283 0,25 625 0,2729 0,1868 0,25 625 0,1305 0,3840 0,2398 0,75 1.875 0,2543 0,2207 Bào tử/g mô 7.774 6.879 19.691 11.104 0 6.529 4.104 1.603 1.475 9.420 8.412 0 2.624 2.923 4.902 2.638 2.809 0 2.290 4.789 0 7.373 42 Bảng PL.5: Cường độ cảm nhiễm thịt nghêu STT 4 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 2 1 0 0 0 0 0 0 0 Thể tích Trung Tổng số PBS chứa bình Perkinsus Perkinsus 0 3,5 0,25 3,5 2.188 0 0,5 1.250 0,5 1.250 0 1 2.500 1,75 4.375 1,25 3.125 0,75 1.875 2,25 5.625 2,5 6.250 1 2.500 0,5 1.250 0,25 625 4,25 10.625 3,5 8.750 5.000 1,25 3.125 2,75 6.875 3,75 9.375 0,5 1.250 0,25 625 1,75 4.375 0,25 625 TWWT(g) Bào tử/g mô 3,8956 1,9555 2,1990 2,6247 2,3786 2,4147 2,6677 3,1076 2,5716 2,9043 2,7972 2,3090 3,3294 2,8452 2,8040 2,1166 2,1200 2,3022 2,4361 1,3980 3,3020 2,0292 1,6876 2,5377 2,6420 2,5654 2,1068 2,2216 2,0853 3,3456 0 995 0 518 469 0 861 1.564 1.353 563 1.977 2.229 1.179 543 257 7.600 4.312 2.963 1.231 2.602 3.654 593 281 2.098 187 43 Bảng PL.6: Cường độ cảm nhiễm mang tu hài STT 4 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Trun g bình 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0 0 Thể tích Tổng số PBS chứa TWWT(g) Perkinsus Perkinsus 0,2373 0,3973 0,3348 0,6254 0,2318 0,2454 0,3631 0,2350 0,2066 0,3576 0,2751 0,1977 0,2651 0,2750 0,1682 0,1793 0,2363 1.250 0,4378 0,1240 0,1750 0,2991 0,2371 0,3365 Bào tử/g mô 0 0 0 0 0 0 0 0 2.855 0 0 44 Bảng PL.7: Đường kính Perkinsus kí sinh nghêu STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 67,5 57,5 67,5 60 57,5 77,5 50 75 60 87,5 60 52,5 52,5 95 160 55,75 50 57,5 80 67,5 50 52,5 67,5 72,5 57,5 75 62,5 62,5 87,5 30 70 77,5 62,5 65 80 72,5 85 50 87,5 42,5 65 87,5 92,5 65 77,5 70 87,5 60 80 75 57,5 70 62,5 62,5 80 77,5 52,5 52,5 105 90 Đường kính Perkinsus (µm) 67,5 92,5 65 47,5 32,5 115 65 67,5 75 97,5 67,5 65 47,5 105 30 107,5 45 100 40 82,5 87,5 117,5 60 100 82,5 107,5 62,5 90 37,5 107,5 60 100 85 115 67,5 72,5 85 90 105 50 42,5 115 80 70 90 87,5 62,5 77,5 87,5 125 75 92,5 35 140 52,5 80 75 125 92,5 80 70 135 82,5 85 92,5 127,5 85 87,5 90 135 72,5 92,5 92,5 107,5 60 82,5 75 125 100 87,5 85 100 107,5 80 75 100 105 77,5 100 117,5 70 85 62,5 130 55 82,5 115 127,5 62,5 75 87,5 117,5 100 82,5 130 105 92,5 77,5 92,5 137,5 82,5 55 107,5 120 105 147,5 115 132,5 100 90 95 130 140 110 87,5 107,5 130 152,5 115 117,5 67,5 42,5 137,5 145 105 115 105 127,5 55 132,5 107,5 120 100 120 100 122,5 110 122,5 72,5 60 140 125 122,5 127,5 115 122,5 120 125 112,5 140 107,5 125 102,5 117,5 70 [...]... tu hài (Lutraria rhynchaena) và tỉnh Bến Tre đối với nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) 16 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu Nghiên cứu mức độ cảm nhiễm và đặc điểm mô bệnh học của bệnh do ký sinh trùng Perkinsus spp gây ra trên tu hài (Lutraria rhynchaena), nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) Xác định mức độ cảm nhiễm Tỷ lệ cảm nhiễm trên nghêu và tu hài Nghiên cứu mô bệnh học Xác định cơ quan bị cảm nhiễm. .. 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Ký sinh trùng Perkinsus sp ký sinh trên tu hài (Lutraria rhynchaena) và nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) Thời gian nghiên cứu Từ 02/03/2015 đến 07/06/2015 Địa điểm nghiên cứu Phòng nghiên cứu bệnh học thủy sản, trường Đại học Nha Trang Địa điểm thu mẫu Mẫu nhuyễn thể dùng cho nghiên cứu được thu... 