ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HUYỀN Tên đề tài: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THUỘC NHÓM AUXIN ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO PHÔI HÓA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN CỦA M
Trang 1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN THỊ HUYỀN
Tên đề tài:
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THUỘC NHÓM AUXIN ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO PHÔI HÓA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG SẮN (Manihot esculenta Crantz)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Thái Nguyên, năm 2014
Trang 2ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN THỊ HUYỀN
Tên đề tài:
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THUỘC NHÓM AUXIN ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO PHÔI HÓA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG SẮN (Manihot esculenta Crantz)
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
Khoa CNSH – CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Thái Nguyên, năm 2014
Trang 3LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin cảm ơn PGS TS Nguyễn Văn Đồng (Giám đốc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp), TS Nguyễn Anh Vũ người đã tận tình chỉ bảo và tạo
điều kiện giúp tôi hoàn thành quá trình thực tập
Tôi xin chân thành cảm ơn KS Lê Ngọc Quỳnh cùng toàn thể cán bộ và nhân viên phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, lời tri ân tới ThS Lương Thị Thu Hường đã tận chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong thời gian qua
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp nhất, luôn hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu
Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của tôi được hoàn thiện hơn
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Thị Huyền
Trang 4DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của thế giới từ năm 2000-2011 13
Bảng 2.2 Diện tích, sản lượng và năng suất trồng sắn của Việt Nam qua các năm 2000-2013 14
Bảng 2.3 Các quốc gia phát triển nhiên liệu sinh học với quy mô lớn 16
Bảng 2.4 Tám nhà máy sản xuất Ethanol và rượu 17
từ sắn của Việt Nam năm 2010 17
Bảng 3.1 Các môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu 24
Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo sau 28 ngày 32
Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng tạo mô sẹo sau 28 ngày 34
Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của picloram tới khả năng tạo mô sẹo sau quá trình nuôi cấy 35
Bảng 4.4 Kết quả ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa sau quá trình nuôi cấy 37
Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa sau quá trình nuôi cấy 38
Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng của picloram tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa sau quá trình nuôi cấy 39
Trang 5DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Biểu đồ sản lượng trồng sắn của Việt Nam từ năm 2000 - 2013 15
Hình 3.1 Cây sắn trong ống nghiệm 24
Hình 3.3 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 27
Hình 4.1 Ảnh hưởng của NAA tới khả năng tạo mô sẹo 33
Hình 4.2 Ảnh hưởng của 2,4D tới khả năng tạo mô sẹo 34
Hình 4.3 Ảnh hưởng của picloram tới khả năng tạo mô sẹo 36
Hình 4.4 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các auxin ở công thức tối ưu tới khả năng tạo mô sẹo 37
Hình 4.5 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các auxin ở công thức tối ưu tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 40
Hình 4.6 Giống TMS60444 sau 2 lần cấy chuyển trong môi trường MMS 41
Hình 4.7 Giống KM98 – 7 sau 2 lần cấy chuyển trong môi trường 41
Hình 4.8 Giống sắn sau 4 lần cấy chuyển trong môi trường MMS 42
Trang 6DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
2,4D : Axit 2,4 dicloro-phenoxiaxetic(2,4D)
ADN : Axit deoxyribonucleic
BAP :6-benzylaminopurineCIAT :International Center for Tropical Agriculture
CV : Coeficient of Variation
Đ/C : Đối chứng FAO : Food and Agriculture Organization HCN : Hidro xyanua
