Khảo sát ảnh hưởng của một số chất thuộc nhóm auxin đến khả năng tạo mô sẹo phôi hóa phục vụ chuyển gen của một số giống sắn (manihot esculenta crantz)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HUYỀN Tên đề tài: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THUỘC NHÓM AUXIN ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO PHÔI HÓA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN CỦA MỘT SỐ GIỐNG SẮN (Manihot esculenta Crantz) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K42 CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 – 2014 Giảng viên hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Anh Vũ Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam 2. Th.S. Lương Thị Thu Hường Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HUYỀN Tên đề tài: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THUỘC NHÓM AUXIN ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO PHÔI HÓA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN CỦA MỘT SỐ GIỐNG SẮN (Manihot esculenta Crantz) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K42 CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2010 – 2014 Giảng viên hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Anh Vũ Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam 2. Th.S. Lương Thị Thu Hường Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Văn Đồng (Giám đốc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp), TS. Nguyễn Anh Vũ người đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành quá trình thực tập. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Lê Ngọc Quỳnh cùng toàn thể cán bộ và nhân viên phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, lời tri ân tới ThS. Lương Thị Thu Hường đã tận chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong thời gian qua. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp nhất, luôn hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của tôi được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Huyền DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 2000-2011 13 Bảng 2.2. Diện tích, sản lượng và năng suất trồng sắn của Việt Nam qua các năm 2000-2013 14 Bảng 2.3. Các quốc gia phát triển nhiên liệu sinh học với quy mô lớn 16 Bảng 2.4. Tám nhà máy sản xuất Ethanol và rượu 17 từ sắn của Việt Nam năm 2010 17 Bảng 3.1. Các môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu 24 Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo sau 28 ngày 32 Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng tạo mô sẹo sau 28 ngày 34 Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của picloram tới khả năng tạo mô sẹo sau quá trình nuôi cấy 35 Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa sau quá trình nuôi cấy 37 Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa sau quá trình nuôi cấy 38 Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của picloram tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa sau quá trình nuôi cấy 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1. Biểu đồ sản lượng trồng sắn của Việt Nam từ năm 2000 - 2013 15 Hình 3.1. Cây sắn trong ống nghiệm 24 Hình 3.3. Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 27 Hình 4.1. Ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo 33 Hình 4.2. Ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng tạo mô sẹo 34 Hình 4.3. Ảnh hưởng của picloram tới khả năng tạo mô sẹo 36 Hình 4.4. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các auxin ở công thức tối ưu tới khả năng tạo mô sẹo 37 Hình 4.5. Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các auxin ở công thức tối ưu tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 40 Hình 4.6. Giống TMS60444 sau 2 lần cấy chuyển trong môi trường MMS 41 Hình 4.7. Giống KM98 – 7 sau 2 lần cấy chuyển trong môi trường 41 Hình 4.8. Giống sắn sau 4 lần cấy chuyển trong môi trường MMS 42 DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT 2,4D : Axit 2,4 dicloro-phenoxiaxetic(2,4D) ADN : Axit deoxyribonucleic BAP : 6-benzylaminopurine CIAT :International Center for Tropical Agriculture CV : Coeficient of Variation Đ/C : Đối chứng FAO : Food and Agriculture Organization HCN : Hidro xyanua LSD : Least Significant Difference MS : Murashige and Skoog’s NAA : α - Naphlene axetic axit TN : Thí nghiệm MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 9 1.2. Mục đích và mục tiêu nghiên cứu 10 1.2.1. Mục đích 10 1.2.2. Yêu cầu 10 1.3. Ý nghĩa của đề tài 10 1.3.1. Ý nghĩa khoa học 10 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn 10 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 2.1. Tổng quan chung về cây sắn 11 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 11 2.1.2. Đặc điểm thực vật học 11 2.1.3. Đặc điểm một số giống sắn nghiên cứu 12 2.1.4. Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng 12 2.1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ 13 2.1.5. Nhu cầu sắn cho nhiên liệu sinh học 16 2.2. Auxin và vai trò của auxin trong quá trình tạo mô sẹo 18 2.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn 19 2.3.1. Trên thế giới 19 2.3.2. Tại Việt Nam 23 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 24 3.2. Môi trường nuôi cấy 24 3.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 24 3.4. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 25 3.5. Nội dung nghiên cứu 25 3.6. Phương pháp nghiên cứu 25 3.6.1. Nội dung 1: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo 27 3.6.2. Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 29 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 4.1. Kết quả ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo 32 4.2. Kết quả ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 37 4.2.3. Kết quả ảnh hưởng của picroram tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 39 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1. Kết luận 43 5.2. Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 I. Tài liệu tiếng Việt 45 II. Tài liệu tiếng anh 45 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Sắn (Manihot esculenta Crantz) hiện được trồng trên hơn 100 nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc ba châu: châu Á, châu Phi và châu Mỹ La Tinh. Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) xếp sắn là cây lương thực quan trọng ở các nước đang phát triển sau lúa gạo, ngô và lúa mì. Tinh bột sắn là một thành phần quan trọng trong chế độ ăn của hơn một tỷ người trên thế giới [17]. Ở Việt Nam, cây sắn được xác định là loài cây nhiên liệu sinh học thích hợp duy nhất trong thời gian tới. Ngoài ra, sắn đã trở thành một trong 10 mặt hàng xuất khẩu quan trọng của Việt Nam với kim ngạch năm 2012 đạt tới 1,2 tỷ USD (FAO, 2013) [18]. Tuy nhiên, năng xuất và sản lượng sắn của nước ta còn ở mức thấp, chất lượng tinh bột trong sắn cũng không cao do canh tác không đúng kỹ thuật, khả năng kháng virus và sâu bệnh thấp, diện tích trồng không quy mô, tập chung. Do vậy, chúng ta cần tạo ra giống sắn mới cho năng xuất và chất lượng cao đáp ứng đủ nhu cầu thực tế [21]. Ngày nay trong công tác chọn tạo giống sắn, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào được áp dụng để nhân nhanh, tạo giống sạch bệnh và kỹ thuật di truyền, chuyển gen tạo giống mới mang các đặc tính mong muốn một cách nhanh chóng và hiệu quả được nghiên cứu [20]. Tạo mô sẹo phôi hóa là khâu quan trọng để tạo vật liệu phục vụ chuyển gen vào sắn. Mô sẹo phôi hóa đã được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu như tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu chuyển gen và bảo quản nguồn gen. Tạo mô sẹo phôi hóa có ý nghĩa quan trọng cho nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của các giống sắn, làm cơ sở tiến tới chuyển gen (tổng hợp tinh bột, gen kháng virus, ) nâng cao năng xuất, hàm lượng tinh bột phục vụ sản xuất nhiên liệu sinh học [29]. Việc sử dụng một số các chất kích thích sinh trưởng đã nâng cao hiệu quả rõ rệt vì nó kích thích sự phân chia tế bào của mô phân sinh thượng tầng để hình thành mô sẹo (callus) [11]. Các chất thuộc nhóm auxin đều có hiệu quả trong việc cảm ứng để duy trì mô hoặc để cảm ứng mô sẹo có khả năng sinh phôi. Tuy nhiên các chất khác nhau (2,4-D, NAA, picloram…) và được sử dụng ở những nồng độ khác nhau thì hiệu quả tạo mô sẹo không giống nhau trên các giống sắn. Chúng có thể kích thích cũng có thể ức chế quá trình tạo mô sẹo [16]. Trong một nghiên cứu tạo mô sẹo của E. Sofiari và cộng sự, 2,4D cho kết quả cao hơn so với NAA trên giống TMS90853[16]. Ông cho rằng nên sử dụng 2,4D để tạo mô sẹo trong quá trình nuôi cấy. Trong khi đó Jiu Liu và cộng sự lại sử dụng piclroram cho quá trình tạo mô sẹo và mô sẹo phôi hóa và cho kết quả khá tốt trên giông TMS 60444 [24]. Các giống sắn ở Việt Nam rất đa dạng và có nhiều giống tốt nhưng quá trình nghiên cứu về sắn liên quan tới tạo mô sẹo hay chuyển gen còn rất nhiều khó khăn, hạn chế [1]. Do vậy vấn đề đặt ra hiện nay là cần tìm ra loại auxin cho hiệu quả tạo mô sẹo, mô sẹo phôi hóa cao nhất phục vụ chuyển gen trên các giống sắn Việt Nam. Xuất phát từ thực tiễn trên tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của một số chất thuộc nhóm auxin đến khả năng tạo mô sẹo phôi hóa phục vụ chuyển gen của một số giống sắn (Manihot esculenta Crantz)”. 1.2. Mục đích và mục tiêu nghiên cứu 1.2.1. Mục đích - Khảo sát ảnh hưởng của NAA, 2,4D và picloram đến khả năng tạo mô sẹo của giống sắn KM98 – 7 và giống TMS60444. 1.2.2. Yêu cầu - Xác định ảnh hưởng của NAA, 2,4D và picloram đến sự hình thành mô sẹo ở giống sắn KM98 – 7 và TMS60444 - Xác định ảnh hưởng của NAA, 2,4D và picloram đến sự hình thành mô sẹo phôi hóa ở giống sắn KM98 – 7 và TMS60444 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Thành công của nghiên cứu tạo tiền đề cho việc chuyển các gen phù hợp cần thiết với mục đích khác nhau vào cây sắn Việt Nam. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Xây dựng được quy trình tạo mô sẹo phôi hoá phục vụ chuyển gen hiệu quả Tạo tiền đề và nguyên liệu cho các quá trình chuyển gen sắn ở Việt Nam. [...]... Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo Các chồi thu được trong môi trường CAM được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu cho ảnh hưởng của auxin tới khả năng tạo mô sẹo Các loại auxin: NAA, 2,4-D, picloram được sử dụng để khảo sát sự tạo thành mô sẹo 3.6.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu sự ảnh hưởng NAA tới khả năng tạo mô sẹo Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị mô sẹo : nuôi... biến động của các thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV% Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Kết quả ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo 4.1.1 Kết quả ảnh hưởng NAA tới khả năng tạo mô sẹo Bảng 4.1 Kảt quả ảnh hảảng cảa NAA tải khả năng tảo mô sảo sau 28 ngày Số Nồng độ (mg/l) CT lượng mẫu cấy (mẫu) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Chất lượng mô sẹo tạo thành Giống Giống TMS60444... nguyên liệu mô sẹo phôi hóa Chuyển gen vào phôi soma gặp nhiều trở ngại và khó khăn đặc biệt là tần số cây con tái sinh thấp [11], tỉ lệ tạo thể khảm cao [31] Chuyển gen thông qua mô sẹo phôi hóa sẽ khắc phục được tình trạng này, hạn chế được thời gian công sức mà hiệu quả chuyển gen lại