Nghiên cứu mức độ cảm nhiễm và đặc điểm mô bệnh học của bệnh do ký sinh trùng perkinsus spp gây ra trên tu hài (lutraria rhynchaena), nghêu bến tre (meretrix lyrata)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN --- o0o --- KIỀU THỊ ÁI VÂN NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ CẢM NHIỄM VÀ ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CỦA BỆNH DO KÝ SINH TRÙNG Perk

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

- o0o -

KIỀU THỊ ÁI VÂN

NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ CẢM NHIỄM VÀ ĐẶC ĐIỂM

MÔ BỆNH HỌC CỦA BỆNH DO KÝ SINH TRÙNG Perkinsus spp

GÂY RA TRÊN TU HÀI (Lutraria rhynchaena),

NGHÊU BẾN TRE (Meretrix lyrata)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

GVHD: ThS NGUYỄN THỊ THÙY GIANG

KHÁNH HÒA, 06/ 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này tôi xin trân thành cảm ơn và gửi lời tri ân sâu sắc đến

cô Nguyễn Thị Thùy Giang đã tận tình chỉ dạy, hướng dẫn cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành đồ án tốt nghiệp

Đồng cảm ơn thầy Lê Thành Cường, cô Hứa Thị Ngọc Dung, chị Nguyễn Thị Bảo Vân đã tạo điều kiện học hỏi và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô trong Viện Nuôi Trồng Thủy Sản, Trường Đại Học Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm học Với vốn kiến thức được tiếp thu không chỉ là nền tảng trong quá trình nghiên cứu mà còn là

cơ sở vững chắc để tôi có thể áp dụng vào thực tiễn sau này

Cảm ơn sự giúp đỡ của cán bộ quản lý phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh học Thủy sản, đã cho phép, tạo điều kiện và hỗ trợ cho tôi về địa điểm và cơ sở vật chất để thực hiện thí nghiệm cảm nhiễm trong quá trình thực tập

Gửi lời biết ơn và nặng lòng nhất tới bố mẹ và gia đình, lời cảm ơn chân thành nhất đến bạn bè những người luôn sát cánh bên tôi lúc khó khăn

Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 06 năm 2015 Sinh viên thực hiện

Kiều Thị Ái Vân

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ 3

1.1.1 Tình hình nuôi trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình xuất khẩu và nuôi ở Việt Nam 4

1.2 Một số đặc điểm sinh học của nghêu Bến Tre và tu hài 6

1.2.1 Hệ thống phân loại và phân bố 6

1.2.2 Hình thái cấu tạo chung nghêu và tu hài 7

1.3 Bệnh Perkinosis ở động vật nhuyễn thể 8

1.3.1 Một số đặc điểm của ký sinh trùng Perkinsus 8

1.3.2 Bệnh Perkinosis 10

1.4 Những nghiên cứu về bệnh Perkinosis ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ 10

1.4.1 Thế giới 10

1.4.2 Việt Nam 12

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16

2.3 Vật liệu nghiên cứu 16

2.3.1 Môi trường 16

2.3.2 Hóa chất 16

2.3.3 Dụng cụ và thiết bị 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 18

2.4.1 Thu mẫu 18

2.4.2 Xử lý mẫu 18

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 20

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Kết quả mức độ cảm nhiễm Perkinsus sp 22

3.2 Nghiên cứu mô bệnh học 23

3.2.1 Biến đổi bệnh lý ở các cơ quan của nghêu do Perkinsus sp ký sinh 23

3.2.2 Biến đổi bệnh lý trên tu hài 26

3.3 Kích thước bào tử Perkinsus sp phân lập được 26

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

PHỤ LỤC 35

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Tổng sản lượng khai thác và NTTS thế giới (FAO, 2014) 3

Hình 1.2: Tu hài 6

Hình 1.3: Nghêu 6

Hình 1.5: Ký sinh trùng Perkinsus sp 8

Hình 1.6: Vòng đời Perkinsus sp (Choi & Park, 2010) 9

Hình 1.7: Bản đồ phân bố các loài Perkinsus (Denise P., 2011) 9

Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16

Hình 2.2a: Cách đo mẫu 18

Hình 2.2b: Cách tách vỏ 18

Hình 2.2c: Lấy cơ thịt 18

Hình 2.2d: Cân cơ thịt 18

Hình 2.3: Các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học 19

Hình 2.4: Cắt mẫu cố định mô 20

Hình 2.5: Đo đường kính 20

Hình 3.1: Mô mang bình thường 24

Hình 3.2: Mô mang nhiễm Perkinsus sp 24

Hình 3.3: Biểu hiện mô bệnh học ở cơ quan tiêu hóa và cơ chân (400x) 25

Hình 3.4: Mang tu hài bình thường 26

Hình 3.5: Mang tu hài bị nhiễm 26

Hình 3.6: Màu thành tế bào Perkinsus sau 1 tuần nuôi cấy 27

Hình PL.1: Màu môi trường FTM sau khi đun 36

Hình PL.2: Nuôi cấy Perkinsus 37

Hình PL.3: Cho NaOH vào ống và lắc mẫu 37

Hình PL.4: Bể ổn nhiệt 37

Hình PL.5: Các loại máy li tâm sử dụng 37

Hình PL.6: Loại bỏ dịch nổi 38

Hình PL.7: Định lượng bằng buồng đếm 38

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Sản lượng khai thác và nuôi trồng thủy sản thế giới 2012 3