LSD : Least Significant Difference
MS : Murashige and Skoog’s NAA : α- Naphlene axetic axit
TN : Thí nghiệm
Trang 7MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 9
1.2 Mục đích và mục tiêu nghiên cứu 10
1.2.1 Mục đích 10
1.2.2 Yêu cầu 10
1.3 Ý nghĩa của đề tài 10
1.3.1 Ý nghĩa khoa học 10
1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 10
Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11
2.1 Tổng quan chung về cây sắn 11
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 11
2.1.2 Đặc điểm thực vật học 11
2.1.3 Đặc điểm một số giống sắn nghiên cứu 12
2.1.4 Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng 12
2.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ 13
2.1.5 Nhu cầu sắn cho nhiên liệu sinh học 16
2.2 Auxin và vai trò của auxin trong quá trình tạo mô sẹo 18
2.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn 19
2.3.1 Trên thế giới 19
2.3.2 Tại Việt Nam 23
Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 24
3.2 Môi trường nuôi cấy 24
3.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 24
3.4 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 25
3.5 Nội dung nghiên cứu 25
3.6 Phương pháp nghiên cứu 25
3.6.1 Nội dung 1: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo 27
3.6.2 Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 29
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32
Trang 84.1 Kết quả ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo 32
4.2 Kết quả ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 37
4.2.3 Kết quả ảnh hưởng của picroram tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa 39
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43
5.1 Kết luận 43
5.2 Kiến nghị 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
I Tài liệu tiếng Việt 45
II Tài liệu tiếng anh 45
Trang 9
MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề
Sắn (Manihot esculenta Crantz) hiện được trồng trên hơn 100 nước có khí
hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc ba châu: châu Á, châu Phi và châu Mỹ La Tinh
Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) xếp sắn là cây lương thực quan trọng ở các nước đang phát triển sau lúa gạo, ngô và lúa mì Tinh bột sắn là một thành phần quan trọng trong chế độ ăn của hơn một tỷ người trên thế giới [17]
Ở Việt Nam, cây sắn được xác định là loài cây nhiên liệu sinh học thích
hợp duy nhất trong thời gian tới Ngoài ra, sắn đã trở thành một trong 10 mặt hàng xuất khẩu quan trọng của Việt Nam với kim ngạch năm 2012 đạt tới 1,2 tỷ USD (FAO, 2013) [18] Tuy nhiên, năng xuất và sản lượng sắn của nước ta còn
ở mức thấp, chất lượng tinh bột trong sắn cũng không cao do canh tác không đúng kỹ thuật, khả năng kháng virus và sâu bệnh thấp, diện tích trồng không quy
mô, tập chung Do vậy, chúng ta cần tạo ra giống sắn mới cho năng xuất và chất lượng cao đáp ứng đủ nhu cầu thực tế [21]
Ngày nay trong công tác chọn tạo giống sắn, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào được
áp dụng để nhân nhanh, tạo giống sạch bệnh và kỹ thuật di truyền, chuyển gen tạo giống mới mang các đặc tính mong muốn một cách nhanh chóng và hiệu quả được nghiên cứu [20] Tạo mô sẹo phôi hóa là khâu quan trọng để tạo vật liệu phục vụ chuyển gen vào sắn Mô sẹo phôi hóa đã được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu như tạo giống sạch bệnh, nghiên cứu chuyển gen và bảo quản nguồn gen Tạo mô sẹo phôi hóa có ý nghĩa quan trọng cho nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của các giống sắn, làm cơ sở tiến tới chuyển gen (tổng hợp tinh bột, gen kháng virus, ) nâng cao năng xuất, hàm lượng tinh bột phục vụ sản xuất nhiên liệu sinh học [29]
Việc sử dụng một số các chất kích thích sinh trưởng đã nâng cao hiệu quả rõ rệt vì nó kích thích sự phân chia tế bào của mô phân sinh thượng tầng để hình thành
mô sẹo (callus) [11] Các chất thuộc nhóm auxin đều có hiệu quả trong việc cảm ứng
để duy trì mô hoặc để cảm ứng mô sẹo có khả năng sinh phôi Tuy nhiên các chất
