Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (mus musculus var albino) Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (mus musculus var albino) Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (mus musculus var albino) Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (mus musculus var albino)
Trang 1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC CÀN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIẾN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TĨT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC
KHAO SAT ANH HUONG CUA CAO CHIET NAM LINH CHI (Ganoderma lucidum) LEN TE BAO GOC THAN KINH
PHAN LAP TU NAO PHOI THAI CHUOT NHAT TRANG (Mus musculus var albino)
CAN BO HUGNG DAN SINH VIEN THUC HIEN
TS PHAM VAN PHUC NGUYEN THI MAI DAN
ThS TRUONG HAI NHUNG MSSV: 3082584
LOP: CNSH TT K34
Trang 2PHAN KY DUYET
CAN BO HUONG DAN SINH VIEN THUC HIEN
Pham Van Phuc Nguyén Thi Mai Dan
Cà ae
Trương Hải Nhung
XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỊNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
Trang 3LỜI CẢM TẠ Tơi xin gửi lời cám ơn chân thành đến:
Tiến sĩ Phạm Văn Phúc và Thạc sĩ Trương Hải Nhung đã định hướng cho tơi
thực hiện đề tài, truyền đạt kiến thức, và tận tình chí bảo cũng như theo dõi tiến trình
thí nghiệm
Chị Đinh Thị Hồng Nhung, bạn Lê Minh Dũng, Nguyễn Thùy Linh, Lâm Thái
Thành, cán bộ Phịng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế Bào Gốc - Đại học Khoa học tự nhiên — Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ cho tơi kiến thức và trang thiết bị cần thiết để thực hiện và hồn thành đề tài
Các anh chị cán bộ và các bạn sinh viên cùng làm việc trong Phịng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế Bào Gốc — Đại học Khoa học tự nhiên — Đại học Quốc
gia Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và động viên tơi
Trang 4TĨM LƯỢC
Các chứng rồi loạn hoặc các tổn thương thần kinh (Parkinson, Alzheimer, Huntington, chấn thương cột sống ) đã và đang trở thành một thách thức lớn đối với sức khỏe cộng đồng Các tồn thương này rất khĩ để chữa trị do hệ than kinh khơng thể
tạo ra các tế bào thân kinh mới, do đĩ yêu câu cấp thiết là phải cĩ một liệu pháp hữu
hiệu để điều trị các chứng bệnh này Các nghiên cứu gân đây đã hướng đến sử dụng tế bào gốc, cụ thể là tế bào gốc thân kinh, do các tế bào này cĩ khả năng tự làm mới và tiềm năng biệt hĩa thành các loại tế bào của hệ thân kinh để thay thế các tế bào đã mất đi trong não Tế bào gốc thần kinh được phân lập từ não phơi thai chuột 13.5-
15.5 ngày và nuơi cấy trong mơi trường DMEM/F12 khơng huyết thanh cĩ bổ sung
B27, N2, heparin, EGF va FGF o diéu kiện 37C, 5% CO; Các tế bào ứng viên sẽ được chứng mình tính gốc thơng qua phương pháp neurosphere, sự biểu hiện marker Soxl, CDI33, Nestin và được đánh giá khả năng biệt hĩa thanh astrocyte bằng marker GFAP Sau đĩ, những tế bào gốc này được khảo sát trong đĩa 96 giếng cĩ chứa cao chiết nắm Linh chỉ (Ganoderma lucidum) ở các nơng độ 100ug/ml, 300ug/ml, 1000ug/ml để đánh giá tác động của dược liệu lên sự tăng sinh và biệt hĩa của các tế bào gốc thần kinh Kết quả thu nhận và chứng mình đặc tinh của các tế bào ứng viên cho thấy tỉ lệ nuơi cấy tế bào thành cơng là 72%, thai ở giai đoạn 13.5-15.5 ngày cho hiệu quả nuơi cấy tốt nhất, các tế bào này đều cĩ khả năng hình thành
neurosphere, biéu hién marker Sox1, CD133, Nestin, cĩ khả năng biệt hĩa và biểu
hiện marker GFAP Ngồi ra, kết quả khảo sát ảnh hưởng của dược liệu lên tế bào gốc thần kinh cho thấy cao chiết với nỗng độ 500ug/ml cĩ tác dụng kích thích tế bào tăng sinh mạnh nhất so với các nơng độ cịn lại
Trang 5MỤC LỤC Trang PHAN KY DUYET LOI CAM TA TOM LUQC D0900 ST” .ÄA i I9):87 (0:87) ca vi I9):837 0:8.) 08000 vii CÁC TỪ VIẾT TẮTT .2 222222222ES222EEE1112222111122211112221111222111112221112 21111 xe ix CHƯƠNG 1 GIOI THIEU
Ban ố 1
1.2 Mục tiêu đề tài ¿25c L2 1221122212122 re 3 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2 22©22222222S£22EE22ESzczxxesrxeez 4 2.1 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc -:-22-©2++2++222ESEEESEEErerkrerrrrrrrrerrree 4
2.1.1 TrOnØ RưỚC - c1 22121121 112 12 12119 111 H1 TH HH HH HH nh 4
VI NT NO 41445) 4 2.2 TẾ bào gỐc : c2 E1 2110212112211211211111 11 T11 T1 11 H1 1n ờy 5
VNĐ) hiicciidầiầđầiaiaiẢỶÝÝ4Ả 5
2.2.2 Ứng dụng của tế bào gốc
2.3 Tế bào gốc thần kinh -: + ©©¿+Sk+E+E9EE22E192E127121101112112112111 21111 11.1.rxe 7 2.3.1 Khái niệm về tế bào gốc thần kinh ¿2-2 5£++k++E+2EE2EEtEEevrxrrrrerree 7
2.3.2 Đặc điểm của tế bào gốc thần kinh -:- 2 +¿+2++2x+2Ex2EEerkezrxrrxrerxee 7
2.3.3 Tế bào gốc thần kinh và sự phát triển của hệ thần kinh trung ương 9 2.3.4 Nguồn tế bào gốc thần kinh - 2 ©++22+++2++SEE+2EEESEEveEErrrrxrerrrrrrxee 10 2.3.4.1 Nguồn tế bào gốc thần kinh nội sinh . -2-©2¿©+++cv++zzxz+rsrcee 10
2.3.4.2 Nguồn tế bào gốc thần kinh ngoại sinh
Trang 6
2.3.5 Các yếu tố ảnh hướng đến tính tự làm mới và khả năng biệt hĩa của tế
9x08 8 11 2.3.5.1 Các yếu tố BON NORE ec eecccseessesssesssesssesscssssscssessseasecssesseessesssessecsseeseess 11
2.3.5.2 Céc yeu 6 BEN trON ge eeecscecsssssesssesssesssessecsssssecssesssssseessssseessesseesseesseeseees 12