Bảng 1.2: Sản lượng cụ thể đến năm 2020 4

Bảng 2.1: Các loại thuốc và hóa chất 16

Bảng 2.2: Danh mục dụng cụ và thiết bị sử dụng 17

Bảng 2.3: Thang đánh giá mức độ cảm nhiễm Perkinsus (Mackin, 1966) 21

Bảng 3.1: Một số chỉ tiêu sinh học và mức độ nhiễm Perkinsus 22

Bảng PL.1: Chiều dài vỏ, trọng lượng mang nghêu nuôi cấy 38

Bảng PL.2: Chiều dài vỏ, trọng lượng cơ thịt nghêu nuôi cấy 39

Bảng PL.3: Chiều dài vỏ, trọng lượng cơ thịt, mang tu hài nuôi cấy 40

Bảng PL.4: Cường độ cảm nhiễm trên mang nghêu 41

Bảng PL.5: Cường độ cảm nhiễm trên cơ thịt nghêu 42

Bảng PL.6: Cường độ cảm nhiễm trên mang tu hài 43

Bảng PL.7: Đường kính Perkinsus kí sinh trên nghêu 44

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CĐCN Cường độ cảm nhiễm

FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (Food and

Agriculture Organization of the United Nations) FTM Fluid Thioglycolate Medium

sp Loài chưa xác định được tên

spp Nhiều loài chưa xác định được tên

% Phần trăm

cm Centimet

µm Microme

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nhuyễn thể hai mảnh vỏ (NTHMV) gồm nhiều loài có giá trị kinh tế và được sử dụng phổ biến do hàm lượng dinh dưỡng của chúng khá cao, đặc biệt là hàm lượng Protein Hơn nữa, hàm lượng Lipit rất thấp, là thức ăn rất dễ tiêu hóa, ít ngán, chống được béo phì Chúng ăn sinh vật phù du và mùn bã hữu cơ, theo phương thức ăn lọc nên

có tác dụng làm sạch, chống ô nhiễm, thân thiện với môi trường là đối tượng quan trọng trong nghề nuôi trồng thủy sản Nuôi động vật hai mảnh vỏ ngày càng phát triển ở Việt Nam cũng như trên thế giới và chiếm một tỷ trọng khá lớn trong nghề nuôi về sản lượng lẫn giá trị Tuy nhiên, trong vài năm gần đây, hiện tượng chết hàng loạt của tu hài, nghêu do dịch bệnh đã gây ảnh hưởng lớn đến kinh tế và môi trường Trong đó, ký sinh trùng Perkinsus được cho là nguyên nhân gây ra tình trạng chết và thiệt hại lớn ở các vùng nuôi nhuyễn thể

Perkinsus là ký sinh trùng đơn bào nội ký sinh trên nhuyễn thể, chủ yếu là NTHMV Nhiều loài Perkinsus có thể gây chết trên nhuyễn thể, nhưng không phải lúc nào cũng có dấu hiệu bệnh lý rõ rệt Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện tại, những thông tin chính xác về mức độ cảm nhiễm của ký sinh trùng Perkinsus cũng như đặc điểm bệnh lý học vẫn còn rất khiêm tốn

Xuất phát từ yêu cầu thực tế và được sự đồng ý của Viện nuôi trồng Thủy sản tôi

đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu mức độ cảm nhiễm và đặc điểm mô bệnh học của

bệnh do ký sinh trùng Perkinsus spp gây ra trên tu hài (Lutraria rhynchaena), nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu về mức độ cảm nhiễm và đặc điểm biến đổi bệnh lý đặc trưng do sự

ký sinh của Perkinsus spp gây ra trên tu hài (Lutraria rhynchaena), nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) làm cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Xác định mức độ cảm nhiễm thông qua các chỉ số cường độ cảm nhiễm và tỷ

lệ cảm nhiễm

(2) Tìm hiểu biến đổi bệnh lý ở mô và tế bào của nhuyễn thể hai mảnh vỏ bị

Perkinsus sp ký sinh

4 Ý nghĩa của nghiên cứu

Xác định những số liệu khoa học về mức độ cảm nhiễm và tác hại của ký sinh

trùng Perkinsus spp gây ra trên tu hài (Lutraria rhynchaena), nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata) làm cơ sở đề xuất hướng phòng tránh bệnh và nghiên cứu ứng dụng khác

