Độc lực và thành phần Protein của các chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét tại các bè nuôi thương phẩm ở Khánh Hòa

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ bổ sung vào nguồn tư liệu các nghiên cứucơ bảnvề chủng vi khuẩn V.alginolyticus gây bệnh lở loét trên cá chẽm: đặc điểm sinh hóa, độc lực và thành phần protein.Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất vaccin phòng bệnh trên cá chẽm cũng như các đối tượng cá biển nuôi thương phẩm ở nước ta.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA NUÔI TRỒNG THỦY SẢN NGUYỄN THỊ THOA ĐỘC LỰC VÀ THÀNH PHẦN PROTEIN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Vibrio alginolyticus PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM (Lates calcarifer) BỊ BỆNH LỞ LOÉT TẠI CÁC BÈ NI THƯƠNG PHẨM Ở KHÁNH HỊA LUẬN VĂN THẠC SỸ Cán hướng dẫn Khoa học: TS Nguyễn Hữu Dũng Nha Trang, tháng 07/2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu luận văn thân tơi thực bảo tận tình, chu đáo Thầy hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Dũng Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình Tác giả Nguyễn Thị Thoa i LỜI CẢM ƠN Trước tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Ban giám hiệu nhà trường Đại Học Nha Trang, thầy cô khoa Nuôi Trồng Thủy Sản tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực luận văn tốt nghiệp thạc sỹ Nhân tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến dẫn tận tình, góp ý q báu, kịp thời thầy giáo hướng dẫn TS Nguyễn Hữu Dũng Tôi xin chân thành cảm ơn Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Thùy bên cạnh hướng dẫn nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi thời gian nghiên cứu hợp phần bệnh, dự án Nufu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III, Giám đốc Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Mơi trường Phịng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực miền Trung, trưởng phòng bệnh Thủy sản Dự báo, Giám đốc Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Trung, anh chị bạn đồng nghiệp giúp đỡ tạo điều kiện thời gian để tơi tham gia hồn thành khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn Ban điều phối dự án NUFU cung cấp điều kiện vật chất suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn tốt nghiệp Và cuối xin cảm ơn đến gia đình tơi: Bố, mẹ anh, chị em, chồng Trần Huy Chinh hai con:Khánh Ninh Khánh Ngân chỗ dựa tinh thần vững tạo điều kiện thời gian vật chất giúp suốt trình học tập hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Nguyễn Thị Thoa ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan .i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, từ viết tắt v Danh mục hình ảnh vi Danh mục bảng vii Mở đầu Chương - Tổng quan 1.1 Tổng quan tình hình ni cá chẽm giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình ni cá chẽm giới .3 1.1.2 Tình hình nuôi cá biển Việt Nam 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá chẽm (Lates calcarifer) giới 1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá chẽm Việt Nam 1.4 Một vài đặc điểm vi khuẩn V alginolyticus 1.4.1 Hệ thống phân loại V alginolyticus 1.4.2 Đặc điểm phân bố V alginolyticus 1.4.