2.3.6 Marker té bào gốc thần kinh và tế bào thần kinh trưởng thành 12 2.3.6.1 Các marker tế bào gốc thần kinh . -2-©+22++222+r2rxrerrrrsrxrsrrrcee 12
2.3.6.1.1 Nestin
2.3.6.1.2 SoxI and Sox2 9SRY-related HMG-box gene .- 13
V5 n9 K< “433D 13
2.3.6.2 Marker tế bào thần kinh trưởng thành 2- ¿+ s+xe+cx+xzsrxezrs 14
2.3.6.2.1 Tế bào thần kinh đệm ít nhánh (oligodendrocyte) . 14
P6 7n v5 ẻ 14 P5 9 ha ẦẦ 14
2.3.6.2.2 Tế bào hình sao (AS[TOCẲ€), HH TH HT HH TH HH rệt 14 2.3.6.2.2.1 GFAP (glial fibrillary acidic protein) - « «+ 14
2.3.6.3.2.2 A2BS aa"nnD 14
P60 on hố 15 2.3.6.2.3.1 PSA-NCAM (polysialylated neuronal cell adhesion
IIỌ€CỤ) 7 << c0 0101010111111311111 1111155885 21151111111 e 15 2.3.6.2.3.2 MAP-2 (microtubule-assoeciated protein 2) ‹ 15 2.3.7 Các phương pháp nuơi cấy tế bào gốc thần kinh . -¿¿c5sz5c5+2 15
2.3.7.1 Phương pháp nuơi cấy lớp đơn
2.3.7.2 Nuơi cấy neurosphere ¿- ¿+ +x+Ek£EEE9EE2E1221127122112111121e E10, 16 2.3.8 Các phương pháp đánh giá sự tăng sinh NSC ïn vifro - <~<<<<<<+ 17
2.3.8.1 Đếm tế bào bằng máy đếm tự động ¿- 52 ©c<ccxcscxccrrsrkerrk 17
2.3.8.2 Đo kích thước neuroSphere ¿- ¿+52 +2 £+E++££vEezsrekrrerrkrree 18 2.3.9 Các phương pháp chứng minh tế bào ứng viên là NSC . 18 2.3.9.1 Phân tích tính gốc thơng qua sự tạo tập đồn -¿©s++cs+52+ 18
Trang 7
2.3.9.2 Kha năng biệt hĩa thành các loại tế bào thần kinh - : 19
2.3.9.3 Sự biểu hiện marker của các tế bào gốc thần kinh và tế bào thần
kinh trưởng thành - - 6 6xx KT TT HH Hàn nh Hệ 20
b0 90) ng 3,11 21
2.4.1 Giới thiệu về nắm Linh chỉ -.2- 2s: 22+¿22S++2EEE22EE2EX2E2EE2EEeSEErrrrkrsrkx 21 2.4.2 Thành phần hĩa học của nắm Linh chỉ .-.2- 22 2 ¿2+2 +z£+£x£2££sz+e 22
2.4.2.1 Polysaccharide và peptidoglycan
, uc Go 23 2.4.3 Cơng dụng của nắm Linh chỉ đối với sức khỏe con người - 24
2.4.4 Ảnh hưởng của dịch chiết nắm Linh chỉ lên sự tăng sinh, biệt hĩa của
3.1 Phuong tién nghién COU oo 27
3.1.1 Thời gian và dia Gigm.o c.ccceccccscssssssssssssssesssessesssesssssscssessscsssssseesecssessecsseesees 27
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu ¿- ++S++EE2E19E12E122112112211021.211211 11.11 xe 27
3.1.3 Dụng cụ, thiết bị, hĩa chất sc©+e+Sk9E9E122E1221111112110211211 211 E1 c0, 27
3.1.3.1 DUM CU 27
3.1.3.2 THidt Di ooeccecceceecececsscseesseseesscssessesscssesuessessesessueseesusseessessessessesstssesseseeesees 28 3.1.3.3 HĩĨa chất ¿+ tt 2t 21221221211211211121211111111111111111111111 111 ce 28
3.2 Phương pháp nghiÊn CỨU c1 19119119 1 91 vn TH TH ng 31
3.2.1 Nội dung 1: Phân lập và nuơi cấy tế bào đơn từ não phơi thai chuột
nhat trang (Mus musculus var aÏbii0) 55:55 c25cc2cxcccvevscvrsrsrrrrvesres 32 3.2.1.1 Phương pháp phân lập và thu nhận tế bào đơn từ não phơi thai
lệ Gdidddủ 32 3.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền neurosphere -2- ¿2 +¿+++2x++zxzzs+2 33 3.2.2 Nội dung 2: Chứng minh tế bào ứng viên là NSC . 2- 2s ©5+¿ 34 3.2.2.1 Phương pháp 1: Đánh giá dựa trên khả năng tự làm mới của NSC 34 3.2.2.2 Phương pháp 2: Đánh giá sự biểu hiện marker của NSC 35
Trang 83.2.2.2.1 Danh gid sw biéu hién marker Sox] cia NSC bang phương
Phap RT-PCR 20 ceeccceceeeeessesseeseeeceeeneeeeeseeaeeseeeseesesieseeaseesees 35
3.2.2.2.2 Đánh giá sự biểu hiện marker CD133 của NSC bằng phương
pháp flow Cy{OIm€(TV ác cS St SH HH He, 36 3.2.2.2.3 Đánh giá sự biểu hiện marker Nestin của NSC bằng phương
pháp nhuộm hĩa mơ miễn dịch . - ¿2 ¿s5++x+z++x+z++z+zx 37
3.2.2.3 Phương pháp 3: Đánh giá khả năng biệt hĩa của NSC thành
astrocyte bằng phương pháp nhuộm hĩa mơ miễn dịch 38 3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát tác động kích thích tăng sinh tế bào của cao chiết
nấm Linh chỉ cc+++2EE+k++tttt211221112 E21 E1 re 39
3.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 2 2£ <SE2EEE2EE9212210212211211 221 21x 2.e2 40 CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THÁO LUẬN 2 -2:©25255222cSzscxxcsrxrcrrs 41
4.1 Kết qua phân lập và nuơi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột 41 4.1.1 Kết quả phân lập và nuơi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh ứng viên 41
4.1.2 Kết quả cấy chuyên té Da0 ccccccsssesssesssesssessesssessesssesssessecssessesssessssssesssesseees 44 4.2 Kết quả chứng minh tế bào ứng viên là tế bào gốc thần kinh
4.2.1 Kết quả đánh giá khả năng tự làm mới thơng qua sự hình thành
TI€UTOSDHTC SG 2C 119 1212121121191 01 012 1H Hà TH TH TT HH TH HH Hi 46 4.2.2 Kết quá đánh giá marker của tế bào ứng viên . ¿ -: 55:52 2ccscxzczs 48
4.2.2.1 Khả năng biểu hiện marker Sox! của tế bào ứng viên . ‹ - 48 4.2.2.2 Khả năng biểu hiện marker CD133 của tế bào ứng viên 49
4.2.2.3 Khả năng biểu hiện marker Nestin của tế bào ứng viên
4.2.2.4 Khả năng biệt hĩa thành tế bào và sự biểu hiện marker GFAP 51
4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nam Linh chỉ lên sự tăng sinh tế
BAO x0 8n PP - 53 CHUONG 5 KET LUAN VA KIEN NGHO o0 c.cccsscssscsssssssesssssesseessesssesseessecssees 57
5.1 Kết luận ¿5c St 1 1 121121121121121121121111 11.11 1111 11 11 11211 1 101211011 cu 57
5.1.1 Phân lập và nuơi cấy tế bào gốc thần kinh -: ¿©z+22z++cx+cc++ 57 5.1.2 Chứng minh tế bào ứng viên là NSC 2: 5¿©5+22x2x+vzx+szxeszee 57
Trang 9
5.1.3 Ảnh hưởng của cao chiết nắm Linh chỉ lên sự tăng sinh của NSC 57