Kết quả của nghiên cứu hy vọng sẽ góp phần xác định đối tượng vật chủ của

Perkinsus và đánh giá vai trò của Perkinsus trong việc gây chết cho các loài NTHMV

hay không để từ đó đề ra hướng khắc phục

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ

1.1.1 Tình hình nuôi trên thế giới

Nghề nuôi NTHMV ngày càng phát triển mạnh, sản lượng nuôi trồng thủy sản liên tục tăng trong năm thập kỷ qua (hình 1.1) Theo tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO), năm 2010, sản lượng nuôi của NTHMV tăng lên 12,91 triệu tấn.Trong đó, sản lượng nuôi của nhuyễn thể hai mảnh vỏ tăng gấp đôi từ 2,35 triệu tấn lên 4,88 triệu tấn (FAO, 2012)

Hình 1.1: Tổng sản lượng khai thác và NTTS thế giới (FAO, 2014)

Trong năm 2012, nhuyễn thể đứng thứ 2 về sản lượng (15,2 triệu tấn) và nhiều gấp đôi so với giáp xác (6,4 triệu tấn) Trong thực tế, sản phẩm từ nhuyễn thể (như ngọc trai) phần lớn xuất phát từ các nước Châu Á Năm 2007, trên 80% sản lượng động vật nhuyễn thể trên thế giới có nguồn gốc từ Châu Á, trong số đó có hơn 90% là NTHMV (FAO, 2009)

Bảng 1.1: Sản lượng khai thác và nuôi trồng thủy sản thế giới 2012 (FAO, 2014)

Nhóm loài

Sản lượng khai thác (triệu tấn)

Nuôi trồng (triệu tấn)

Với những giá trị kinh tế đem lại cùng trình độ khoa học – kỹ thuật ngày càng hiện đại, nghề nuôi NTHMV phát triển mạnh là một nhu cầu cần thiết khi trữ lượng tự nhiên của chúng càng ngày trở nên cạn kiệt

1.1.2 Tình hình xuất khẩu và nuôi ở Việt Nam

Tình hình xuất khẩu

NTHMV trở thành ngành có tiềm năng về kinh tế, với giá trị xuất khẩu được xem là thế mạnh thứ ba của ngành thủy sản Việt Nam Do ảnh hưởng của tình hình dịch bệnh, năm 2013, giá trị xuất khẩu NTHMV của Việt Nam giảm 2,81% Tính đến ngày 15/12/2014 giá trị xuất NTHMV tăng 9,3% so với cùng kỳ năm trước (Trung tâm thông tin công nghiệp và thương mại, 2014) Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (Vasep), trong 4 tháng đầu năm 2015, xuất khẩu NTHMV đạt giá trị 25 triệu USD, tăng 8% so với cùng kỳ năm ngoái

Bảng 1.2: Sản lượng cụ thể đến năm 2020 (Bộ Tư pháp, 2015)

Loài thủy sản Sản lượng Tăng trưởng bình quân/năm đến

Nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở Việt Nam

Với 3.260 km bờ biển, 112 cửa sông lạch, diện tích bãi triều 660.000 ha, Việt Nam

có tiềm năng lớn về diện tích nuôi các loài hải sản trong đó có nhuyễn thể Các đối tượng nuôi chính bao gồm: sò huyết, trai ngọc (Quảng Ninh, Khánh Hòa, Bến Tre, Kiên Giang), ngao dầu (Thái Bình, Nam Định, Thanh Hóa), nghêu (Bến Tre, Tiền Giang, TP HCM), ốc hương, bào ngư, hầu, vẹm xanh (Khánh Hòa, Phú Yên, Thừa Thiên Huế)

Nghề nuôi NTHMV ở các tỉnh phía Bắc (từ Hà Tĩnh đến Quảng Ninh) tập trung chủ yếu ở các bãi bồi, cửa sông ven biển, nơi có nền đáy là cát hoặc cát pha bùn Diện tích nuôi nhuyễn thể tăng liên tục trong giai đoạn 2008 – 2013, từ 20.123 ha (năm 2008) lên 40.864 ha (năm 2013) Một số đối tượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ chủ yếu là nghêu, hàu, tu hài, trai ngọc, sò… được nuôi với nhiều mục đích khác nhau như làm thực phẩm,

đồ trang sức (Nguyễn Viết Tiến Hoàn, 2014)

Vùng ven biển phía Nam từ Cần Giờ (TP HCM) đến các tỉnh Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Bạc Liêu, Cà Mau và Kiên Giang là những vùng phát triển nghề mạnh nghề nuôi nghêu Đầu những năm 2000, tổng sản lượng nghêu của khu vực ven biển của Nam Bộ đã đạt 70 - 80 nghìn tấn/năm và trở thành một mặt hàng xuất khẩu chủ lực đứng thứ hai sau tôm sú ở một số tỉnh vùng ven biển ĐBSCL (Lê Xuân Sinh và ctv., 2007) Bên cạnh đó, các tỉnh Nam Định và Thái Bình miền Bắc đã và đang trở thành một trong những địa phương phát triển mạnh nghề nuôi nghêu trắng có nguồn gốc Bến Tre Năm 2005, Nam Định đã thả nuôi 1.300 ha, sản lượng đạt 15 đến 17 nghìn tấn; Thái Bình thả nuôi 1.500 ha, sản lượng đạt 30 nghìn tấn (Thái Phương, 2010)