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa V alginolyticus 1.4.4 Yếu tố gây độc V alginolyticus 11 Chương II: Phương pháp nghiên cứu 14 2.1 Địa điểm, thời gian, đối tượng nghiên cứu 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Phương pháp thu thập, lưu giữ phục hồi chủng 14 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa 14 2.2.3 Nghiên cứu độc lực, LD50 vi khuẩn 16 2.2.3.1 Chuẩn bị vi khuẩn kiểm tra độc lực 16 2.2.3.2 Bố trí thí nghiệm .17 2.2.3.3 Phân lập lại vi khuẩn 18 iii 2.2.4 Phương pháp phân tích thành phần protein lipopolysaccharides (LPS) vi khuẩn 19 2.2.4.1 Phương pháp nhuộm Pr 20 2.2.4.2 Phương pháp nhuộm LPS 21 2.3 Phương pháp xủ lý số liệu 22 Chương III: Kết nghiên cứu 23 3.1 Đặc điểm sinh hóa hính thái chủng V alginolyticus gây bệnh lở loét cá chẽm ni lồng bè thương phẩm Khánh Hịa 23 3.2 Kết kiểm tra độc lực chủng V alginolyticus 25 3.2.1 Kết kiểm tra độc lực chủng CH10 26 3.2.2 Kết kiểm tra độc lực chủng CoS01 .28 3.2.3 Kết kiểm tra độc lực chủng CoK03 30 3.2.4 Kết kiểm tra độc lực chủng CoVL03 31 3.2.5 Kết phân lập trở lại V alginolyticus 32 3.2.6 Kết kiểm tra độc lực chủng V alginolyticus đợt 33 3.3 Thành phần Protein LPS chủng V alginolytics 35 3.3.1 Thành phần Protein chủng V alginolytics .35 3.3.2 Kết phân tích LPS chủng V alginolytics 37 Chương IV: Kết luận đề xuất ý kiến 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Đề xuất ý kiến 38 Tài liệu tham khảo 39 Phụ lục iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT cs: cộng S‰: Độ mặn t0C: Nhiệt độ TB: Trung bình VK: Vi khuẩn PBS: Phosphate Buffered Saline TLBH: Tỷ lệ biểu APS: Ammonium Persulphate SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulphate – Polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : Tetramethylethylenediamine SDS: Sodium dodecyl sulfate Electrophoresis purity reagent Tris: Electrophoresis purity reagent Tris (hydrorymethyl) - aminomethane Rpm: Revolutions per minute KDa : Kilodalton DNA : Deoxyribonucleic acid TSA: Tryptic Soy Agar TSB: Tryptic Soy Broth API: Analytical Profile Index TCBS: Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar CFU: Colony forming units LD50: Mean Lethal Dose, 50% (Liều gây chết 50%) NMSL: Nước muối sinh lý LPS : lipopolysaccharides P : page (trang) v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) theo quốc gia giá trị khu vực châu Á - Thái Bình Dương từ năm 1997 đến 2006 Hinh 1.2 Sản lượng cá chẽm (cột) giá trị (đường) cá chẽm nuôi Australia từ năm 1986 đến năm 2004 Hình 2.1 Sơ đồ khối phân lập vi khuẩn sau cảm nhiễm 18 Hình 3.1 Đặc điểm sinh hóa test kit API - 20E vi khuẩn V alginolyticus .25 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn V alginolyticus mơi trường TCBS nhuộm Gram 25 Hình 3.3 Hệ thống bể bố trí thí nghiệm 25 Hình 3.4 Độc lực chủng CH10 cá chẽm khỏe; a: Tỷ lệ chết tích lũy b: tỷ lệ biểu bệnh 26 Hình 3.5 Biểu cá bị bệnh lở loét tiêm chủng vi khuẩn CH10 28 Hình 3.6 Độc lực chủng CoS01 cá chẽm khỏe; a: Tỷ lệ chết tích lũy b: tỷ lệ biểu bệnh 28 Hình 3.7 Biểu cá bị bệnh lở loét tiêm chủng vi khuẩn CoS01 30 Hình 3.8 Tỷ lệ biểu bệnh lở loét cá chẽm chủng CoK03 31 Hình 3.9 Biểu cá bị bệnh lở loét tiêm chủng vi khuẩn CoK03 31 Hình 3.10 Biểu cá bị bệnh tiêm kiểm tra độc lực vi khuẩn V alginolyticus cá khỏe mạnh lô đối chứng 32 Hình 3.11 Hình thái khuẩn lạc V alginolyticus môi trường TCBS TSA 32 Hình 3.12 Độc lực tỷ lệ biểu bệnh lở loét hai chủng CH10 CoS01 cá chẽm khỏe đợt 33 Hình 3.13 SDS-PAGE protein chủng V alginolyticus 35 Hình 3.14 SDS-PAGE lipopolysaccharides chủng V alginolyticus 37 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Ký hiệu, nguồn phân lập đối tượng nghiên cứu 14 Bảng 3.1 Đặc điểm sinh hoá chủng V alginolyticus 23 Bảng 3.2 LD50 chủng V alginolyticus qua đợt thí nghiệm 34 vii MỞ ĐẦU Nghề nuôi