5.2 Kiến nghị, ¿ 6-52 21 21221122122112212112111211011121111121111111112121 1 1x eerrey 57
IV )80)9009:7 9/804: cdàn 59
PHỤ LỤC
Phụ lục 1 Các primer dùng cho RT-PCR
Phụ Iuc 2 Kết quả khảo sát sự thay đối đường kính neurosphere sau 72 giờ Bảng 4.5 Đường kính và tỉ lệ gia tăng đường kính của neurosphere ở các nghiệm thức 1000ug/ml, 500ug/ml, 100ug/ml và đối chứng sau 72 giờ
Bảng 4.6 Đường kính của các neurosphere qua 72 giờ ở các nghiệm thức 1000ug/ml, 500ug/ml, 100ug/ml và đối chứng
Phụ lục 3 Kết quả xử lí thống kê
1 Kết quả thống kê mơ tá sự gia tăng đường kính neurosphere sau 72 giờ ở các nghiệm thức đối chứng, 100ug/ml, 500ug/ml và 1000ug/ml
2 Kết quả kiểm định T so sánh giá trị trung bình về tỉ lệ gia tăng đường kính của neurosphere sau 72 giờ ở hai nghiệm thức 100u:g/ml và 1000ug/ml
3 Kết quả kiểm định T so sánh giá trị trung bình về tỉ lệ gia tăng đường kính của neurosphere sau 72 giờ của nghiệm thức 500ug/ml so với đối chứng
4 Kết quả kiểm định T so sánh giá trị trung bình về tỉ lệ gia tăng đường kính của
neurosphere sau 72 giờ của nghiệm thức 1000ug/ml so với đối chứng
Trang 10DANH SÁCH BẢNG
Bang 3.1 Các hĩa chất cho phản ứng RT-PCR . 2¿5225222++2x2zxzzzvszxecrx 35 Bảng 3.2 Các nghiệm thức sử dụng đề đánh giá ảnh hưởng của dược liệu lên sự
tang sinh ctia NSC oo 38 Bang 4.1 Bảng tổng kết số lượng mẫu tế DAO NUOI CY o eceeeccccsesstesseesesstesseeseeseens 40
Bảng 4.2 Bảng tổng kết tuổi thai 5-5225 SE SE 9E122E19211971221112122212 211211 c0, 41
Bang 4.3 Ty Ié gia tang kich thudéc cua neurosphere sau 72 gid
Trang 11
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Ứng dụng của tế bào gốc trong điều trị rối loạn thần kinh .- 6 Hình 2.2 Vị trí vùng SVZ (subventricular zone) của não thất bên va SGZ
(subgranular zone) của vùng đổi hải mã 2-22¿©752222z+2cxzscsce2 8 Hình 2.3 Các vị trí thu nhan NSCs ở động vật cĩ VÚ - ¿+ 5< 6+ £+£+*£eeesxreee 9 Hình 2.4 Neurosphere biểu hiện nestin khi nhuộm với kháng thể kháng nestin
được đánh đấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 và FITC khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang đáo ngược - - 13 Hình 2.5 Các tế bào astrocyte biểu hiện GFAP khi nhuộm với kháng thể kháng
GFAP được đánh dấu bởi thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 và
rhođamine khi quan sát đưới kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược 15 Hình 2.6 Neurosphere - 6s 1k vn TH TH nh TH nh ni HT HH tế 17 Hình 2.7 Khả năng tự làm mới bằng cách hình thành neurosphere, khá năng biệt
hĩa thành các loại tế bào thần kinh (neuron, astrocyte, oligodendrocyte) của các tế bào gốc thần kinh và các yếu tố phiên mã (transcription factor) diéu hịa hai đặc tính này -¿©22+222+2cx+2Exxrtrrrsrrrerrrrrrkr 19 Hình 2.8 Ganoderma ÍUCÏCÏHHH «c1 1 1 11 11 1 91 11 11 HH Hàn Hit 21 Hình 3.1 Chuột nhắt trắng (Mus musculus var QIDIN0) ằàecSẶ S5 S‡S<kssceses 26 Hình 3.2 Quy trình thực hién thi nghi@m wee ec eeeseceeeeneeeteeneeeteeeeeeteeeeeeeeeneeeee 30 Hình 3.3 Các thao tác trong quy trình thu nhận tế bào đơn .: ::5++ 32 Hình 3.4 Chu kì nhiệt của phản ứng RT-PCR - «(6S SE seekrekeexek 35
Hình 4.1 Tế bào chết và bị nhiễm :2222c++ttEEEkEtrrtrrrrriiirrrree 40
Hình 4.2 Sự hình thành neurosphere từ mẫu nuơi cấy sơ cấp
Hình 4.3 TẾ bào biệt hĩa - 2-22 5£ ©5212 SE1921122121122112712112711211211211 211.1 c0, 44 Hình 4.4 Sự hình thành neurosphere sau khi cấy chuyễn -.2 ¿s+c5z5s+ 45
Hình 4.5 Sự hình thành neurosphere trong phương pháp neurosphere - 46 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR .- 2-2 +2 £+2E2Ext2EEvExzrxrrreee 48
Hinh 4.7 Dé thi 2D của tế bào biểu hin CD133 csccccsesssesseessesssesseessessessessseesesseees 49 Hình 4.8 Biểu đồ tần số của tế bào biểu hiện CD 133 2-2 2 ++cs+£x+rxerserx 49
Trang 12
Hình 4.9 Kết quả nhuộm nestin - 2-22 2£ S22 2EE+EE£2EEtEEEEEE22EEEEE22Ee2Eeerkerex 50 Hình 4.10 Kết quả nhuộm GFAP - 22 ©25¿ S222 2EE2EE22EE92EEEEX222122122212212221exe 52
Hình 4.11 Tỉ lệ gia tăng kích thước neurosphere sau 72 giờ ở các nghiệm thức 100ug/mI, 500ug/mL và 1000ug/ml so với nghiệm thức đối chứng 54 Hình 4.12 Tốc độ gia tăng kích thước neurosphere ở các nghiệm thức sau mỗi 24
Trang 13CÁC TỪ VIẾT TẮT
CNE: ciliary neutrophic factor CNS: central nervous system
CREB: cAMP response element-binding protein DMEM: Dulbecco’s modified eagle medium EGF: epidermal growth factor
ERK: extracellular receptor kinase
F3: fucose-containing polysaccharide fraction FBS: fetal bonvine serum
FGF-2: fibroblast growth factor 2 GalC: galactosylceramidase
GFAP: glial fibrillary acidic protein GLPG: Ganoderma lucidum proteoglycan
GLPP: Ganoderma lucidum protein-bound polysaccharide HMG box: high mobility group box
HSC: hematopoietic stem cell IL-1: interleukin 1B
IL-2: interleukin 2 IL-6: interleukin 6
iPSC: induced pluripotent stem cell JAK: Janus associated tyrosine kinase LIF: leukemia inhibitor factor
MAP-2: microtubule-associated protein 2 MAPK: mitogen activated protein kinase MBP: Myelin basic protein
Trang 14NSC: neural stem cell OSM: oncostatin M
PI3K: phosphoinositide-3 kinase
PSA-NCAM: polysialylayed neural cell adhesion molecule RMS: rostral migratory stream
SDF-1a1: stromal cell-derived factor lal SEZ: subendymal zone