Tu hài là đối tượng có giá trị kinh tế cao Năm 2010 và 2011, nghề nuôi tu hài phát triển mạnh với hình thức nuôi đa dạng như: nuôi lồng treo trên bè, nuôi lồng đặt trên bãi và nuôi thả trực tiếp xuống bãi Các vùng nuôi tu hài được mở rộng không chỉ

ở Hải Phòng, Quảng Ninh mà còn ở các tỉnh miền Trung như Quảng Nam, Khánh Hòa, Phú Yên Trong đó, Quảng Ninh là tỉnh nuôi tu hài lớn với diện tích nuôi thả trực tiếp khoảng 83 ha, nuôi lồng (treo trên bè và thả đáy) khoảng 1.579.770 lồng Sản lượng nuôi toàn tỉnh năm 2011 đạt 2.621,6 tấn (Chi cục Nuôi trồng Thủy sản, 2012)

Như vậy, nuôi nhuyễn thể ở vùng ven biển Việt Nam đang có xu hướng phát triển mạnh Phát triển nghề nuôi ngoài việc giải quyết thực phẩm, tăng nguyên liệu xuất khẩu, chúng còn góp phần làm cân bằng sinh thái, ổn định môi trường vùng biển ven bờ

NTHMV đang được xem là một đối tượng ưu thế trong chiến lược phát triển nuôi biển của nước ta hiện nay

1.2 Một số đặc điểm sinh học của nghêu Bến Tre và tu hài (Ngô Anh Tuấn, 2012)

1.2.1 Hệ thống phân loại và phân bố

Hệ thống phân loại tu hài

Theo Jorgen Hylleberg và Rirchard N.Kilburm, 2003 vị trí phân loại của tu hài:

Phân bố: Ở Việt Nam, tu hài phân bố tập trung ở miền Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng)

Hầu hết các tỉnh miền Trung từ Thanh Hóa đến Bình Thuận Ở Khánh Hòa, tu hài phân

bố ở vịnh Vân Phong, Cam Ranh, Nha Trang

Hệ thống phân loại của nghêu

Tên tiếng Việt: nghêu

Phân bố: Ở Việt Nam nghêu phân bố nhiều ở các bãi triều của các tỉnh Cần Giờ (TP

HCM), Gò Công Đông (Tiền Giang), Bình Đại, Ba Tri, Thạnh Phú (Bến Tre), Cầu Ngang, Duyên Hải (Trà Vinh), Vĩnh Châu (Sóc Trăng), Vĩnh Lợi (Bạc Liêu), Ngọc Hiển (Cà Mau) Trong đó, Bến Tre nhiều nhất nên có tên gọi là nghêu Bến Tre

1.2.2 Hình thái cấu tạo chung nghêu và tu hài

Cấu tạo ngoài

Hình 1.4: Cấu tạo của nghêu và tu hài

Nghêu và tu hài có cơ thể dẹp, đối xứng hai bên Vỏ gồm 2 mảnh, che kín 2 bên thân và dính với nhau nhờ bản lề mặt lưng Khác với nghêu, tu hài khép vỏ trước sau đều không khín

Cấu tạo trong

Màng áo: Nằm tiếp giáp với vỏ, gồm 2 phiến từ lưng kéo dài xuống 2 bên

bao bọc lấy nang nội tạng Phần giữa màng áo rất mỏng, xung quanh mép màng

áo dày Màng áo của nghêu có 2 điểm kết hợp nên có 3 lỗ hút nước vào ra Tu

hài có sự khác biệt, phần cuối màng áo tu hài phát triển tạo thành ống thoát hút

nước (hình 1.4)

Hệ hô hấp: Nghêu và tu hài hô hấp chủ yếu bằng mang Mang nằm trong

xoang mang, gồm các đôi lá mang đối xứng nhau bao gồm đôi lá mang trong và

đôi lá mang ngoài Mỗi mang gồm hai tấm mang, trên mỗi tấm mang có nhiều

sợi mang, trên sợi mang có các sợi tiêm mao

Hệ tiêu hóa: Hệ thống tiêu hóa gồm có mang, xúc biện, miệng, thực quản,

dạ dày, manh nang tiêu hóa, sợi keo, ruột…

Vỏ

Mang

Ống (lỗ) thoát hút nước

Chân

Hệ sinh dục: Tuyến sinh dục bao gồm túi sinh dục, ống sinh dục, ống dẫn sản

phẩm sinh dục

Một số đặc điểm sinh học khác

Phương thức dinh dưỡng: Phương thức bắt mồi hoàn toàn bị động, bắt mồi

theo hình thức lọc thức ăn nhiều lần Thức ăn thay đổi theo giai đoạn phát triển của cơ thể Giai đoạn ấu trùng phù du chúng ăn sinh vật phù du kích thước nhỏ Giai đoạn trưởng thành, chúng an sinh vật phù du Cơ quan bắt mồi (mang, xúc biện) không có khả năng chọn lựa chủng loại thức ăn Tất cả các loại mà vừa miệng đều được nuốt hết,

do đó trong dạ dày ta thường thấy có nhiều vật không tiêu hóa được

Nhiệt độ và độ mặn: Nhiệt độ và độ mặn thích hợp cho nghêu là 20 – 25oC,

15 - 25‰; còn tu hài là 18 – 33oC, 20 - 34‰

1.3 Bệnh Perkinosis ở động vật nhuyễn thể

1.3.1 Một số đặc điểm của ký sinh trùng Perkinsus

Hệ thống phân loại (Levine, 1978)