khác nhau (2,4-D, NAA, picloram…) và được sử dụng ở những nồng độ khác nhau thì hiệu quả tạo mô sẹo không giống nhau trên các giống sắn Chúng có thể kích thích cũng có thể ức chế quá trình tạo mô sẹo [16] Trong một nghiên cứu tạo mô sẹo của
E Sofiari và cộng sự, 2,4D cho kết quả cao hơn so với NAA trên giống TMS90853[16] Ông cho rằng nên sử dụng 2,4D để tạo mô sẹo trong quá trình nuôi
Trang 10cấy Trong khi đó Jiu Liu và cộng sự lại sử dụng piclroram cho quá trình tạo mô sẹo
và mô sẹo phôi hóa và cho kết quả khá tốt trên giông TMS 60444 [24] Các giống sắn
ở Việt Nam rất đa dạng và có nhiều giống tốt nhưng quá trình nghiên cứu về sắn liên
quan tới tạo mô sẹo hay chuyển gen còn rất nhiều khó khăn, hạn chế [1]
Do vậy vấn đề đặt ra hiện nay là cần tìm ra loại auxin cho hiệu quả tạo mô sẹo, mô sẹo phôi hóa cao nhất phục vụ chuyển gen trên các giống sắn Việt Nam
Xuất phát từ thực tiễn trên tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của
một số chất thuộc nhóm auxin đến khả năng tạo mô sẹo phôi hóa phục vụ chuyển gen của một số giống sắn (Manihot esculenta Crantz)”
1.2 Mục đích và mục tiêu nghiên cứu
Trang 11Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan chung về cây sắn
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Sắn thuộc họ Euphobiaceae, phân họ Crtonoideae, tông Manihoteae, chi Manihot, loài M Esculenta, tên khoa học là Manihot Esculenta Crantz Sắn còn
được gọi với tên tiếng anh là cassava [25] Ở Việt Nam, sắn hay còn được gọi là cây
khoai mì, cây củ mì…
Chi Manihot bao gồm những cây có hoa, hạt kín, có hai lá mầm, họ thầu dầu
Năm 1776 Crantz công bố một sự mô tả loài với tên Manihot esculenta Ông dùng lại tên loài M esculenta và không còn phân biệt giữa sắn đắng và sắn ngọt Chi Manihot thuộc họ thầu dầu, có tới hơn 300 chi và 8000 loài hầu hết là cây nhiệt đới Chi Manihot thuộc nhóm Manihotae Tất cả các loài trong chi đều có số lượng
nhiễm sắc thể 2n= 36 Rogers và Appan đã xây dựng một bảng phân loại cho 98 loài, phân thành 17 nhóm [29] Sự nhận dạng các loài và các nhóm dựa vào sự phân tích nhiều mặt của nhiều đặc điểm hình thái ở các bộ phận trên mặt đất Nhờ vào bảng phân loại trên người ta đã lập được một bảng nhận dạng các loài trong chi [7]
Sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ La tinh và được trồng cách đây khoảng 5000 năm Cây sắn đựơc du nhập vào Việt Nam khoảng giữa thế kỷ 18 [19] Sắn được canh tác phổ biến tại hầu hết các tỉnh của Việt Nam Trong đó, diện tích sắn trồng nhiều nhất ở vùng Đông Nam Bộ, vùng Tây Nguyên, vùng núi và trung du phía bắc, vùng ven biển nam Trung Bộ và vùng ven biển bắc Trung Bộ [3]
2.1.2 Đặc điểm thực vật học
Cây sắn cao 2–3 m, lá khía thành nhiều thùy, rễ ngang phát triển thành củ và tích luỹ tinh bột Thời gian sinh trưởng của sắn từ 6 đến 12 tháng, có nơi tới 18 tháng, tùy giống Vụ trồng, địa bàn trồng và mục đích sử dụng, nhiệt độ sinh trưởng 20-30oC [2] Hoa sắn thuộc loại hoa chùm, đơn tính, có cuống dài mọc ra từ chỗ phân cành, ngọn thân Quả sắn có kích thước từ 1-1,5 cm, một quả thường có 3 hạt hạt sắn nặng từ 95-136 mg, màu nâu đen Nhiệt độ thích hợp cho hạt sắn nảy mầm
là từ 25- 30oC [19] Sắn dễ trồng, hợp nhiều loại đất, vốn đầu tư thấp, hợp khả năng kinh tế với nhiều hộ gia đình nông dân nghèo, thiếu lao động tận dụng đất để lấy ngắn nuôi dài Sắn đạt năng suất cao và lợi nhuận khá nếu biết dùng giống tốt và
trồng đúng quy trình canh tác sắn bền vững [3]
Trang 12Bên cạnh đó, sắn cũng có một số nhược điểm như trồng sắn làm kiệt đất, củ sắn nghèo đạm và vitamin, có độc tố HCN trong sắn củ tươi, chế biến sắn gây ô nhiễm môi trường [3]
2.1.3 Đặc điểm một số giống sắn nghiên cứu
Giống KM98 – 7
Giống KM98 – 7 được cung cấp bởi trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Cây Có
Củ - Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
Giống này là con lai chọn lọc của tổ hợp lai SM 1717 có mẹ là CM321-188, (polycross) có nguồn gốc từ CIAT/Colombia Giống đã được Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cho phép đặc cách công nhận giống ngày 02 tháng 10 năm
Giống TMS 60444