SGV: subgranular zone
STAT: signal transducer and activator of transcription SVZ: subventricular zone
Trang 15CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU
8 BERR ko
1.1 Đặt vấn đề
Các bệnh về thần kinh là những rối loạn xảy ra ở não bộ, cột sống cũng như các
dây thần kinh trong cơ thể, gây ảnh hưởng đến khả năng vận động, nĩi, nhai nuốt, hít
thở, điều hịa cảm xúc, ghi nhớ và học tập của con người
Theo thống kê năm 2007 của WHO (World Health Organization), trên thế giới cĩ khoảng 1 tỉ người mắc phải các chứng rối loạn liên quan đến thần kinh, trong đĩ cĩ khoảng 50 triệu người mắc bệnh động kinh và 24 triệu bệnh nhân Alzheimer cũng như các chứng mắt trí khác, và cĩ khoảng 6.8 triệu ca tử vong mỗi năm được ghi nhận Vì vậy, các bệnh rồi loạn về thần kinh ngày nay được xem như một thách thức đối với sức khỏe cộng đồng Theo Rita Levi-Montalcini, một nhà thần kinh học người Ý đã đoạt giải Nobel y khoa năm 1986, đã khẳng định rằng: “Các chứng rối loạn thần kinh đang trở thành một gánh nặng đáng kế đối với nhiều quốc gia với tỉ lệ dân số mắc các căn bệnh này đang trên đà gia tăng trong vịng 65 năm qua” Hiện nay, cĩ hơn 600 chứng rối loạn thần kinh ghi nhận, trong đĩ Parkinson (Parkinson's disease) và Alzheimer (Alzheimer’s disease) 14 m6t trong nhig bệnh thần kinh được biết đến phổ biến nhất
Alzheimer là một chứng bệnh liên quan đến sự thối hĩa não bộ, bao gồm Sự suy giảm cĩ tiến triển về khả năng ghi nhớ, suy nghĩ, nhận thức, tính tốn, ngơn ngữ, học tập và phán đốn Theo thống kê của WHO (2001) thì cĩ khoảng 37 triệu người trên thế giới mắc chứng mắt trí nhớ mà nguyên nhân chủ yếu là Alzheimer, trong đĩ bao gồm 5% nam giới và 6% nữ giới ở độ tuổi trên 60 Con số này được ước tính là sẽ gia tăng nhanh chĩng trong vịng 20 năm tới
Tương tự, Parkinson cũng là một dạng thối hĩa của hệ thần kinh trung ương, thường gặp ở người lớn tuổi, cĩ thể gây tàn phế và làm giảm chất lượng cuộc sống Tuổi thọ trung bình của người Việt Nam ngày càng được cải thiện do đĩ Parkinson cũng trở thành một vấn đề sức khỏe đáng được lưu ý nhiều hơn Theo thống kê, hiện nay trên thế giới cĩ 6 triệu người mắc bệnh Parkinson, trong đĩ cĩ khoảng 1 triệu trường hợp được ghi nhận tại Mỹ và 130 nghìn trường hợp tại Anh Tuy nhiên, vẫn chưa cĩ con số thống kê cụ thể nào về Parkinson tại Việt Nam Bệnh Parkinson
Trang 16đây, nhiều trường hợp mắc bệnh Parkinson trong độ tuổi 20-40 và đưới 20 cũng được ghi nhận Trước đây, các nhà y học sử đụng thuốc trong điều trị các chứng bệnh này nhằm kìm hãm các triệu chứng của bệnh, nhưng việc sử dụng thuốc cĩ thể gây ra một số tác dụng phụ khơng mong muốn Ngồi ra, một số phương pháp phẫu thuật cũng
được sử dụng nhưng khơng điều trị được tận gốc và bệnh nhân phải được tái phẫu
thuật nhiều lần
Nhiều nghiên cứu gần đây đã hướng đến việc sử dụng liệu pháp tế bào gốc trong
điều trị các bệnh liên quan đến thần kinh, đáng lưu ý là Parkinson, do hiệu quả cao
trong việc điều trị Trong phương pháp này, các tế bào gốc sẽ được biệt hĩa thành tế bào thần kinh cĩ khả năng sản sinh chất dẫn truyền thần kinh dopamine và chúng sẽ được cấy ghép vào não bộ của bệnh nhân Tuy nhiên, các tế bào gốc này hiện diện rất ít ở các mơ và cơ quan trưởng thành, đo đĩ việc sử dụng các tế bào gốc phơi thai được quan tâm nhiều hơn Các tế bào gốc cĩ nguồn gốc từ thai cĩ tính đa năng cao hơn nên khả năng tăng sinh mạnh hơn so với các tế bào gốc trưởng thành Ngồi ra, chúng cịn cĩ thể sinh trưởng và biệt hĩa thành các loại tế bào khác nhau dễ dàng trong quá trình nuơi cay in vitro nên cĩ tiềm năng ứng dụng lớn trong việc cấy ghép cũng như điều trị các căn bệnh liên quan đến rối loạn thần kinh Nhiều nghiên cứu đã và đang xác định
các điều kiện nuơi cấy in viro nhằm kích thích sự biệt hĩa các tế bào gốc này thành
kiểu tế bào mong muốn Một số nghiên cứu gần đây cho rằng nguồn NSC nội sinh thụ động trong việc di cư đến các khu vực riêng biệt trong não bộ, vì vậy mà việc sử dụng các yếu tố ngoại sinh để biệt hĩa tế bào cĩ thể giúp khắc phục các hạn chế của nguồn NSC nội sinh, đồng thời kích thích khả năng tái tạo của các tế bào gốc này bằng các tín hiệu thích hợp (Reimers et al., 2008) Vì vậy, đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh
hưởng của cao chiết nắm Linh chỉ (Ganoderma lucidum) lên tế bào gốc phân lập từ
Trang 171.2 Mục tiêu đề tài
- Phân lập và nuơi cấy được tế bào gốc thần kinh từ não phơi thai chuột nhất
trắng (Mus musculus var albino)
- Xác định được nồng độ cao chiết nấm Linh chỉ (Ganoderma lucidum) cĩ tác
Trang 18CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
8 BERR ko
2.1 Tình hình nghiên cứu tế bào gốc
2.1.1 Trong nước
Theo tài liệu của Bộ Y tế, những nghiên cứu đầu tiên về tế bào gốc tại Việt Nam
được tiến hành khá sớm, cách đây khoảng 20 năm Năm 1995, Bệnh viện Truyền máu
- Huyết học TP.HCM đã tiến hành ca ghép tế bào gốc tạo máu đầu tiên để điều trị cho
bệnh nhân bị bệnh máu
Ngồi ra cịn cĩ các nghiên cứu về nuơi cấy tinh tử, tế bào sợi và tế bào sừng ứng dụng trong điều trị các bệnh nan y, nghiên cứu về tế bảo gốc và nhân bản vơ tính trên động vật (sao la, bị, chuột nhất) Theo báo cáo về hiện trạng nghiên cứu, ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam của hai tác giả Phạm Mạnh Hùng và Lê Văn Đơng: “Nghiên cứu tế bào gốc tại Việt Nam hình thành 3 máng lớn là: tạo nguồn tế bào gốc (phân lập