Perkinsus sp có vòng đời đặc biệt bao gồm thể dinh dưỡng - trophozoite, bào tử

nghỉ - hypnospore (=prezoosporangia) và bào tử động – zoospore (Auzoux-Bordenave

và ctv, 1995; Perkins, 1996; Choi và ctv, 2002) (hình 1.6) Thể dinh dưỡng phát triển và nhân lên về mặt số lượng trong mô tế bào vật chủ Khi thể dinh dưỡng đặt trong điều kiện yếm khí như nuôi cấy trong môi trường FTM - Fluid Thioglycolate Medium hoặc trong mô vật chủ chết, chúng sẽ phát triển thành bào tử nghỉ Bào tử nghỉ cho vào nước biển (có Oxi) chúng sẽ phân chia và hình thành ống phóng để phóng thích các bào tử động (Choi và Park, 2010)

Hình 1.6: Vòng đời Perkinsus sp (Choi & Park, 2010)

Châu Mỹ: Virginia, Maryland (vịnh Chesapeake), Mỹ

Châu Úc: Giải đá ngầm, phía Nam Úc

Hình 1.7: Bản đồ phân bố các loài Perkinsus (Denise P., 2011)

1.3.2 Bệnh Perkinosis

Dấu hiệu bệnh lý

NTHMV bị bệnh Perkinosis với cường độ nhiễm cao sẽ xuất hiện những nốt sần màu trắng trên mặt của màng áo, mang và chân bò Quan sát tiêu bản mô ta thấy Perkinsus thường xuất hiện từng đám trên màng áo, mang, mô liên kết tuyến tiêu hóa,

mô liên kết tuyến sinh dục Những đám bào tử này gây tổn thương và xung huyết trên mang sẽ làm giảm hiệu quả lọc thức ăn Kết quả làm giảm sinh trưởng, mở vỏ và chết hàng loạt đối với vật chủ (Mackin, 1962; Park và Choi, 2001)

Điều kiện phát triển bệnh

Nhóm ký sinh trùng này kém phát triển ở nhiệt độ <20oC và độ mặn <15‰ Tỷ

lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong của NTHMV giảm trong thời kỳ độ mặn thấp, ở các cửa sông ít bị ảnh hưởng nhưng bệnh vẫn xuất hiện ở độ mặn 5‰ khi nuôi hàu với mật độ cao (Villalba và ctv, 2004)

Phương pháp chuẩn đoán bệnh

Bệnh ký sinh trùng Perkinosis có thể được phát hiện dựa vào dấu hiệu bệnh lý, nuôi trong môi trường Ray (Fluid Thioglycollate Medium - FTM), mô bệnh học, kính hiển vi điện tử, phương pháp sinh học phân tử Polymerase Chain Reaction (PCR)

1.4 Những nghiên cứu về bệnh Perkinosis ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ

1.4.1 Thế giới

Bệnh do ký sinh trùng đơn bào thuộc giống Perkinsus là nguyên nhân gây tỷ lệ chết cao cho nhiều loài nhuyễn thể có giá trị trên thế giới, dẫn đến thiệt hại kinh tế nghiêm trọng (Andrews, 1988; Choi và Park, 2010; Villalba và ctv, 2011 Waki và ctv,

2012) Báo cáo đầu tiên về tác nhân gây chết hàng loạt của hầu Crassostrea virginica tại Mỹ được kết luận là do P marinus (Mackin và ctv, 1950) Tiếp đó, các loài Perkinsus spp được phát hiện gây bệnh ở một số vật chủ mới trên toàn thế giới như P olseni (=

P atlanticus) tìm thấy trên bào ngư của châu Úc và trên nghêu ở châu Âu, P chesapeaki/andrewsi kí sinh và gây chết trên nghêu vỏ mềm Mya arenaria tại vịnh Chesapeake (Mỹ), P mediterraneus kí sinh trên hàu ở Địa Trung Hải và P kgwadi (incertae sedis) kí sinh trên sò điệp trên vùng biển Thái Bình Dương của Canada Cho đến nay, 10 loài Perkinsus được công bố trong đó có 7 loài thường gây bệnh ở các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ có giá trị kinh tế là: P marinus, P olseni, P kgwadi, P

chesapeake, P mediterraneus, P honshuensisand, P brasiliensis Những loài này có sự