TMS 60444 là giống sắn mô hình được nhập từ CIAT Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy đây là giống sắn có khả năng tạo mô sẹo phôi hóa chất lượng nhất và đã được chuyển gen thành công Vì vậy, chúng tôi sử dụng giống sắn này làm giống mô hình để đánh giá chất lượng mô sẹo của các giống Việt Nam được nghiên cứu
TMS 60444 được thừa nhận vào ngày 01-06-1988 Chiều cao đạt được của giống khi thu hoạch khoảng 215 cm Lá trung tâm có dạng hình ngọn giáo Cuống
lá màu xanh xen kẽ với một ít màu đỏ.Lá trưởng thành có màu xanh đậm và xẻ thành 5 thùy lá Rễ củ có màu trắng
2.1.4 Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng
Sắn là cây lương thực quan trọng trong cơ cấu nông nghiệp sau lúa, ngô và
đậu tương [3] Một số thành phần dinh dưỡng trong củ sắn:
- Hydrat cacbon: chiếm 88-91% trọng lượng khô của củ sắn, trong đó:
+ Tinh bột: 84-87%
+ Đường tổng số: 4% (Saccaarose 71%, glucose 13%, fructose 9%, mantose 5%)
- Ngoài ra sắn còn chứa một số chất khác với hàm lượng thấp: protein, chất béo, một số chất khoáng (P, K, Mg, ) và một số Vitamin (B1, B2, )
Trang 13Sắn là cây trồng có nhiều công dụng trong chế biến công nghiệp, thức ăn gia súc
và lương thực thực phẩm như bột ngọt, rượu cồn, mì ăn liền, gluco, xiro, bánh kẹo, mạch nha, kỹ nghệ chất dính (hồ vải, dán gỗ), bún, miến, mì ống, mì sợi, bột khoai, bánh tráng, hạt trân châu (tapioca), phụ gia thực phẩm, phụ gia dược phẩm [7] Hiện tại, sản phẩm sắn ngày càng thông dụng trong buôn bán, trao đổi thương mại quốc tế
2.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ
2.1.4.1 Trên thế giới
Hiện nay, sắn được trồng trên hơn 100 quốc gia trên toàn thế giới với các quy mô canh tác rất khác nhau Sản lượng sắn toàn thế giới trong nhiều năm trở lại
đây duy trì tương đối ổn định ở mức sản lượng trên 200 triệu tấn [18]
Bảng 2.1 Diản tích, năng suảt và sản lảảng sản cảa thả giải tả năm 2000-2011 Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lượng (triệu tấn)
2.1.4.2 Việt Nam
Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực quan trọng đứng hàng thứ ba sau lúa và
ngô Cây sắn hiện nay đã chuyển đổi vai trò từ cây lương thực, thực phẩm thành cây
Trang 14công nghiệp hàng hóa có lợi thế cạnh tranh cao Sản xuất sắn là nguồn thu nhập quan trọng của các hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nông hộ [4]
Bảng 2.2 Diản tích, sản lảảng và năng suảt trảng sản cảa Viảt Nam qua các năm
2000-2013
(nghìn ha)
Năng suất (tấn/ha)
Sản lượng (triệu tấn)
và hàng trăm cấ sấ chấ biấn thấ công (Tấng cấc thấng kê, 2013) [9]
Trang 15Hình 2.1 Biảu đả sản lảảng trảng sản cảa Viảt Nam tả năm 2000 - 2013
Sấn là mất hàng xuất khấu hấn tấ USD mấi năm, năm 2013 xuất khấu sấn
và sấn phấm thu vấ 1,1 tấ USD vấi 3,1 triấu tấn Trong đó sấn xuất khấu 1,5 triấu tấn, trấ giá 385,5 triấu USD, giấm 32,9% vấ lấấng và giấm 31,2% vấ trấ giá so vấi năm 2012 Viất Nam xuất khấu sấn và sấn phấm chấ biấn tấ sấn sang 5 thấ trấấng chính trên thấ giấi, trong đó Trung Quấc vấn là thấ trấấng xuất khấu chính, vấi 2,6 triấu tấn Ngoài ra, Viất Nam còn xuất khấu sấn và sấn phấm sang thấ trấấng khác nhấ Hàn Quấc, Philippin, Đài Loan, Malaixia, Nhất Bấn vấi lấấng xuất đất lấn lấất 237,6 nghìn tấn, 62,8 nghìn tấn, 41,3 nghìn tấn, 28,8 nghìn tấn và 8,9 nghìn tấn (Tấng cấc thấng kê, 2013) [9] Có đấấc nhấng kất quấ này là do nhiấu yấu tấ, nhấng quan trấng hấn cấ là trong sấn xuất ngấấi trấng sấn đã chấn giấng mấi và áp dấng các biấn pháp kấ thuất Tuy nhiên, trong sấn xuất sấn hiấn nay cũng còn gấp
Trang 16nhiấu khó khăn nhấ: diấn tích sấn bấ thu hấp do cấnh tranh bấi các cây trấng khác; năng suất sấn còn thấp hấn so vấi tiấm năng cấa cây sấn (45 – 50 tấn/ha) [4]
Như vậy, nếu như diện tích sắn của Việt Nam khó có khả năng gia tăng trong những năm tới do sự cạnh tranh của các loại cây khác cũng như do quy hoạch sử dụng đất thì chúng ta vẫn còn triển vọng tăng trưởng sản lượng nhờ gia tăng năng suất nếu được
đầu tư đúng hướng về công tác chọn tạo giống và kỹ thuật canh tác sắn bền vững
2.1.5 Nhu cầu sắn cho nhiên liệu sinh học