và lưu trữ), biệt hĩa tế bào gốc thành các tế bào chuyên biệt và ứng dụng tế bào gốc”
Theo tiến sĩ Lê Văn Đơng, biệt hĩa tế bào gốc thành một số loại tế bào giống như tế bào cơ tim, tế bào thần kinh, tế bao da, té bao xương, sụn, mỡ tại Việt Nam được coi là hướng nghiên cứu song hành với các nước trên thế giới, nhưng các kết quả chúng ta đạt được cịn tương đối khiêm tốn
Mặc dù vậy, những nghiên cứu về tế bào gốc tại Việt Nam, theo đánh giá của một số chuyên gia trong lĩnh vực này, vẫn cịn khá tản mác và chưa cĩ tính liên thơng cao Nước ta hiện cũng đang tiến hành một số nghiên cứu về tế bào gốc cĩ tính quan trọng cho việc giúp đỡ các bệnh nhân - phục vụ nghiên cứu y học như, tách tế bào gốc
từ màng dây rốn, tế bào gĩc biệt hĩa thành tế bào cơ tim, tế bào gốc điều trị bệnh đái
tháo đường; tế bào gốc nuơi thành tế bào gan, tế bào gốc điều trị bỏng - tái tạo răng, giác mạc từ tế bào gĩc
2.1.2 Thế giới
Trang 19tiên tiến Nguồn tế bào gốc cho ghép được lấy từ xương, từ máu ngoại vi, gần đây là từ máu cuống rốn và màng lĩt cuống rốn Việc cấy ghép tế bào gốc là một phương pháp được ứng dụng trong điều trị các bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyén, u lympho va cho
hiệu quá cao nhất ở bệnh nhân trẻ và trẻ em Gần đây, việc nghiên cứu và ứng dụng tế
bào gốc trong y học khơng chỉ dừng lại ở việc ghép tế bào gốc tạo máu mà cịn được nghiên cứu và phát triển ở rất nhiều chuyên khoa khác như: mắt, tim mạch, bỏng, da
Gần đây nhất là giải Nobel Y học 2012 về phát hiện khả năng tái lập trình tế bao
trưởng thành thành tế bào giống tế bào gốc phơi, gọi là tế bảo gốc vạn năng nuơi cay
(IPSC), được xem là bước đột phá của con người với hy vọng “cải lão hồn đồng” của John Gurdon (sinh năm 1933, người Anh) và Shinya Yamanaka (sinh năm 1962, người
Nhật)
2.2 Tế bào gốc
2.2.1 Định nghĩa
Tế bào gốc là các tế bào khơng hoặc chưa chuyên hĩa trong mơ sống, chúng cĩ khả năng trở thành các tế bào chuyên hĩa với các chức năng sinh lý đặc trưng Trong
điều kiện im vivo hoặc in viro, mỗi tế bào gốc cĩ thể trải qua phân bào nguyên nhiễm
thơng qua tính tự làm mới để tạo ra nhiều tế bào gốc mới hoặc biệt hĩa thành nhiều
loại tế bào khác nhau, vì vậy một tế bào gốc địi hỏi phải ít nhất phải cĩ hai đặc tính như sau:
e Khả năng tự làm mới: tế bào cĩ khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kỳ phân
bào nguyên nhiễm mà vẫn duy trì trạng thái khơng biệt hĩa
e Khả năng biệt hĩa : tế bào cĩ khá năng biệt hĩa thành các loại tế bào cĩ chức năng
2.2.2 Ứng dụng của tế bào gốc
Trang 20Tế bảo gốc Tế bào gốc thần kinh Tể bào gốc
phơi từ các mơ khác
CNS
Túi phơi trưởng thàni CNS :
phơi thai Tủy xương Cuống rốn
Tiên biệt hĩa và/hoặc biến đổi di truyền
Sử dụng tế bào gốc
nội sinh
Hình 2.1 Ứng dụng của tế bào gốc trong điều trị rối loạn thần kinh Các tế
bào gốc được phân lập và cấy ghép vào não hoặc cột sống của bệnh nhân bằng phương pháp tiền biệt hĩa hoặc biến đối di truyền trong điều kiện nuơi cAy in vitro để tạo thành các neuron và các loại tế bào thần kinh đệm (Lindvall và
Kokaia, 2006)
e Nghiên cứu về sự phân chia bất thường của tế bào: Trong một số các trường hợp như ung thư, khiếm khuyết bẩm sinh đều cĩ liên quan đến sự phân chia khơng bình thường của tế bào hoặc các rối loạn trong điều hịa trạng thái hoạt động của tế bào Vì vậy, việc hiểu rõ bản chất tế bào gĩc, cơ chế điều hịa của chúng ở cấp độ di truyền và phân tử sẽ giúp cho việc điều trị bệnh được hiệu quả hơn
e Thử nghiệm thuốc: các tế bào gốc cũng được sử dụng trong thử nghiệm các loại
thuốc mới bằng cách biệt hĩa chúng thành các loại tế bào đích đặc trưng mà thuốc cĩ
Trang 21hình thử nghiệm thuốc in vitro, nho d6 co thé rút ngắn thời gian tìm ra các hĩa chất thích hợp đề điều trị bệnh
e Liệu pháp tế bào: ngồi những ứng dụng nêu trên, tế bào gốc cịn được sử dụng trong các liệu pháp tế bào bằng cấy ghép tế bào gốc vào cơ thê bệnh nhân, sau đĩ kích thích chúng biệt hĩa in vivo để thay thế các mơ bệnh hoặc tổn thương hoặc biệt hĩa chúng thành tế bào mong muốn rồi mới cấy ghép
Nằm trong phạm vi ứng dụng này, các tế bào gốc thần kinh được sử dụng như một nguồn tế bào dồi dào dé thay thế hoặc bảo vệ thần kinh trong điều trị một số rối loạn ảnh hưởng đến não bộ và cột sống như Parkinson, Alzheimer, Huntington, đột quy, chắn thương cột sống (Lindvall và Kokaia, 2006)
2.3 Tế bào gốc thần kinh
2.3.1 Khái niệm về tế bào gĩc thần kinh
Tế bào gốc thần kinh (NSC) là những tế bào đa năng cĩ khả năng tăng sinh và tự
làm mới được phân lập từ não và tủy sống mà khơng liên quan đến các giai đoạn phát
triển, cĩ thể là thời kỳ phơi thai, bào thai hoặc thời kỳ trưởng thành và cĩ thé biệt hĩa
thành các thành phần của hệ thần kinh, bao gồm neuron, tế bào hình sao và tế bào thần kinh đệm ít nhánh (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2009)
2.3.2 Đặc điểm của tế bào gốc thần kinh
Trong não của động vật cĩ vú trưởng thành, NSC (hay các tế bào giống NSC)
tham gia vào quá trình phát triển của hệ thần kinh dưới các điều kiện sinh lí tại một số