cao hơn [39] Năm 1998, Gonzalez và cộng sự đã thành công trong việc chuyển gen vào mô sẹo phôi hóa giống TMS 60444... thí nghiệm tạo sắn chuyển gen kháng virus khảm [11, 38] Năm 2009, quy trình chuyển gen vào cây sắn từ mô sẹo phôi hóa và tái sinh thành cây hoàn chỉnh của Bull và cộng sự đã cho thấy cụ thể các giai đoạn khác nhau trong quy trình, họ cũng đưa ra một số cải tiến góp phần hoàn thiện quy trình chuyển gen hiện nay [29] Chuyển gen vào sắn nhờ vi khuẩn A tumefaciens từ mô sẹo phôi hóa, việc chuyển gen trở lên... 60444 TMS 60444 là giống sắn mô hình được nhập từ CIAT Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy đây là giống sắn có khả năng tạo mô sẹo phôi hóa chất lượng nhất và đã được chuyển gen thành công Vì vậy, chúng tôi sử dụng giống sắn này làm giống mô hình để đánh giá chất lượng mô sẹo của các giống Việt Nam được nghiên cứu TMS 60444 được thừa nhận vào ngày 01-06-1988 Chiều cao đạt được của giống khi thu hoạch... mô sẹo phôi hóa, gen mục tiêu sẽ được chuyển vào mô sẹo phôi hóa, sau đó tái sinh chúng thành cây hoàn chỉnh từ phôi trưởng thành [31] Đây là một mốc quan trọng đánh dấu trong quá trình chọn tạo giống sắn bằng phương pháp phân tử Sau nhiều năm phát triển, công nghệ chuyển gen đã từng bước trưởng thành và tiến bộ đáng kể , đã xác nhận được gen chức năng và giống chuyển gen Trong chuyển gen, chuyển gen. .. Chỉ tiêu theo dõi: Giống TN 1 Phương pháp tiến hành: Tương tự TN 1, chỉ khác loại auxin bổ sung là picloram 3.6.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa Các loại auxin: NAA, 2,4-D, picloram được sử dụng ở nồng độ tương ứng với các thí nghiệm trên tiếp tục để khảo sát sự tạo thành mô sẹo phôi hóa từ các mô sẹo đã được tạo ra từ các thí nghiệm... tin cậy hơn, các thí nghiệm nên được khảo sát lặp lại nhiều lần trên nhiều giống hơn hơn và các điều kiện nghiên cứu cũng cần được tối ưu hơn 4.1.2 Kết quả ảnh hưởng 2,4D tới khả năng tạo mô sẹo Bảng 4.2 Kảt quả ảnh hảảng cảa 2,4D tải khả năng tảo mô sảo sau 28 ngày Nồng độ (mg/l) CT Số lượng mẫu cấy (mẫu) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) Chất lượng mô sẹo tạo thành Giống Giống TMS60444 KM98 – 7 1(Đ/C) 0 300... 60444 [20], đánh dấu một bước tiến mới cho việc áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học trên đối tượng cây sắn Sau gần 5 năm phát triển kể từ khi phương pháp chuyển gen từ mô sẹo phôi hóa vào giống TMS60444 được giới thiệu, phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium từ mô sẹo phôi hóa đã được tiến hành thành công ở một số phòng thí nghiệm [24] Phương pháp chuyển gen sắn từ mô sẹo phôi hóa ngày càng phổ... mg/l) Bổ sung 14 ngày MMS Tấo mô sấo phôi MMS hóa Cấy chuyấn Hình 3.3 Sả đả khảo sát ảnh hảảng cảa NAA tải khả năng tảo mô sảo phôi hóa Thí nghiệm cũng làm tương tự như vậy với 2,4D (nồng độ 0; 6; 8; 9; 10 mg/l) và picloram (nồng độ 0; 8; 9; 10; 12 mg/l) Tương ứng bổ sung một trong 3 chất trên vào các môi trường với mục đích cuối cùng là tạo được mô sẹo phôi hóa phục vụ chuyển gen Điều kiện nuôi cấy: Các . HUYỀN Tên đề tài: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THUỘC NHÓM AUXIN ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO PHÔI HÓA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN CỦA MỘT SỐ GIỐNG SẮN (Manihot esculenta Crantz) KHOÁ LUẬN TỐT. HUYỀN Tên đề tài: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THUỘC NHÓM AUXIN ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO PHÔI HÓA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN CỦA MỘT SỐ GIỐNG SẮN (Manihot esculenta Crantz) KHOÁ LUẬN TỐT. một số chất thuộc nhóm auxin đến khả năng tạo mô sẹo phôi hóa phục vụ chuyển gen của một số giống sắn (Manihot esculenta Crantz) . 1.2. Mục đích và mục tiêu nghiên cứu 1.2.1. Mục đích - Khảo