Tinh bột sắn góp phần giải quyết vấn đề an ninh lương thực toàn cầu, là nguồn nguyên liệu có giá trị cho các ngành công nghiệp: thực phẩm, hóa chất, dược phẩm, dệt may, sản xuất giấy và đặc biệt là nguồn nhiên liệu sinh học [12] Toàn cầu hóa nền kinh tế và tăng giá xăng dầu đã mở ra cơ hội mới cho tinh bột sắn, trở thành nguồn nguyên liệu thay thế cho nhiều ngành công nghiệp khác nhau
Tại Đông Nam Á, sắn được sử dụng làm ethanol làm nhiên liệu sinh học phục
vụ giao thông vận tải [29] Từ 1 tấn sắn với hàm lượng tinh bột 30% có thể sản xuất
ra khoảng 280 lít ethanol 96% [13] Trong nhiều trường hợp, khí hậu trở thành nhân
tố quyết định cho việc lựa chọn cây trồng tiềm năng cho sản xuất nhiên liệu sinh học [15] Điều này giải thích lý do tại sao Mỹ sử dụng nguồn tinh bột ngô Canada, Úc và New Zealand chủ yếu sử dụng tinh bột từ bột mì Châu Âu sử dụng tinh bột từ khoai tây và ngô Vùng có khí hậu nhiệt đới như Brazil và các nước Châu Á sử dụng nguồn tinh bột từ sắn và các cây trồng khác [23, 27, 37] Brazil là nước tiên phong về nhiên liệu sinh học với lịch sử sản xuất trong 40 năm qua và cho đến nay đã hoàn toàn tự cung cấp nhiên liệu trong nước Có 5 quốc gia đã phát triển nhiên liệu sinh học chương trình quy mô lớn là Hoa Kỳ, Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ và Pháp (Bảng 2.3) Trên thế giới, 17 quốc gia đã phát triển nhiên liệu sinh học Sắn sử dụng làm nhiên liệu sinh học có lợi thế cao ở nhiều nước châu Á đặc biệt là ở Việt Nam
Bảng 2.3 Các quảc gia phát triản nhiên liảu sinh hảc vải quy mô lản
Trang 17Ở Việt Nam, cây sắn đã và đang là cây trồng được ưu tiên nghiên cứu phát triển
trong tầm nhìn chiến lược đến năm 2020 của Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn Nghiên cứu và phát triển cây sắn theo hướng sử dụng đất nghèo dinh dưỡng, đất khó khăn là hướng hỗ trợ chính cho việc thực hiện “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” đã được Thủ tướng Chính phủ phê duyệt tại quyết
định số 177/2007/ QĐ-TT ngày 20 tháng 11 năm 2007 [8]
Theo đề án phát triển, đến năm 2015, Việt Nam cần 4,2 triệu tấn sắn lát để sản xuất ra 750 triệu lít ethanol Tám nhà máy nhiên liệu sinh học đã được cấp phép với nhu cầu tiêu thụ mỗi năm khoảng 1,2 triệu tấn sắn lát PetroVietnam đã triển khai công tác đầu tư xây dựng 3 nhà máy sản xuất cồn sinh học đặt tại 3 miền Bắc, Trung, Nam với công suất mỗi nhà máy là 100.000 m³ cồn/năm tương đương khoảng 230 nghìn tấn sắn lát khô/năm hoặc 575 nghìn tấn củ tươi/năm Ngoài ra, nhà máy ethanol Đại Tân, huyện Đại Lộc, Quảng Nam do Công ty Cổ phần Đồng Xanh đầu tư với công suất của nhà máy là 125.000 tấn ethanol/năm, nhà máy cần
300.000 tấn sắn khô mỗi năm [21] (Bảng 2.4)
Bảng 2.4 Tám nhà máy sản xuảt Ethanol và rảảu
tả sản cảa Viảt Nam năm 2010
Công suất (triệu lít /năm)
(Hoàng Kim Và Nguyễn Văn Bộ, 2011) [21]
Theo đánh giá của bộ Công thương, trong tương lai gần, thị trường tiêu thụ sắn lát sẽ có cạnh tranh khốc liệt và thiếu hụt nguồn nguyên liệu Tăng năng suất cây trồng dựa vào các thành tựu của công nghệ sinh học là một trong những ưu tiên hàng đầu hiện nay, bao gồm: lai tạo giống, nhân vô tính, gây đột biến và chuyển
Trang 18gen Trong đó, ứng dụng chuyển gen là một chiến lược quan trọng trong việc tạo ra sản phẩm nông nghiệp chất lượng cao với ưu điểm là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và hiệu quả, tìm ra dòng giống năng suất cao, khả năng chống bệnh [34]
2.2 Auxin và vai trò của auxin trong quá trình tạo mô sẹo
Auxin là một hợp chất tương đối đơn giản, có nhân indole, có công thức nguyên là: C10H9O2N, tên của nó là axit β-indol-acetic
Axit
β-Indolyaxetic(AIA) Axit 2,4
dicloro-phenoxiaxetic(2,4D)
Axit naphtylaxetic(αANA)
α-Auxin là một loại hormon kích thích sinh trưởng, có tác dụng sinh lý đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt
Auxin được tổng hợp sử dụng trong nuôi cấy mô nhưng nó dễ bị biến tính trong môi trường nuôi cấy và nhanh chóng thoái biến ở trong mô Tuy nhiên những
đặc tính này có thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây, (cùng với cytokinin) sau khi
cảm ứng hình thành mô sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phôi khi hàm lượng của