vùng đặc biệt như vùng SVZ (subventricular zone) của não thất bên, vùng SGZ (subgranular zone) của vùng hồi hải mã NSC cịn được tìm thấy ở nếp nhăn vỏ não, mau khitu giác, vùng chất xám, vùng chất đen và tủy sống Chúng khơng chỉ hiện diện ở hệ thần kinh của động vật cĩ vú ở giai đoạn đang phát triển mà cả ở những động vật đã trưởng thành, bao gồm cả con người Chúng cũng cĩ thể bắt nguồn từ những tế bào gốc nguyên thủy ở phơi Ngồi ra, NSC cũng tham gia vào quá trình sửa chữa hư hại cho hệ thần kinh trung ương Do các neuron của hệ thần kinh khơng cĩ khả năng phân chia nên NSC được sử dụng để biệt hĩa và thay thế các neuron bị mất đi hoặc các neuron bị tổn thương và trong một số trường hợp thì chúng cũng cĩ thể được biệt hĩa
thành tế bào hình sao Quá trình biệt hĩa của các NSC cĩ thể được kích thích bởi các
Trang 22vùng SVZ đọc theo các dịng di cư rostral (RMS) trong não bộ, và vùng này bao gồm các cấu trúc tương tự tủy xương với các tế bào màng não thất và tế bào hình sao Các tế bào màng não thất và tế bào hình sao này sẽ hình thành nên các ống thần kinh đệm Trong ống thần kinh đệm, các tế bào hình sao sẽ cung cấp sự chống đỡ cho các nguyên bào thần kinh cũng như đĩng vai trị trong việc cách ly các tín hiệu điện và hĩa học từ các tế bào lân cận Ngồi ra, các tế bào hình sao cịn là tiền chất cơ bản cho sự khuếch đại nhanh chĩng của neuron Các nguyên bào thần kinh cĩ thể liên kết thành các chuỗi chặt chẽ và di chuyên đến các vùng bị tổn thương để sửa chữa hoặc thay thế các tế bào
thần kinh bị tồn hại Não thất (màu xanh) Gian tế bào gốc \ Mặt trước (màu đỏ) Mặt trước của lớp cắt
Nếp cuốn não trợ cine Não thất bên
Não thất bên Ơ sVZ (subventricular zone) svz Sree (subventricula! ii md Tone)
Hình 2.2 Vị tri ving SVZ (subventricular zone) cia nao that bén va SGZ
(subgranular zone) cla ving đồi hải mã (Nguon: http://aboutcancer.com, 14/01/2013)
Trang 23
Giai đoạn phơi Giai đoạn trưởng thành -
1 Hơi hải mã
2 Vỏ não
3 Não trước 4 Tủy sống
5 Mào thân kinh (hệ thân kinh ngoại vi) 6 Võng mạc
7 SVZ
8 Hành khứu giác
9 Biểu mơ mũi (hệ thân kinh ngoại vi) 1
Hình 2.3 Các vị trí thu nhận NSC ở động vật cĩ vú (Nguon: http://www.nature.com, 15/01/2013)
Ở chuột, các tế bào NSC bắt đầu tồn tại ở trạng thái tự làm mới kế từ khi phơi
được 8.5 ngày tuổi đến khi trưởng thành Chu kì nguyên phân của các tế bào này phụ thuộc vào từng giai đoạn phát triển của sinh vật, cĩ thể là từ 7-10 giờ ở giai đoạn thai,
18 giờ trong thời kì thai muộn và vài ngày ở cơ thể trưởng thành
2.3.3 Tế bào gốc thần kinh và sự phát triển của hệ thần kinh trung ương
Trong quá trình phát triển của phơi thì quá trình biệt hĩa của các NSC là một sự
kiện trung tâm Sự phát sinh hình thái, quá trình tổ chức các tế bào và mơ là yếu tố đầu
tiên cần cho sự biệt hĩa của các tế bào Sự kiện trung tâm ở giai đoạn phơi vị là sắp
xếp lại các phơi bào đề hình thành nên ngoại bì, trung bì và nội bì Một phần ngoại bì
vùng lưng được biệt hĩa thành tế bào thần kinh, vùng này của phơi được gọi là tắm
thần kinh Quá trình hình thành phơi thần kinh sẽ tạo nên ống thần kinh và ở giai đoạn
này, phơi sẽ được gọi là phơi thần kinh Ong thần kinh sau đĩ sẽ phát triển thành não
và tủy sống
Sự phát sinh thần kinh trong não thai bắt đầu bằng sự cảm ứng các tế bào biểu mơ thần kinh, hình thành các tắm mơ thần kinh ở phơi chuột bảy ngày rưỡi, sau đĩ chúng sẽ gấp lại hình thành nên các ống thần kinh (Gotz và Huttner, 2005) Hai đầu ống thần kinh sẽ tiếp xúc với mặt trên cùng của não thất Ban đầu, các tế bào biểu mơ thần kinh phân chia đồng đều tại bề mặt của não thất để tăng sinh quan thé tế bào gốc
Tuy nhiên, tại một thời điểm nhất định thì các tế bào này bắt đầu phân chia khơng
đồng đều nữa, tạo ra một tế bào gốc vẫn được giữ nguyên ở vùng não thất và một tế bào khác di chuyển tỏa tia hướng ra ngồi (Haubensak et al., 2004) Các tế bào này
Trang 24
chịu trách nhiệm cho sự phát sinh thần kinh trong ống thần kinh và sau đĩ chúng hình
thành nên các tế bào thần kinh đệm tỏa tia Các tế bào thần kinh đệm tỏa tia này được
hình thành ở phơi chuột khoảng chín ngày rưỡi
2.3.4 Nguồn tế bào gốc thần kinh
2.3.4.1 Nguồn tế bào gốc thần kinh nội sinh
Nguồn sản sinh các tế bào gốc thần kinh nội sinh ở vùng SVZ rất thích hợp cho việc cấy ghép trên não động vật (Alvarez-Buylla và Gareia-Verdugo, 2002; Alvarez- Buylla và Lim, 2004), tuy nhiên việc sử dụng các tế bảo nảy trong điều trị các bệnh về thần kinh gặp nhiều trở ngại về số lượng tế bào sẵn cĩ và khống cách chúng phải di chuyển đến các vùng bị tổn thương Hơn nữa, nếu các chứng rối loạn thần kinh là đo di truyền thì các tính trạng này sẽ được di truyền cho các tế bào gốc thần kinh nội sinh và làm cho các liệu pháp chữa trị khơng cịn chính xác nữa
Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các neuron mới sẽ được sản sinh ở vùng SVZ sau các cơn đột quy (Arvidsson et al., 2002; Kuge et al., 2009), và các tế bào mới này di chuyển, xâm nhập vào các mơ bị tơn thương Ngồi ra cịn cĩ nhiều nghiên cứu khác chứng minh quá trình phát sinh thần kinh sẽ cĩ xu hướng gia tăng sau các cơn đột quy do thiếu máu (Parent et al., 2002; Yagita et al., 2001; Zhang et al., 2009) Các nghiên cứ này đưa ra nhiều chứng cứ về khả năng tái tạo của não bộ sau tổn thương, tuy nhiên tiềm năng này chưa được điều hịa một cách cĩ hiệu quả