cá biển Việt Nam vài năm trở lại phát triển mạnh mẽ Nhiều đối tượng cá biển đưa vào nuôi với nhiều hình thức ni ao đìa ni lồng, bè Trong đó, cá chẽm với nhiều ưu điểm lớn nhanh, phân bố rộng muối, có giá trị kinh tế, nghiên cứu sản xuất giống nhân tạo thành công, nên nghề nuôi cá chẽm phát triển mạnh khu vực miền Trung (Khánh Hòa, Phú Yên) số nơi phía Bắc Hải Phịng, Quảng Ninh … Đến cá chẽm trở thành đối tượng ni xóa đói giảm nghèo, thay đối tượng ni khác bị suy thối Tuy nhiên, q trình ni kỹ thuật chăm sóc, quản lý mơi trường cịn nhiều hạn chế nên nghề ni cá chẽm đối mặt với nhiều đợt dịch bệnh gây thiệt hại kinh tế cho người nuôi Trong thời gian gần đây, cá chẽm nuôi thương phẩm vùng biển Vũng Ngán Nha Trang bị bệnh lở loét thân với tốc độ lây lan nhanh, gây chết khoảng 80% vòng tuần, bệnh xảy tất cỡ cá nuôi, từ cá thả nuôi cá nuôi lớn (2 - 3kg) Nguyên nhân ban đầu xác định vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây Trước tình hình thực tế để có sở cho việc xác định xác tác nhân gây bệnh, nghiên cứu vaccin phịng bệnh cá biển ni, đề xuất thực đề tài: “ Độc lực thành phần Protein chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét bè nuôi thương phẩm Khánh Hòa” Mục tiêu đề tài: Xác định mối tương quan độc lực thành phần protein chủng vi khuẩn V.alginolyticus phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét để làm sở cho nghiên cứu sản xuất vaccin phịng bệnh cá biển ni, giúp giảm thiệt hại nâng cao hiệu kinh tế cho nghề nuôi cá biển Nội dung thực đề tài: Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn V.alginolyticus Xác định độc lực chủng vi khuẩn V.alginolyticus Xác định thành phần protein chủng vi khuẩn V.alginolyticus Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học: Kết đề tài bổ sung vào nguồn tư liệu nghiên cứu chủng vi khuẩn V.alginolyticus gây bệnh lở loét cá chẽm: đặc điểm sinh hóa, độc lực thành phần protein Ý nghĩa thực tiễn: Kết nghiên cứu đề tài làm sở cho nghiên cứu sản xuất vaccin phòng bệnh cá chẽm đối tượng cá biển nuôi thương phẩm nước ta 30 Esteve C , E G Biosca, C Amaro (1993) Virulence of Aeromonas hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in fresh water Dis Aquat Org 16:15–20 31 Faddin M.J.F (1980) Biochemical tests for indentification of medical bacteria, Wiliam & Wilkins, USA 32 FAO, Cultured Aquatic Species Information Programme : Lates calcarifer (Block , 1790), (on-line), FAO Truy cập ngày 12/12/2009 địa (http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Lates_calcarifer/en) 33 Frerichs, G.N (1993), Manual for the isolation and identification of fish bacterial pathogens, Pisces Press-Stirling 34 Gjerde J., B Boe (1981) Isolation and characterization of Vibrlo alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus from the Norwegian coastal environment Acta Vet Scand 22:331-343 35 Glenn S., J Bosmans J Humphrey (2007) Nothern Territory Barramundi Handbook, 80 pp (on-line), truy cập ngày 25/12/2009 địa (http://www.nt.gov.au/d/Fisheries/Content/File/NT_Barra_Farming_Handbook_O nline_1107.pdf) 36 Halwart M., D Soto, J.R Arthur (2007) Cage aquaculture - Regional reviews and global overview FAO Fisheries Technical Paper No 498 Rome, FAO 241 pages 37 Handlinger J., H Soltani, V Percival (1997) The pathology of Flexibacter maritimus in aquaculture species of Tasmania, Australia J Fish Dis 20, 159– 168 38 Hoa T.T.T., D.T.H Oanh N.T Phuong (2001) Characterization and Pathogenicity of Vibrio Bacteria Isolated from Freshwater Prawn (Macrobrachium rosenbergii) Hatcheries, Part 1: Isolation and Identification of Vibrio spp from Larval Stages 39 Holt J G., N R Krieg, P H A Sneath, J T Staley, S T Williams (1994) Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition, Williams & Wilkins, 787 pp 42 40 Hörmansdorfer S , H Wentges, K Neugebaur-Büchler, J Bauer (2000) Isolation of Vibrio alginolyticus from seawater aquaria, International Journal of Hygiene and Environmental Health Volume 203, Issue 2, Pages 169-175 41 Jayaprakash N S , S S Pai, R Philip, S B Singh (2006) Isolation of a pathogenic strain of Vibrio alginolyticus from necrotic larvae of Macrobrachium rosenbergii (de Man) J Fish Dis 29:187–191 42 Josenhans C S Suerbaum (2002) The role of motility as a virulence factor in bacteria International Journal of Medical Microbiology Volume 291, Issue 8, , Pages 605-614 43 Joseph, S W., R R Colwell, J B Kaper (1983) Vibrio parahaemolyticus and related halophilic vibrios Crit Rev Microbiol 10:77-124 44 Kampelmacher, E H., L M van NoorleJansen, D A A Mossel, F J Groen (1972) A survey of the occurrence of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus on mussels and oysters and in estuarine waters in the Netherlands J Appl Bacteriol 35:431-438 45 Kitao T (1993) Streptococcal infections In: Inglis, V., Roberts, R.J., Bromage, N.R (Eds.), Bacterial Diseases of Fish Blackwell Scientific Publications, Oxford, UK, pp 196– 210 46 Kumaran S , B Deivasigamani, K M Alagappan, M Sakthivel S Guru Prasad (2010) Isolation and characterization of Pseudomonas sp KUMS3 from Asian sea bass (Lates calcarifer) with fin rot World Journal of Microbiology and Biotechnology, Volume 26, Number 2, 359-363 47 Laemmli U.K (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature (227), pp 680-685 48 Lamas J , I Santos, D Bruno , A E Toranzo, R Anderson (1994) A comparison of pathological changes caused by Vibrio anguillarum and its extracellular products in rainbow trout (Oncorynchus mykiss), Fish Pathol 29:79–89 49 Lee K K (1995) Pathogenesis studies on Vibrio alginolyticus in the grouper, Epinephelus malabaricus, Bloch & Schneider Microbial Pathogenesis 19, 39-48 43 50 Lilley J.H, R.B Callinan, S Chinabut, S kanchanakhan, L.H Macrae M.J Phillips Epizootic Ulcerative Syndrome (EUS) Technical Handbook Published by DFID 87pp 51 Liu P , J Lin, P Hsiao K Lee (2004) Isolation and characterization of pathogenic Vibrio alginolyticus from diseased cobia Rachycentron canadum J Basic Microbiol 44 1, 23–28 52 Magarin ˜os B., F Pazos, Y Santos, J.L Romalde, A.E Toranzo (1995), Response of Pasteurella piscicida and Flexibacter maritimus to the skin mucus of marine fish, Dis Aquat Org 21, 103– 108 53 Molitoris E., S W Joseph, M I Krichevsky, W Sindhuhardja R R Colwell (1985) Characterization and Distribution of Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus Isolated in Indonesia Applied and Environmental Microbiology, Dec., p 1388-1394 54 Narjol G ,G M Blackstone A DePaola (2006) Characterization of a Vibrio alginolyticus Strain, Isolated from Alaskan Oysters, Carrying a Hemolysin Gene Similar to the Thermostable Direct Hemolysin-elated emolysin Gene (trh)of Vibrio parahaemolyticus Applied and Environmental Microbiology, Dec 2006, p 7925– 7929 Vol 72, No 12 55 Rajkumar M , P Perumal , J P Trilles (2005) Cymothoa indica (Crustacea, Isopoda, Cymothoidae) parasitizes the cultured larvae of the Asian seabass Lates calcarifer under laboratory conditions, Dis Aqua Org, Vol 66: 87-90 