nó trong mô giảm dần Chính vì vậy auxin dùng trong nuôi cấy mô là dạng auxin tổng hợp, không phải auxin tự nhiên, nên độ bền cao hơn Auxin thường được sử dung phối hợp với các chất điều hoà sinh trưởng khác để kích thích sự phát sinh hình thái trực tiếp (sự tạo rễ của cành giâm in vitro) và trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chồi Tuy nhiên, tuỳ theo mục đích thí nghiệm mà người ta có thể sử dụng các hợp chất giống auxin khác được tổng hợp và nó có những hoạt động hơi khác với auxin như: NAA, 2,4D, picloram…
2.2.1 NAA (Naphtylaxetic axit)
Công thức hóa học: C12H9O2Na; phân tử khối: 186,21 g/mol
Trang 19NAA là chất kích thích sinh trưởng được tổng hợp bằng con đường hóa học, thuộc nhóm chất auxin nên nó có đầy đủ các tính chất và tác dụng sinh lý của nhóm chất này Đặc biệt là khả năng cảm ứng, tạo mô sẹo
2.2.2 2,4-D (axit 2,4,5-dichlorophenoxyacetic)
Công thức hóa học: C8H6Cl 12O3; phân tử khối: 221,04 g/mol
2,4-D là một chất kích thích sinh trưởng ở thực vật, thường được sử dụng phối hợp với cytokinin để cảm ứng tạo mô sẹo và huyền phù tế bào và nó sẽ được thay thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái IBA và NAA là loại auxin thích hợp trong nuôi cấy chồi
2.2.3 Picloram ( axit 4 - amino-3, 5,6 - trichloro-2 – Acid)
Công thức hóa học: C6H3Cl 3N 2O2; phân tử khối: 241,46 g/mol
Picloram thường được sử dụng để cảm ứng và duy trì mô sẹo hoặc huyền phù tế bào của các loại cây lá rộng hoặc để cảm ứng sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi Picloram có hiệu quả đối với biên độ các kiểu di truyền rộng hơn Chỉ trong một số rất ít trường hợp cá biệt, loại auxin này được dùng trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy đoạn thân và được dùng với nồng độ rất thấp (0,012 ÷ 0,4 µM) khi phối hợp với một cytokinin
2.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen sắn
2.3.1 Trên thế giới
Bản chất của cây trồng chuyển gen là sự biến đổi vật chất di truyền, tiếp nhận thêm những gen mới, kết quả là xuất hiện những tính trạng mới dưới sự tác
động của môi trường Thông qua phương pháp chuyển gen cho phép nhà chọn
giống tích hợp được các gen có lợi vào một loài, một sản phẩm cây trồng nhất định,
đây là phương thức tạo ra các tính trạng ưu việt mới cho cây trồng trên cơ sở kết
hợp với phương pháp chọn tạo truyền thống [34]
Chuyển gen sắn đã và đang được nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới Việc
đưa các gen quan tâm vào cây sắn đã và đang tạo ra những cây sắn mang đặc điểm
nông học quan tâm như khả năng kháng bệnh virut, kháng côn trùng, cải thiện thành phần dinh dưỡng, biến đổi và tăng chuyển hóa tổng hợp tinh bột, giảm hàm lượng cyanogenic trong củ sắn [30]
Trên thế giới các công trình nghiên cứu về chuyển gen sắn được tiến hành từ những năm cuối thế kỉ 20 [28] Năm 1996, những quy trình chuyển gen sắn đầu tiên
đã được báo cáo độc lập cùng một lúc bởi hai nhóm nghiên cứu khác nhau Li và
cộng sự đã chuyển gen vào lá mầm sắn sau đó tạo chồi, từ chồi đã được chuyển gen
Trang 20tái sinh thành cây hoàn chỉnh [22] Trong quy trình chuyển gen của Schöpke, chuyển gen dựa trên việc thực hiện một quy trình để tạo ra các cụm tế bào được gọi
là mô sẹo phôi hóa, gen mục tiêu sẽ được chuyển vào mô sẹo phôi hóa, sau đó tái sinh chúng thành cây hoàn chỉnh từ phôi trưởng thành [31] Đây là một mốc quan trọng đánh dấu trong quá trình chọn tạo giống sắn bằng phương pháp phân tử Sau nhiều năm phát triển, công nghệ chuyển gen đã từng bước trưởng thành và tiến bộ
đáng kể , đã xác nhận được gen chức năng và giống chuyển gen
Trong chuyển gen, chuyển gen sắn thường chuyển gen trung gian nhờ vi
khuẩn agrobacterium hoặc dùng súng bắn gen Các mẫu thường sử dụng để chuyển
gen là lá mầm soma hoặc mô sẹo phôi hóa [24]
Trang 212.3.1.1 Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens được sử dụng như một vector tự nhiên để mang
các gen ngoại lai vào mô tế bào thực vật [6] Khi xâm nhiễm vào tế bào, chúng gắn
đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất
sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u (trường hợp A tumefaciens) Khả năng chuyển
gen này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật theo ý muốn [5, 26]