khác biệt về một số đặc điểm như: cấu trúc di truyền, độc lực, sự biến đổi vòng đời, phạm vi địa lý phân bố của ký sinh trùng và các dạng vật chủ (Moss và ctv, 2008) Trong

số các loài Perkinsus nói trên, P olseni (=P atlanticus) là kí sinh gây bệnh trên nhiều

loài nhuyễn thể nhất hơn 40 loài nhuyễn thể đã được báo cáo cảm nhiễm tự nhiên và

nhân tạo với tác nhân này Ngoài ra, P olseni có phân bố địa lý rộng lớn bao gồm các

vịnh thuộc các châu lục Châu Âu, Châu Á, Châu Mỹ, Châu Đại Dương Do tác hại ký

sinh trùng gây ra, tổ chức Thý y Thế giới đưa P marinus và P olseni vào danh mục các

bệnh bắt buộc phải công bố và kiểm dịch trên nhuyễn thể xuất khẩu (OIE, 2012)

P olseni cũng được ghi nhận lây nhiễm trên nghêu Ruditapes decussatus ở vùng

biển Địa Trung Hải của Tây Ban Nha với cường độ nhiễm tuy thấp nhưng nhiễm quanh

năm (Elandaloussi và ctv, 2009) Trước đó, dọc theo bờ biển Đại Tây Dương, P olseni được xác định có trong C edule Galicia, Tây Ban Nha (Darriba và ctv, 2010) và một số

ký sinh trùng Perkinsus sp được quan sát thấy trước đấy vài năm trên mô mang của C edule ở Pháp (Lassalle và ctv, 2007) Carrasco và ctv (2014) đã phát hiện loài Cerastoderma edule ở bờ biển Địa Trung Hải (Tây Ban Nha) bị nhiễm P chesapeake Andrea và cộng sự (2015) đã nghiên cứu xác định thêm các loài Perkinsus spp ở địa

điểm và vật chủ ký sinh mới của khu vực phía tây Địa Trung Hải góp phần cập nhật

thêm thông tin về Perkinsus sp ký sinh trên các vật chủ mới và sự phân bố địa lý của

chúng

Dịch bệnh Perkinosis xảy ra và những thiệt hại to lớn của nó là động lực thúc đẩy

sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học Một số thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và ngoài thực tế để kiểm tra hiệu quả của liệu pháp sử dụng hóa chất để làm giảm bệnh do Perkinsus (Calvo và Burreson, 1996; Krantz, 1994; Dungan và Hamilton, 1995; Elandalloussi và ctv, 2009) Một số chất như Cycloheximide và Deferoxamine cho thấy có hiệu quả trong việc giảm sự cảm nhiễm Perkinsus ở hầu và không có tác hại cho vật chủ mặc dù không thể tiêu diệt hoàn toàn Perkinsus Các thử nghiệm với Chlorine (Bushek và ctv, 1997a; Casas và ctv, 2002), N – halamine (Delaney và ctv, 2003), nước ngọt (Burreson và ctv, 1994; Auzoux – Bordenave và ctv, 1995; Casas và ctv, 2002; La Peyre và ctv, 2003) và màng lọc kết hợp với chiếu xạ bằng tia UV (Ford

và ctv, 2001) được chứng minh có thể diệt các tế bào tự do của Perkinsus Cho đến nay, không có một loại hóa dược nào có khả năng trị bệnh này

1.4.2 Việt Nam

Bắt đầu từ năm 2003 đến nay, hiện tượng chết hàng loạt của nhiều loài NTHMV

ở Việt Nam xảy ra liên tục trong phạm vi cả nước gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế,

xã hội và môi trường Theo báo cáo của Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Thái Bình, đầu năm 2003, tình trạng nghêu chết hàng loạt đã diễn ra khiến người nuôi nghêu ở địa phương thiệt hại từ 50 đến 60 tỷ đồng – một số tiền rất lớn vào thời điểm

đó Năm 2007, xảy ra hiện tượng nghêu chết ở bãi nuôi thuộc thị trấn Cần Thạnh và xã Long Hòa huyện Cần Giờ (TP HCM) Các loại nghêu giống, nghêu lỡ lẫn nghêu thương phẩm đều bị chết, có bãi chết đến 100% Tháng 2 năm 2009 có 143 ha nghêu bị thiệt hại, trị giá trên 7 tỷ đồng