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả mức độ cảm nhiễm Perkinsus sp Kết quả phân tích cho thấy sự hiện diện của Perkinsus sp trên nghêu Meretrix lyrata và tu hài Lutraria rhynchaena có sự khác nhau Qua bảng 3.1 cho thấy, mức độ cảm nhiễm của nghêu luôn cao hơn so với tu hài Cụ thể, trên cơ thịt tu hài không bị nhiễm trong khi phần lớn các mẫu nghêu kiểm tra đều bị nhiễm (25/30 nghêu) với CĐCN... bệnh học ở cơ quan tiêu hóa và cơ chân (400x) A: Cơ quan tiêu hóa bình thường B: Cơ quan tiêu hóa bị bệnh C: Cơ chân bình thường D: Cơ chân bị bệnh 26 3.2.2 Biến đổi bệnh lý trên tu hài Bằng phương pháp kiểm tra mô tươi và mô bệnh học, chúng tôi chỉ phát hiện được ký sinh trùng Perkinsus ở tổ chức mang của tu hài Hình 3.5 mô tả bào nang Perkinsus ký sinh tại cơ quan mang của tu hài Sự ký sinh của Perkinsus. .. trước đó, mẫu nghêu /tu hài được thu tại những địa điểm nuôi thương phẩm Mẫu nhuyễn thể thu được có kích thước cơ thể dao động từ 3,62 - 4,58 cm đối với nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) và từ 5,32 – 7,19 cm đối với tu hài (Lutraria rhynchaena ) Kết quả so sánh mức độ cảm nhiễm Perkinsus sp trên nghêu Meretrix lyrata ở Bến Tre với nghêu Meretrix lyrata tại vùng biển Cần Giờ (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2011)... kẹp Caliper 12 Ống tube 15ml và 45ml 13 Buồng đếm hồng cầu (Improved Neubauer) 14 Lam, lamen, đầu côn 15 Đèn cồn, bình tam giác (500 và 1000ml), ống đong, giấy lọc, giấy bạc 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Thu mẫu Mẫu tu hài/ nghêu dùng nghiên cứu mô bệnh học, mức độ cảm nhiễm Perkinsus sp được thu mua ngẫu nhiên ở Bến Tre (nghêu Bến Tre Meretrix lyrata) và ở Khánh Hòa (tu hài Lutraria rhynchaena)... mang nghêu nhiều gấp 4,57 lần cơ thịt Ở tu hài, cơ quan mang bị nhiễm với cường độ trung bình 124 bào tử/g nhưng phần cơ thịt không bị nhiễm  Bằng phương pháp mô bệnh học và nuôi cấy ký sinh trùng đã phát hiện mang là cơ quan đầu tiên bị nhiễm bệnh tiếp đến là tuyến tiêu hóa và cơ chân bò, không thấy xuất hiện trong tuyến sinh dục của nghêu  Chỉ tìm thấy ký sinh trùng Perkinsus trên mang của tu hài. .. kết quả nghiên cứu cho thấy Perkinsus là một tác nhân luôn hiện diện trên nghêu Tuy nhiên, chúng xuất hiện với mức độ cảm nhiễm cao vào những tháng nghêu có hiện tượng chết (tháng 2 đến tháng 4) và thấp hơn trong những tháng còn lại trong năm Kết quả nghiên cứu của chúng tôi về sự xuất hiện đầu tiên và cơ quan cảm nhiễm bào tử Perkinsus ở tu hài/ nghêu là tương tự với kết quả nghiên cứu của Thảo và Choi... Giang và Bà Rịa - Vũng Tàu Tỷ lệ nhiễm Perkinsus này biến động từ 67,5 - 100 % (Hà Tiên) và 100% (Bà Rịa) 14 Mức độ cảm nhiễm Perkinsus rất cao nhưng tác hại của tác nhân này đã không được ghi nhận Kết quả nghiên cứu trên nghêu Meretrix lyrata cho thấy sự hiện diện của kí sinh trùng Perkinsus với tỷ lệ cảm nhiễm trung bình là 60,1%, cao nhất vào tháng 2 (98,7%) và thấp nhất vào tháng 8 (18,1%) (Hảo và. .. 20 mm thu vào thời điểm nghêu chết (2/2010) và thời điểm không có hiện tượng chết (7/2010) đều có kết quả âm tính với ký 23 sinh trùng Perkinsus sp Trên nhóm nghêu thương phẩm có kích cỡ ≥30mm có tỷ lệ cảm nhiễm 59,7% (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2011) Cường độ cảm nhiễm của ký sinh trùng Perkinsus có tương quan tỷ lệ thuận với kích cỡ cơ thể ký chủ (Park và Choi, 2001; Park và ctv, 1999) Căn cứ trên các ... bệnh học bệnh ký sinh trùng Perkinsus spp gây tu hài (Lutraria rhynchaena), nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu mức độ cảm nhiễm đặc điểm biến đổi bệnh lý đặc trưng ký. .. gây tu hài (Lutraria rhynchaena), nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) Xác định mức độ cảm nhiễm Tỷ lệ cảm nhiễm nghêu tu hài Nghiên cứu mô bệnh học Xác định quan bị cảm nhiễm Cường độ cảm nhiễm nghêu. .. hài (Lutraria rhynchaena) tỉnh Bến Tre nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) 16 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu Nghiên cứu mức độ cảm nhiễm đặc điểm mô bệnh học bệnh ký sinh trùng Perkinsus spp gây