Với mục đích chung là làm tăng năng xuất và sản lượng sắn, rất nhiều các
công trình nghiên cứu chuyển gen sắn nhờ vi khuẩn A tumefaciens được công bố
thành công trong những năm gần đây như kháng virus [36], cải thiện hàm lượng tinh bột [35], giảm lượng cyanogen [33], kháng thuốc trừ cỏ [30], Cải thiện dựa trên những đặc điểm này sẽ là xu hướng chính trong chọn lọc giống sắn nhờ kỹ thuật sinh học phân tử trong tương lai [24] Năm 2004, một công trình nghiên cứu chuyển gen kháng virus khảm sắn (geminiviruses) đã được công bố Chellappan đã tiến hành tách chiết gen AC1 từ chính tác nhân gây bệnh là virus khảm sắn châu Phi Sau đó ông tiến hành chuyển gen này vào giống TMS60444 Giống sắn này sau khi được chuyển gen AC1 đã có khả năng kháng được geminiviruses[14] Sắn là cây trồng có hàm lượng cyanogen rất cao, thường thì chỉ có thể làm giảm hàm lượng sau khi chế biến, hiện nay cũng có thể giảm bằng cách ức chế tổng hợp cyanogen Năm 2007, Mayague đã công bố chuyển gen thành công giúp giảm hàm lượng độc tố cyanogen trong sắn bằng cách tăng thúc đẩy cyanogen bay hơi nhanh chóng [37] Bệnh khảm virus trên cây sắn rất phổ biến ở châu Phi gây ảnh hưởng không nhỏ tới năng xuất, chất lượng sắn Với mong muốn khắc phục tình trạng này, công trình nghiên cứu chuyển gen kháng với virus (geminiviruse) gây bệnh khảm trên sắn đã được tiến hành Vanderschuren đã chuyển gen có chứa cấu trúc kẹp tóc của RNAs Cấu trúc đã tạo một mối liên quan giữa sự biểu hiện của RNA nhỏ và khả năng miễn dịch với bệnh khảm virus Phương pháp này mở ra hướng phân lập virus với cấu trúc kẹp tóc bổ sung [36]
Trung tâm Nông nghiệp nhiệt đới quốc tế (CIAT) cũng đã tập trung nghiên
cứu chuyển gene vào sắn thông qua Agrobacterium tumefaciens Họ đã thực hiện
chuyển gen đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể như chuyển gen kháng côn trùng
Erinnyis ello trú ngụ trong cây sắn, và tạo ra các giống kháng được thuốc trừ cỏ như
Basta, gần đây họ đã nghiên cứu phát triển các giống sắn với thành phần tinh bột khác nhau [30] Năm 2006 các nhà khoa học Mỹ đã thành công trong việc chuyển
Trang 22gen glgC làm tăng khả năng tổng hợp tinh bột trong sắn [35] glgC là gen mã hóa
cho enzym ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) giúp tăng cường hoạt động tổng hợp tinh bột ở sắn Cây chuyển gen thể hiện gen glgC có AGPase hoạt động cao hơn 70% so với cây đối chứng khi khảo nghiệm trong điều kiện tối ưu cho các giống sắn khi không có vi khuẩn AGPase hoạt động [35]
Hiện nay, nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào nhưng chuyển gen
thông qua vi khuẩn A tumefaciens có nhiều ưu điểm như hiệu quả chuyển gen cao,
yêu cầu trang thiết bị đơn giản, số lượng bản sao thấp và ổn định ở thế hệ con cháu Do
đó, đây là phương pháp sử dụng rộng rãi nhất cho kỹ thuật di truyền sắn [24]
2.3.1.2 Chuyển gen thông qua nguồn nguyên liệu mô sẹo phôi hóa
Chuyển gen vào phôi soma gặp nhiều trở ngại và khó khăn đặc biệt là tần số cây con tái sinh thấp [11], tỉ lệ tạo thể khảm cao [31] Chuyển gen thông qua mô sẹo phôi hóa sẽ khắc phục được tình trạng này, hạn chế được thời gian công sức mà hiệu quả chuyển gen lại cao hơn [39]
Năm 1998, Gonzalez và cộng sự đã thành công trong việc chuyển gen vào
mô sẹo phôi hóa giống TMS 60444 [20], đánh dấu một bước tiến mới cho việc áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học trên đối tượng cây sắn Sau gần 5 năm phát triển kể từ khi phương pháp chuyển gen từ mô sẹo phôi hóa vào giống TMS60444
được giới thiệu, phương pháp chuyển gen qua Agrobacterium từ mô sẹo phôi hóa đã
được tiến hành thành công ở một số phòng thí nghiệm [24]
Phương pháp chuyển gen sắn từ mô sẹo phôi hóa ngày càng phổ biến, từ năm
2005 đã được sử dụng thường xuyên trong phòng thí nghiệm tạo sắn chuyển gen kháng virus khảm [11, 38] Năm 2009, quy trình chuyển gen vào cây sắn từ mô sẹo phôi hóa và tái sinh thành cây hoàn chỉnh của Bull và cộng sự đã cho thấy cụ thể các giai đoạn khác nhau trong quy trình, họ cũng đưa ra một số cải tiến góp phần hoàn thiện quy trình chuyển gen hiện nay [29]
Chuyển gen vào sắn nhờ vi khuẩn A tumefaciens từ mô sẹo phôi hóa, việc