Việc điều khiến sự phát sinh thần kinh nội sinh và sự di chuyên của các tế bào gốc đến các vùng tồn thương là rất quan trọng trong các liệu pháp tế bào gốc Các yếu tố hĩa học và thể dịch được sản sinh ra ở các vùng ton thuong cua co thé sinh vat bénh đĩng vai trị như các tín hiệu thu hút NSC (Ekdahl et al., 2009) Một ví dụ điển hình là HGF và SDF-Iơl là các tín hiệu hĩa học mạnh mẽ cĩ khả năng thu hút và ảnh hưởng đến sự tăng sinh của NSC (Lan et al., 2008; Takeuchi et al., 2007)
2.3.4.2 Nguồn tế bào gốc thần kinh ngoại sinh
Trang 25hệ thần kinh ở cơ thể trưởng thành (Alvarez-Buylla và Garcia-Verdugo, 2002; Alvarez-Buylla va Lim,2004; Feldmann va Mattern, 2006; Sanai et al 2004) Tuy nhiên, những nguồn tế bào nĩi trên cần phải được nghiên cứu sâu hơn để cĩ thể ứng dụng trong điều trị các bệnh thối hĩa và rối loạn thần kinh
2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính tự làm mới và khả năng biệt hĩa của tế bào
gốc thần kinh
Một trong những đặc tính quan trọng của tế bào gốc vạn năng ở động vật cĩ vú là tính tự làm mới và tính vạn năng Các yếu tố điều khiển sự duy trì trạng thái khơng biệt hĩa của các tế bào gốc phơi được xếp và hai nhĩm chính là các yếu tố bên ngồi và các yếu tố bên trong (Phan Kim Ngọc và Pham Văn Phúc, 2007)
2.3.5.1 Các yếu tố bên ngồi
EGF và FGF-2 được cho là ứng viên mitogen cua NSC do chúng cĩ khả năng kích thích sự tự làm mới của NSC và duy trì đặc tính cĩ thể cấy chuyền liên tuc in vitro cua cdc té bao này trong thời gian dài
Gần đây, người ta thay rang sy hoat héa cdc IGF-1 receptor boi EGF va FGF-2
cần cho sự phân chia tế bào gốc Tuy nhiên, chu kỳ nguyên phân của NSC rất chậm (trung bình là 15 ngày ở vùng thể vân), hoặc ngừng trệ Qua đĩ, khơng thể giải thích rằng sự tăng sinh hồn tồn chỉ bởi các mitogen, những nhân tố khác cũng rất cần để duy trì NSC trưởng thành ở trạng thái khơng biệt hĩa
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng LIF (Leukimia inhibitor factor — nhân tố
ức chế bạch cầu) là một protein thuộc họ cytokine kiểu Interleukin 6 (IL-6) cĩ khả năng kích thích tế bào thơng qua cdc receptor gp130, gp130 sẽ kết hợp với receptor đặc hiệu (LIF-R) ở dang heterodimer Ngoai LIF, con hai nhan tố khác là oncostatin M (OSM) va ciliary neutrophic factor (CNF) cĩ thể sử dụng trong CM
Trang 26Hơn nữa, ngồi việc hoạt hĩa STAT3, LIF cũng cảm ứng các tín hiệu khác như làm hoạt hĩa ERK (extracellular receptor kinase) Khi ERK hoạt hĩa sẽ kích thích sự biệt hĩa, do đĩ sự cân bằng giữ trạng thái hoạt hĩa STAT3 và ERK sẽ quyết định số phận của tế bào: hoặc phân chia bình thường, hoặc biệt hĩa Rõ ràng, các tín hiệu kiểm sốt sự hoạt hĩa ERK cĩ vai trị quan trọng nhằm duy trì trạng thái khơng biệt hĩa Sự
ức chế PI3K (phosphoinositide-3 kinase) đã dẫn đến sự biệt hĩa của tế bào mES Con
đường tín hiệu PI3K cũng được cảm ứng bởi LIF và sự biệt hĩa như là kết quả của sự gia tăng các ERK hoạt hĩa
Ngồi vai trị duy trì tế bào mES khỏi trạng thái khơng biệt hĩa, LIF cũng cần thiết cho sự phát triển của hệ thần kinh trung ương (CNS - central nervous system),
đặc biệt là sự sống sĩt của các tế bào thần kinh chuyên biệt (như các tế bào thần kinh
vận động, các tế bào thần kinh đệm ít nhánh và sự biệt hĩa thành tế bào thần kinh hình
Sao)
2.3.5.2 Các yếu tố bên trong
Ngồi các nhân tố bên ngồi, các nhân tố nội sinh cũng liên quan đến sự tự làm mới của các NSC Các tế bào gốc ở nhiều mơ khác nhau (như HSC và NSC) cĩ chung một vài cơ chế tự 1am mdi, chang hạn như các NSC, các tế bào gốc biểu gia tăng tự làm mới của tế bào gốc, duy trì trạng thái khơng biệt hĩa Bằng cách phân tích các tín hiệu biểu hiện tăng, liên quan đến sự điều hịa biểu hiện Musashi1, người ta hy vọng sẽ làm sáng tỏ cơ chế sự tự làm mới của các tế bào gốc này
Ngồi ra, nhân tố ức chế phiên mã nhĩm polycomb #zi/ cần thiết cho sự duy trì các tế bào gốc sau khi sinh, cũng như sự tự làm mới của các NSC và tế bào gốc mào thần kinh (neural erest stem cell - NCSC) Đĩ cĩ thể là cơ chế chung điều hịa sự tự làm mới và duy trì kiểu tế bào gốc Hơn nữa, các phân tích tạo dịng chỉ tiết cho thấy, Bmil cần cho sự tự làm mới của NSC, NCSC và khơng cần cho sự tăng sinh của tế
bào tiền thân thần kinh từ dạ dày, ruột và não trước Bmil cĩ thể tồn tại độc lập với
các cơ chế làm mới và tăng sinh của tế bào thần kinh trong hệ thần kinh trung ương và hệ thần kinh ngoại vi
Trang 27Nestin là một dạng sợi trung gian với domain xoắn alpha, hiện diện trong khung xương của tế bào Nestin biểu hiện trong các tế bào gốc hay tiền thân của hệ thần kinh trung ương, khi các tế bào thần kinh đã biệt hĩa dần, gene này được điều hịa giảm và cĩ thể được thay thế bởi các protein khác Dường như tất cả các tế bào gốc thần kinh
tăng sinh sẽ biểu hiện nestin Trong điều kién in vitro va in vivo cĩ thể sử đụng kháng
thé đơn dịng và đa dịng dé đánh đấu nestin rất hiệu quả
Hình 2.4 Neurosphere biểu hiện nestin khi nhuộm với kháng thể kháng
nestin được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 va FITC
khi quan sát dưới kính hién vi huỳnh quang đảo ngược (Nguồn: hup-/vww.uni-kiel.de
13/12/2012)
2.3.6.1.2 Sox1 and Sox2 9SRY-related HMG-box gene