56 Ransangan J S Mustafa (2009) Identification of Vibrio harveyi Isolated from Diseased Asian Seabass Lates calcarifer by Use of 16S Ribosomal DNA Sequencing Microbiology and Fish Disease Laboratory, Borneo Marine Research Institute, Universiti Malaysia Sabah, 88999 Kota Kinabalu, Sabah, Malaysia 57 Pazos F., Y Santos, S Nu ´n ˜ez, A.E Toranzo (1993) Increasing occurrence of Flexibacter maritimus in marine aquaculture of Spain FHS/AFS Newsl 21, – 44 58 Reed L J H Muench (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints l,2 The American Journal of Hygiene, Vol 27 May, No (P 493 497) (Received for publication October 26th, 1937) 59 Renault T., P Haffner, C Malfondet M Weppeb(1994) Vibrio damsela as a pathogenic agent causing mortalities in culture sea bass (Lates calcarifer) Bull Eur Ass Fish Pathol., 14(4),117 60 Perera R.P., S.K Johnson, M.D Collins, D.H Lewis (1994) Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica x T aurea hybrids J Aquat Anim Health 6, 335–340 61 Rimmer M (2008) Production update – marine finfish aquaculture in the AsiaPacific region Asia Aquaculture, Volume XIII No.1 July-September pp 46-49 62 Rimmer M (2008) Production update – marine finfish aquaculture in the AsiaPacific region, Asia Aquaculture, Volume XIII No.3 July-September pp 44-46 63 Roberts R.J , L.G Willoughby S Chinabut (1993) Mycotic aspects of Epizootic Ulcerative Syndrome (EUS) of Asian Fishs In Journal of fish disese, 16, 169-183.1993 64 Romalde J.L., A.E Toranzo (1999) Streptococcosis of marine fish In: Olivier, G (Ed.), ICES Identification Leaflets for Diseases and Parasites of Fish and Shellfish, No 56 International Council for the Exploration of the Sea Copenhagen, Denmark, pp –8 65 Ruangpan Chapter X: Diseases of cultured seabass, Lates calcarifer Senior Fishery Biologist, Brackishwater Fisheries Division Department of Fisheries fao.org/ /AB707E10.htm 66 Rückert S., H W Palm S Klimpel (2008) Parasite fauna of seabass (Lates calcarifer) under mariculture conditions in Lampung Bay, Indonesia Journal of Applied IChthyology, Volume 24 Issue 3, Pages 321-327 67 Sakazaki R., T Karashimada, K Yuda, S Sakai, Y Asakawa, M Yamazaki, H Nakanishi, K Kobayashi, T Nishio, H Okazaki, T Doke, T Shimada K Tamura (1979) Enumeration of, and hygienic standard of food safety for, Vibrio parahaemolyticus Arch Lebensmittelhyg 30:103-105 45 68 Santos Y., F Pazos, J.L Barja (1999) Flexibacter maritimus, causal agent of flexibacteriosis in marine fish In: Olivier, G (Ed.), ICES Identification Leaflets for Diseases and Parasites of Fish and Shellfish No 55 International Council for the Exploration of the Sea Copenhagen, Denmark, pp –6 69 Schandevyl P., E Van Dyck P Piot (1984) Halophilic Vibrio species from seafish in Senegal Appl Environ Microbiol 48:236-238 70 Snoussi M , E Noumi, D Usai, L A Sechi, S Zanetti, A Bakhrouf (2008) Distribution of some virulence related-properties of Vibrio alginolyticus strains isolated from Mediterranean seawater (Bay of Khenis, Tunisia): investigation of eight Vibrio cholerae virulence genes.World J Microbiol Biotechnol 24:2133– 2141 71 Stephen, S., A L Vax, I Chandrashekara K N A Rao (1978) Characterization of Vibrio alginolyticus (Beneckea alginolytica) isolated from the fauna of Arabian Sea Indian J Med Res 68:7-11 72 Tsai C.M C.E Frasch (1982) A sensitive silver stain for detecting LPS in polyacylamide gels Analyticel Bioclemistry 98, 231 – 237 73 Tsang V.C.W., J.M Peralta, A.R Simons (1983) Enzyme-Linked Immunoelectrotransfer Blot Techniques (Eitb) for Studying the Specificities of Antigens and Antibodies Separated by Gel-Electrophoresis Methods in Enzymology 92, 377-391 74 Ulitzur S (1974), Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus: Short Generation-Time Marine Bacteria Microbial Ecology,Vol 1, No (pp 127-135) Stable URL: http://www.jstor.org/stable/4250428 75 Ulitzur S (1975), Effect of temperature, salts, pH and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus Archives of Microbiology, Volume 104, Number 1, 285-288, DOI: 10.1007/BF00447338 76 Wakabayashi H., H Hikida, K Masumura (1986) Flexibacter maritimus sp nov., a pathogen of marine fishes, Int J Syst Bacteriol 36, 396– 398 46 77 Wang Q., Q Liu, Y Ma, H Rui, Y Zhang (2007) LuxO controls extracellular protease, haemolytic activities and siderophore production in fish pathogen Vibrio alginolyticus, J Appl Microbiol 103:1525–1534 78 Wei-ni Z., Z Li, X Jing, Z Wen-bin (03-2007), Antigenicity of outer membrane proteins of a pathogenic Vibrio strain,Vibrio alginolyticus, Journal of Fishery Sciences of China, The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China 79 Wei-ni Z., Z Li, X Jing, Z Wen-bin (02-2008) Structural comparison of major outer membrane proteins of aquatic animal Vibrio sp Marine Fisheries Research The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China 80 Wray W., T Boulikas, V.P Wray R Hancock (1981) Silver staining of proteins in polyacrylamide gels Analytical Biochemistry (118), pp 197-203 81 Xie Z.Y., C.Q Hu, C Chen, L.P Zhang, C.H Ren (2005) Investigation of seven Vibrio virulence genes among Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus strains from the coastal mariculture systems in Guangdong, China Lett Appl Microbiol 41:202–207 82 Zhi Z Y F Y X Z (1989), The first isolation of Vibrio alginolyticus from samples which caused food poisoning, Mar;23(2):71-3 83 Zorrilla I., M.A Morinigo, D Castro, M.C Balebona J.J Borrego (2003) Intraspecific characterization of Vibrio alginolyticus isolates recovered from cultured fish in Spain, J Appl Microbiol., 95:1106-1116 84 Zorrilla I., M Chabrillón, S Arijo, P Díaz-Rosales, E Martínez Manzanares, M.C Balebona, M.A Moriđigo (2003a) Bacteria recovered from diseased cultured gilthead sea bream (Sparus aurata L.) in southwestern Spain Aquaculture 218:11–20 Các trang Web truy cập 85 http://en.wikipedia.org/wiki/ Vibrio alginolyticus (truy cập ngày 15/03/2010) 86 http://www.baoanhdatmui.vn/vcms/html/news_detail.php?nid=694 (truy cập ngày 15/01/2011) 47 87 http://www.baokhanhhoa.com.vn/Phongsu/2007/09/243321/ (truy cập ngày 15/01/2011) 88 http://www.nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi VN/61/158/2/2/2/44347/Default.aspx (truy cập ngày 15/01/2011) 89 http://www.nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi VN/61/158/2/79/79/27900/Default.aspx (truy cập ngày 15/01/2011) 90 http://www.nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi-VN/61/158/2/2/2/46106/Default.aspx (truy cập ngày 15/01/2011) 91 http://www.nongnghiep.vn/nongnghiepvn/vi-VN/61/158/2/2/2/42486/Default.aspx (truy cập ngày 15/01/2011) 92 http://www.nongnghiep.vn/nongnghiepvn/viVN/61/158/45/45/45/15249/Default.as px (truy cập ngày 15/01/2011) 93 http://www.abfa.org.au/barramundi.html] (truy cập ngày 15/05/2010) 94 http://agrobenefiq.wordpress.com/2009/12/17/singapore-targets-for-growth-infish-farming (truy cập ngày 16/05/2010) 48 PHỤ LỤC Bảng chiều dài cân nặng