chuyển gen trở lên dễ dàng do mô sẹo phôi hóa có thể tăng sinh tạo ra số lượng lớn trong thời gian ngắn Đặc biệt chuyển gen từ những tế bào đang phân chia nên khi biến nạp vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập vào tế bào thực vật nên hiệu quả chuyển gen sẽ cao hơn và khả năng tái sinh tạo cây hoàn chỉnh cũng cao hơn mô sẹo thông thường Vì vậy mà ngày nay phương pháp này được sử dụng rất phổ biến và thành công [39]
Trang 23Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc sử dụng các gen chức năng và kỹ thuật di truyền để giải quyết các vấn đề liên quan đến chọn tạo các giống sắn đóng một vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy trồng sắn và ứng dụng trên toàn thế giới Cho đến nay, cải thiện đặc điểm nông học của sắn đạt được bằng công nghệ biến đổi gen như kháng virus, cải thiện chất lượng dinh dưỡng, giảm lượng cyanogen, cải thiện sinh khối, tăng hàm lượng protein Cải thiện dựa trên những
đặc điểm này sẽ là xu hướng chính trong chọn lọc giống sắn nhờ kỹ thuật sinh học
phân tử trong tương lai [24]
2.3.2 Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, tình hình chuyển gen trên cây sắn mới ở giai đoạn bước đầu
Năm 2008, bước đầu biến nạp thành công gen Bar – gen kháng thuốc diệt cỏ
Phosphinonothricin (PPT) vào chồi non cây sắn bằng phương pháp bắn gen [1] Tỉ
lệ chồi non chuyển gen thu nhận được là 20% Chồi non sau khi được kiểm tra bằng
phương pháp PCR với mồi đặc hiệu cho thấy sự xuất hiện của gen bar trong các
mẫu DNA của bộ gen sắn [1] Tuy nhiên cần phải thực hiện thêm nhiều nghiên cứu khác như trồng thử nghiệm, lai phân tích tính trạng, quan sát…để cho ra một dòng sắn mới, hoàn chỉnh.Các trung tâm nghiên cứu lớn ở Việt Nam như: Viện Công nghệ sinh học, viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Di truyền Nông nghiệp… đã có những nghiên cứu ban đầu về nuôi cấy mô và chuyển gen trên cây sắn
Trang 24Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Giống sắn KM98 – 7 và giống TMS 60444
Hình 3.1 Cây sản trong ảng nghiảm
Vật liệu nghiên cứu: Chồi mọc ra từ mắt ngủ trên đoạn thân cây sắn
3.2 Môi trường nuôi cấy
Bảng 3.1 Các môi trảảng sả dảng trong quá trình nghiên cảu
STT Môi trường Hormone
Tạo mô sẹo
Trang 25- Parafilm, cling film
- Đầu lọc xi-lanh vô trùng (0.22 µm)
- Đầu côn vô trùng 1 ml
- Panh, dao, kéo, thìa xúc
- Buồng nuôi cây kiểm soát điều kiện môi trường (28°C, 16 giờ sáng/8 giờ tối)
- Bốc cấy vô trùng với đèn cồn
- Các muối đa lượng và vi lượng, các vitamins, đường, agar, các chất điều hòa
sinh trưởng, các kháng sinh, …vv
3.4 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ tế bào
thực vật thuộc viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
Thời gian tiến hành: 12/2013 đến 05/2014
3.5 Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo
- Nội dung 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của auxin (NAA, 2,4-D, picloram) tới khả năng tạo mô sẹo phôi hóa
3.6 Phương pháp nghiên cứu
Cách thức tiến hành:
Tạo vật liệu khởi đầu
Từ hom sắn ngoài thực nghiệm, trồng trên nền đất sẽ mọc ra các chồi, khi chồi dài khoảng 20 cm thì ngắt lấy chồi và tiến hành vào mẫu sau 2 tuần cấy chuyển sang môi trường MS
Trang 26Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS ở 280C, trong 2~4 tuần (đủ rễ, thân
Tạo mô sẹo và mô sẹo phôi hóa
Các mẫu được nuôi cấy trên môi trường CAM bắt đầu quá trình nghiên cứu
Tấo
mô sấo
14 ngày
14 ngày
Tấo
mô sấo phôi
Trang 27Hình 3.3 Sả đả khảo sát ảnh hảảng cảa NAA tải khả năng tảo mô sảo phôi hóa
Thí nghiệm cũng làm tương tự như vậy với 2,4D (nồng độ 0; 6; 8; 9; 10 mg/l) và picloram (nồng độ 0; 8; 9; 10; 12 mg/l)
Tương ứng bổ sung một trong 3 chất trên vào các môi trường với mục đích cuối cùng là tạo được mô sẹo phôi hóa phục vụ chuyển gen
Điều kiện nuôi cấy: Các đĩa nuôi cấy in vitro được đặt trong phòng nuôi cấy
với các điều kiện như sau:
Sau khi 14 ngày nuôi cấy, sử dụng kính hiển vi để chọn các callus tốt, cấy chuyển trên môi trường DKW có bổ sung NAA theo các công thức trong bố trí thí nghiệm Nuôi cấy ở 280C, trong 14 ngày
hóa
Cấy chuyấn