Tháng 3/2010 và tháng 4/2011, hiện tượng nghêu và sò huyết chết hàng loạt đã xảy ra nghiêm trọng tại các hợp tác xã nuôi nghêu tại Bến Tre, làm ảnh hưởng đến hoạt động sản xuất, gây thất thu cho người nuôi Hiện tượng nghêu, sò chết hàng loạt không chỉ diễn ra ở Bến Tre mà còn xảy ra ở Trà Vinh, Tiền Giang, Cần Giờ, Thanh Hóa, Nam Định… Theo Sở nông nghiệp Bạc Liêu, đầu năm 2011, hiện tượng nghêu chết hàng loạt tại Bạc Liêu, Cần Giờ (TP HCM), Tiền Giang, Bến Tre gây thiệt hại 80 - 90% diện tích nuôi nghêu Theo kết quả phân tích mẫu nghêu chết, các cơ quan nghiên cứu cho thấy nguyên nhân chủ yếu là do nghêu nhiễm ký sinh trùng Perkinsus (chiếm 12 – 98% mẫu thu) Những tháng đầu năm 2013, các đối tượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ (gồm nghêu, tu hài) nuôi tại Việt Nam đã bị chết hàng loạt trở thành dịch tại nhiều địa phương như Hải Phòng, Quảng Ninh, Nam Định, Thái Bình, Thanh Hóa, Khánh Hòa và một số tỉnh NTTS trọng điểm của ĐBSCL (Tiền Giang, Bến Tre, Bạc Liêu)

Hiện tượng tu hài chết hàng loạt cũng đã được ghi nhận từ đầu năm 2010 diễn ra

ở vịnh Cam Ranh (Khánh Hòa) Và đến năm 2011, bệnh xuất hiện ở vịnh Lan Hạ, Cát

Bà (Hải Phòng) Tháng 4/2012, bệnh đã lan ra Vân Đồn (Quảng Ninh) gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động sản xuất, kinh doanh và đời sống của người nuôi đối tượng này Theo thông tin từ SNN&PTNT tỉnh Quảng Ninh, tính đến thời điểm 30/06/2012,

số tu hài chết tại huyện Vân Đồn khoảng 200 triệu con giống, ước thiệt hại trên 200 tỷ đồng Đến 19/07/2012, huyện Đầm Hà đã thống kê được 52.000 lồng nuôi đặt trên bãi

đã bị chết với tỷ lệ chết trên 95% tương đương khoảng 2 triệu con giống Trên cơ sở kết quả phân tích mẫu bệnh tu hài nuôi tại hai huyện Vân Đồn và Đầm Hà, Trung tâm Chuẩn đoán Thú y Trung ương đã có kết luận, hiện tượng tu hài nuôi tại hai huyện chết hàng loạt từ tháng 5 đến tháng 7/2012 chủ yếu do Perkinsus gây ra Tháng 4/2014, tu hài chết hàng loạt ở các vùng ven biển thuộc vịnh Cam Ranh (Khánh Hòa) lại diễn ra, nhưng chưa có nghiên cứu nào để chỉ ra nguyên nhân chính cho hiện tượng này

Theo Chi cục Thú y Hà Tĩnh, 19/02/2015, tỉnh Hà tĩnh đã có khoảng 650 tấn nghêu bị chết tỷ lệ chết lên đến 90% tại bốn xã, ở hai huyện là Cẩm Xuyên và Kỳ Anh, với tổng diện tích gần 68 ha của 36 hộ dân Ước tính thiệt hại của người dân khoảng trên

8 tỷ đồng Đến cuối tháng 3 đầu tháng 4/2015, hiện tượng này lại xảy ra ở hai tỉnh Tiền Giang và Bến Tre Tiền Giang hiện tượng nghêu chết hàng loạt với tỷ lệ chết lên tới 90%, nghêu chết khi đến thời điểm thu hoạch nên ước tính sản lượng khoảng 13.000 tấn Nghêu chết hàng loạt tại hai huyện Bình Đại, Ba Tri của tỉnh Bến Tre từ giữa tháng

3 đến nay hơn 1.000 ha, tỷ lệ thiệt hại phổ biến 30 – 40% số lượng nghêu trên bãi, thiệt hại ước tính 1.500 tấn Theo kết quả phân tích của Phân viện Nghiên cứu Thủy sản Minh Hải – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, tình trạng nghêu chết từ giữa tháng 3 đến nay tại hai huyện Bình Đại và Ba Tri, tỉnh Bến tre là do nhiễm ký sinh trùng Perkinsus

Các công bố bước đầu của các nhóm nghiên cứu từ Viện Nghiên cứu NTTS I cho thấy có rất nhiều nguyên nhân liên quan đến hiện tượng chết hàng loạt của nghêu, tu hài

ở Hải Phòng, Nam Định, Thái Bình, Thanh Hoá và một số tỉnh ĐBSCL (Thu Hiền và ctv, 2012) Các tác nhân sinh học như vi khuẩn, virus đã được phân lập với tỷ lệ cao (từ

80 – 100%) trên các nhóm NTHMV này Đồng thời các nguyên nhân từ môi trường như

pH, nhiệt độ và độ mặn cao cùng với nắng nóng kéo dài trong nhiều ngày đã khiến các chỉ số COD, NH4 và H2S đều vượt ngưỡng cho phép; chất rắn lơ lửng cũng cao hơn mức giới hạn đều được nghi ngờ là nguyên nhân gây chết động vật hai mảnh vỏ nuôi (Ngọc Thuý, 2013) Đặc biệt, năm 2008, Ngô Thị Thu Thảo đã khảo sát và cho thấy sự tồn tại

của ký sinh trùng Perkinsus sp trên đối tượng nghêu lụa (Paphia undulata) tại Hà Kiên Giang và Bà Rịa - Vũng Tàu Tỷ lệ nhiễm Perkinsus này biến động từ 67,5 - 100