cá khỏe làm thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn V alginolyticus chủng CH10 CoS01 đợt (ngày bắt đầu thí nghiệm 28/7/2010, ngày kết thúc thí nghiệm 07/08/2010), chủng CoK03 CoVL03 đợt (từ ngày 13/08/2010 đến ngày 22/08/2010): WTB = 19,50 ± 1,06; LTB = 11,87 ± 0,27 STT 10 10 10 Lô TN MĐTB 12 12 19 12 19 10 cfu/g 12 20 STT 20 BỂ 10 L (cm) 20 CH10 W(g) 12 10 10 10 12 12 12 20 12 20 12 20 12.5 20 12 20 10 cfu/g 12 20 20 20 BỂ 12 12 20 CH10 20 12 12 12 20 12 20 12 20 12 17 11.5 18 10 cfu/g 12 20 11.5 20 BỂ 15 12 20 20 CoS01 20 11.5 20 12 12 20 12 20 12 20 12 20 103 cfu/g 12 20 BỂ 13 CoS01 20 12 20 12 20 12 Lô TN MĐTB W(g) L (cm) 17 20 20 12 11.5 20 12 20 12 12 12 12 12 11.5 20 12 19 12 20 12 20 12 18 12 20 12 20 12 20 12 20 12 20 102 cfu/g 12 17 CoS01 12 20 BỂ 12 20 10 cfu/g 11.5 20 12 20 BỂ 14 12 18 CoS01 12 20 10 cfu/g 20 19 12 20 BỂ 16 20 18 CH10 12 19 10 cfu/g 12 20 12 20 20 Bể 11 12 20 CH10 11.5 12 20 12 19 12 10 10 10 10 20 11.5 19 12 20 12 20 12 20 12 15 11 15 11 20 105 cfu/g 11 18 BỂ 12 17 CoK03 12 20 12 20 12 20 12 20 12 20 12 20 11 20 10 cfu/g 11.5 20 12 17 BỂ 11 11.5 19 CoK03 12 18 12 20 12 20 11.5 20 12 19 12 18 11.5 20 11.5 19 12 20 12 10 10 10 10 18 12 19 12 20 12 20 12 20 12 20 12 20 12 20 CoK03 11.5 20 12 11.5 20 12 20 12 11.5 20 12 20 12 20 104 cfu/g 12 19 20 BỂ 10 19 12 20 BỂ 12 10 cfu/g 12.5 20 12 20 CoK03 12 20 12 20 12 20 11.5 20 12 20 12 20 12 20 12 20 11.5 20 12 17 11.5 18 11.5 20 12 20 12 20 11 20 12 20 12 20 12 20 12 12 18 11.5 20 12 20 12 12 20 11 20 BỂ 15 CoVL03 103cfu /g 20 20 CoVL03 105 BỂ 13 cfu/g 12 20 12 17 11.5 20 12 20 11.5 19 12 20 12 20 11 20 12 CoVL03 104 BỂ 14 cfu/g BỂ 16 CoVL03 102 cfu/g 20 11 12 18 11.5 11 19 12 20 12 20 12 20 11.5 20 12 20 12 15 11 20 12 15 11.5 19 12 20 12 18 11.5 20 12 20 12 20 12 19 12 20 11.5 20 12 18 12 20 11.5 19 12 20 PBS 12 17 20 ĐC 20 12 20 10 12 18 12 20 12 10 ĐC Không tiêm Bảng chiều dài cân nặng cá khỏe làm thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn V alginolyticus chủng CH10, CoS01, CoK03 CoVL03 đợt (từ ngày 27/08/2010 đến 05/09/2010) WTB = 21,94 ± 0,96; LTB = 12,87 ± 0,41 STT 10 10 Lô TN MĐTB W(g) L (cm) 22 22 13 22 CH10 13 13 12.5 22 13 22 13 13 21 12 22 13 21 105 cfu/g 13 22 22 BỂ 22 12 22 BỂ 11 103 cfu/g 12.5 22 13 22 CH10 13 22 13 23 13 22 13 22 13 22 13 22 13 STT 10 10 Lô TN MĐTB W(g) L (cm) 20 22 13 22 CH10 12 13 22 13 13 13 13 13 23 13.5 22 13 22 13 22 102 cfu/g 12 22 BỂ 20 22 CH10 14.5 22 104 cfu/g 13 24 22 Bể 22 13 22 13 22 13 22 13 22 13 22 13 10 10 10 10 22 22 22 13 22 13 13 13 13 13 22 13 22 13 22 13 22 103 cfu/g 13.5 22 BỂ 24 22 CoS01 12 22 105 cfu/g 13 20 22 BỂ 13 22 CoS01 13 13 13 21 12 21 12.5 22 13 22 13 22 13 22 13 22 CoK03 22 13 22 13 12.5 13 13 12 22 13 22 13 22 13 24 103 cfu/g 13 20 BỂ 21 22 CoK03 13 22 105 cfu/g 13 22 21 BỂ 17 22 14.5 20 12 22 13 22 12.5 22 13 22 12.5 22 13 10 10 10 10 22 22 13 22 13 13 12 12.5 13 13 22 13 23 13.5 23 13 22 13 22 13 22 13 22 13 23 13 22 12 22 12.5 22 CoK03 22 22 102 cfu/g 14 22 BỂ 13 24 20 CoS01 13 20 104 cfu/g 13 22 22 BỂ 13 22 CoS01 13 13 12.5 22 13 22 12.5 13 21 12 22 13 21 104 cfu/g 13 22 22 BỂ 22 12 22 BỂ 15 102 cfu/g 12.5 22 13 22 CoK03 13 22 13 23 12.5 22 13 22 13 22 12.5 22 13 22 12 10 23 22 12.5 22 13 22 13 22 13 22 13 22 12.5 22 13 22 13 22 BỂ 10 CoVL03 105 cfu/g 13.5 10 22 BỂ CoVL03 104 cfu/g 13 22 13 13.5 22 13 22 13 22 12 22 13 22 13 12 22 13 13 22 12.5 22 13 22 13 22 13 22 13 24 14 22 12.5 22 12 22 13 22 13 21 12 22 13 21 12.5 20 12 22 13 20 10 12 24 22 CoVL03 BỂ 18 103cfu /g 20 12.5 22 12.5 22 13 22 13 22 13 22 12.5 22 13 21 13 22 13 21 12.5 22 13 22 13 22 13 23 PBS 12.5 22 ĐC 14 13 22 13.5 23 13 22 12.5 22 13 22 13 22 12.5 23 13 CoVL03 BỂ 16 102 cfu/g 10 ĐC 12 Khơng tiêm Kết thí nghiệm chủng CH10 Tỷ lệ biểu bệnh lở loét chủng CH10 Thời gian 105 104 103 102 DC (ngày) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 100 100 100 100 60 50 20 20 0 100 100 100 100 60 50 20 20 0 100 100 100 100 50 50 20 20 0 100 100 100 100 50 50 20 10 0 100 100 100 100 50 40 20 10 0 100 100 100 100 30 40 10 10 0 10 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 30 20 20 20 30 20 20 20 10 0 10 0 0 0 0 0 3.2 Tỷ lệ chết tích lũy cá chẽm tiêm chủng CH10 Thời gian 105 104 103 102 DC (ngày) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 10 0 0 0 0 20 10 10 0 0 0 40 30 10 30 0 0 0 70 50 20 40 0 0 0 70 50 40 40 0 0 0 90 60 50 40 10 0 0 90 60 60 50 10 10 0 0 90 70 60 50 10 20 0 0 90 70 60 60 10 20 0 0 10 90 80 60 60 10 20 0 0 Kết thí nghiệm chủng CoS01 4.1 Tỷ lệ biểu bệnh lở loét chủng CoS01 Thời gian 105 104 103 102 DC (ngày) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 100 100 100 100 30 50 40 30 0 100 100 100 100 30 50 40 30 0 100 100 100 100 30 50 40 30 0 100 100 100 100 30 40 40 20 0 100 100 100 100 30 40 30 20 0 100 100 100 100 20 30 30 20 0 100 100 100 100 20 30 20 20 0 100 100 100 100 20 20 10 10 0 100 100 100 100 20 10 10 10 0 10 100 100 100 100 10 10 10 10 0 4.2 Tỷ lệ chết tích lũy chủng CoS01 Thời gian 105 104 103 102 DC (ngày) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 0 0 0 0 0 10 10 0 0 0 0 20 30 10 10 0 0 0 30 50 20 20 0 0 0 50 60 30 20 10 0 0 50 70 30 30 0 0 0 60 70 30 30 0 0 0 10 70 70 70 70 80 80 30 30 30 40 40 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Kết thí nghiệm chủng CoK03 5.1 Tỷ lệ biểu bệnh lở loét chủng CoK03 Thời gian 105 104 103 102 DC (ngày) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 80 100 40 50 0 0 0 90 100 40 50 20 30 0 0 100 100 40 50 20 30 0 0 100 90 50 60 20 20 0 0 90 90 60 60 10 20 0 0 90 90 60 40 10 20 0 0 60 80 40 40 10 10 0 0 60 70 30 20 10 0 0 50 60 20 20 0 0 0 10 50 40 20 10 0 0 0 5.2 Tỷ lệ chết tích lũy chủng CoK03 Thời gian 105 104 103 102 DC (ngày) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 20 10 0 0 0 20 10 0 0 0 30 10 0 0 0 30 10 0 0 0 30 10 0 0 0 30 10 0 0 0 10 30 10 0 0 0 Kết thí nghiệm chủng CoVL03 6.1 Tỷ lệ biểu bệnh lở loét chủng CoVL03 Thời gian 105 104 103 102 DC (ngày) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 30 50 20 0 0 0 30 50 20 0 0 0 30 50 10 0 0 0 20 60 10 0 0 0 20 50 0 0 0 0 20 30 0 0 0 0 10 0 0 30 20 10 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6.2 Tỷ lệ chết tích lũy chủng CoVL03 Thời gian 105 104 103 102 DC (ngày) Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 0 0 0 0 10 10 0 0 0 0 Máy lắc Một số dụng cụ thí nghiệm Bộ điện di Hóa chất dùng đổ gel ... Biểu cá bị bệnh lở loét tiêm chủng vi khuẩn CoS01 30 Hình 3.8 Tỷ lệ biểu bệnh lở loét cá chẽm chủng CoK03 31 Hình 3.9 Biểu cá bị bệnh lở loét tiêm chủng vi khuẩn CoK03 31 Hình 3.10 Biểu cá. .. gây bệnh, nghiên cứu vaccin phịng bệnh cá biển ni, tơi đề xuất thực đề tài: “ Độc lực thành phần Protein chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bị bệnh lở loét. .. bệnh lở loét bè ni thương phẩm Khánh Hịa” Mục tiêu đề tài: Xác định mối tương quan độc lực thành phần protein chủng vi khuẩn V .alginolyticus phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét để làm sở cho nghiên