Tiên-% (Hà Tiên) và 100Tiên-% (Bà Rịa)

Mức độ cảm nhiễm Perkinsus rất cao nhưng tác hại của tác nhân này đã không

được ghi nhận Kết quả nghiên cứu trên nghêu Meretrix lyrata cho thấy sự hiện diện của

kí sinh trùng Perkinsus với tỷ lệ cảm nhiễm trung bình là 60,1%, cao nhất vào tháng 2 (98,7%) và thấp nhất vào tháng 8 (18,1%) (Hảo và ctv, 2011) Sự có mặt của Perkinsus cũng được ghi nhận trên trai ngọc, hàu Thái Bình Dương, hàu cửa song và tu hài (Ngọc Thủy, 2011; Thành Cường và Vĩ Hích, 2013)

Như vậy, các nghiên cứu về bệnh ở NTHMV, đặc biệt là bệnh Perkinosis còn rất ít Trong khi, hiện tượng động vật hai mảnh vỏ liên tục chết hàng loạt trên diện rộng tại nhiều địa phương trong cả nước nhưng chưa rõ nguyên nhân đang trở thành vấn đề đáng quan tâm

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

Ký sinh trùng Perkinsus sp ký sinh trên tu hài (Lutraria rhynchaena) và nghêu

Bến Tre (Meretrix lyrata)

Thời gian nghiên cứu

Từ 02/03/2015 đến 07/06/2015

Địa điểm nghiên cứu

Phòng nghiên cứu bệnh học thủy sản, trường Đại học Nha Trang

Địa điểm thu mẫu

Mẫu nhuyễn thể dùng cho nghiên cứu được thu tại Khánh Hòa đối với tu hài

(Lutraria rhynchaena) và tỉnh Bến Tre đối với nghêu Bến Tre (Meretrix lyrata)

2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Môi trường

Môi trường nuôi cấy FTM (Fluid Thioglycolate Medium)

2.3.2 Hóa chất

Bảng 2.1: Các loại thuốc và hóa chất

1 Davidson dành cho nhuyễn thể, Ethanol 70%, Ethanol 99,5%

và tu hài

Xác định

cơ quan

bị cảm nhiễm

Nghiên cứu mức độ cảm nhiễm và đặc điểm mô bệnh học của bệnh do ký sinh

trùng Perkinsus spp gây ra trên tu hài (Lutraria rhynchaena), nghêu Bến Tre

(Meretrix lyrata)

Nghiên cứu mô bệnh học

Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

2.3.3 Dụng cụ và thiết bị

Bảng 2.2: Danh mục dụng cụ và thiết bị sử dụng

1 Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HV – 25

2 Máy ly tâm Universal 320 – Hettich, Máy ly tâm thường IEC

3 Tủ ấm IB – 15G – Jeiotech

4 Micropipette Nichiryo Nichipet EX Pipette 10~100μL AUTOCLAVABLE

5 Bể ổn nhiệt (Water Bath)

13 Buồng đếm hồng cầu (Improved Neubauer)

14 Lam, lamen, đầu côn

15 Đèn cồn, bình tam giác (500 và 1000ml), ống đong, giấy lọc, giấy bạc

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thu mẫu

Mẫu tu hài/nghêu dùng nghiên cứu mô bệnh học, mức độ cảm nhiễm Perkinsus

sp được thu mua ngẫu nhiên ở Bến Tre (nghêu Bến Tre Meretrix lyrata) và ở Khánh Hòa (tu hài Lutraria rhynchaena) Mẫu còn sống được vận chuyển trong thùng xốp đóng khí

có bổ sung đá khô về phòng thí nghiệm bệnh học Trường Đại Học Nha Trang

2.4.2 Xử lý mẫu

Trước khi tách vỏ, tu hài/nghêu được đo chiều dài bằng thước kẹp Caliper độ chính xác 0,1 mm (hình 2.2a) Tu hài/nghêu đều có kỹ thuật tách vỏ tương tự nhau Dùng tay trái cầm mẫu vật, đặt lưng mẫu vật vào lòng bàn tay, mặt thuẫn của mẫu vật hướng

về phía người mình (hình 2.2b) Tay phải cầm dao giải phẫu, dùng ngón trỏ và ngón giữa của tay trái ấn nhẹ lưỡi dao cắt đứt cơ khép vỏ trước của vỏ trái Sau đó, ta vòng dao sang bên cắt đứt cơ khép vỏ còn lại Kết quả của hai lần cắt ta có thể mở được vỏ của mẫu vật, dùng dao gạt nhẹ để lấy phần cơ thịt bên trong (hình 2.2c) Phần cơ thịt sau khi tách sẽ được cân (hình 2.2d)

Hình 2.2a: Cách đo mẫu Hình 2.2b: Cách tách vỏ

Hình 2.2c: Lấy cơ thịt Hình 2.2d: Cân cơ thịt