Yếu tố Sox1 và Sox2 cĩ domain gắn vào DNA gọi là HMG box (High mobility
group box) Chúng gắn vào DNA thơng qua các gốc lớn của DNA một cách chuyên biệt nRNA của Sox1 và Sox2 biểu hiện trong các tế bào ở giai đoạn sớm nhất của quá trình hình thành thần kinh Ngồi ra, hai protein này là các marker quan trọng được sử
dụng chuyên biệt để phân loại các tế bào tiền thân thần kinh
2.3.6.1.3 CD133
CDI33 là một marker khá pho bién trong việc nhận diện các tế bào gốc từ nhiều loại mơ khác nhau trong cơ thể, bao gồm cả các tế bào cơ và tế bào tạo máu Sự biểu hiện của CD133 cũng đã được chứng minh trên các tế bào gốc thần kinh cĩ nguồn gốc từ phơi thai cũng như các tế bào biểu mơ thần kinh Ngồi ra, các tế bào ung thư như nguyên u bào võng mạc, tế bào bạch cầu và u bào não cũng biểu hiện CD133, vi vay
Trang 28
mà nĩ được sử dụng để nhận diện nhiều quần thể tế bào sốc khác nhau (CosKun et al.,
2007)
2.3.6.2 Marker tế bào thần kinh trưởng thành
2.3.6.2.1 Tế bào thần kinh đệm ít nhánh (oligodendrocyte)
2.3.6.2.1.1 A2B5
Kháng nguyên A2B5 là một loại ganglioside epitope được biểu hiện trong các tế bào biểu mơ tuyến ức, tế bào tiền thân oligodendrocyte và các tế bào thần kinh nội sinh Ngồi ra, A2B5 cũng được biểu hiện trội trong các mơ ở phơi và động vật sơ sinh, tuy nhiên chúng cũng được tìm thấy ở vùng SVZ trong não trưởng thành, vì vậy kháng nguyên này được sử dụng như marker để phát hiện các tế bào oligodendrocyte
2.3.6.2.1.2 O4
Tương tự như A2B5, O4 là một loại kháng nguyên bề mặt được biểu hiện ở các
tế bào tiền thân oligodendrocyte Day là loại marker chuyên biệt đầu tiên được sử dụng trong việc nhận diện cdc dong tế bào oligodendrocyte của hệ thần kinh trung ương
Ngồi ra, GalC (galactosylceramidase) và MBP (myelin basic protein) là hai loại marker cũng được sử dụng để nhận diện pre-myelinating oligodendroctye và myelinating oligodendrocyte
2.3.6.2.2 Té bao hinh sao (astrocyte)
2.3.6.2.2.1 GFAP (glial fibrillary acidic protein)
GFAP là một loại sợi trung gian được biểu hiện trong nhiều loại tế bào của hệ thần kinh trung ương, bao gồm cả astrocyte và các tế bào biểu mơ thần kinh Protein này cĩ vai trị trong việc duy trì cấu trúc, hình dạng và chức năng của khung xương astrocyte Ngồi ra, GFAP cịn liên quan đến quá trình truyền tín hiệu giữa các tế bào cũng như việc thực hiện chức năng của hàng rào máu-não GFAP được chứng minh là cĩ vai trị quan trọng trong quá trình nguyên phân của tế bào bằng cách điều hịa hệ vi sợi của tế bào, vì vậy mà hàm lượng GFAP đã được phosphoryl hĩa tăng lên đáng kể khi các tế bào trải qua giai đoạn phân chia
2.3.6.3.2.2 A2B5
Trang 29hiện A2B5, trong khi astrocyte kiểu một lại khơng cĩ loại kháng thể này trên bề mặt tế bào
Hình 2.5 Các tế bào astrocyte biểu hiện GEAP khi nhuộm với kháng thế
kháng GFAP được đánh dấu bởi thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 và rhodamine khi quan sát dưới kính hiến vi huỳnh quang đảo ngược
(Nguon: http:/a.abcam.com, 13/12/2012) 2.3.6.2.3 Neuron
2.3.6.2.3.1 PSA-NCAM (polysialylated neuronal cell adhesion molecule) PSA-NCAM là một loại glycoprotein được biểu hiện trội ở não đang phát triển, đĩng vai trị quan trọng trong sự liên kết giữa các tế bào, sự phát triển của sợi trục, duy trì tính linh hoạt của các synapse Vì vậy, PSA-NCAM được sử dụng như marker để nhận biết sự phát triển và đi cư của các neuron cũng như quá trình hình thành synapse ở não động vật cĩ xương sống
2.3.6.2.3.2 MAP-2 (microtubule-associated protein 2)
MAP-2 là một loại protein hiện diện trong bộ khung xương của neuron, giúp duy trì hình dạng và rất cần thiết cho sự phát triển của các neuron Protein này giúp 6n định hệ thống các vi sợi của tế bào bằng cách tạo liên kết giữa các vi sợi và sợi trung gian
Trong neuron, MAP-2 tồn tại ở 3 dạng đồng phân: MAP-2a, MAP-2b, MAP-2c và tất
cả các dạng protein này đều do cùng một gene mã hĩa 2.3.7 Các phương pháp nuơi cấy tế bào gốc thần kinh
Trong nuơi cấy tế bào gốc thần kinh, việc sử dụng mơi trường DMEM/FI2 sẽ hiệu quả hơn so với khi sử dụng DMEM Mơi trường căn bản DMEM/F12 được phát
Trang 30
triển ở nồng độ tối ưu các thành phần cịn thiếu trong mơi trường DMEM, bao gồm: alanine, asparagine, cysteine, glutamate, proline va B12 Do té bào gốc thần kinh cần một nồng độ đường cao dé phat triển nên cần bổ sung thêm một số hĩa chất cho quá trình chuyển hĩa như putrescin, progesterone, transferring, insulin, muối selenium và
được gọi chung là yếu tố bỗổ sung N2 Mơi trường DMEM/FI12 két hop FGF, EGF,
B27 và N2 cĩ tác dụng lên sự phát triển và tăng sinh của các tế bào thần kinh sau khi
nguyên phân Tuy nhiên, sự kết hợp B27 với DMEM/FI2 cịn tồn tại nhiều vấn đề như
làm giảm đáng kể dưỡng chất từ mơi trường để cung cấp cho tế bào gốc thần kinh và sinh ra nhĩm chất gây tổn thương thần kinh (excytotoxin) trong mơi trường Excytotoxin là các amino acid phản ứng với các thụ thể chuyên biệt trong não gây kích thích quá mức dẫn truyền thần kinh trong não, dẫn đến sự chết của các tế bào thần kinh
2.3.7.1 Phương pháp nuơi cấy lớp đơn
Trong phương pháp nuơi cấy lớp đơn, poly-L-lysine hoặc poly-L-lysine kết hợp laminin, fibronectin hoặc polyornithine được sử dụng như các co chat dé phủ lên dụng cụ nuơi cấy Đây là phương pháp nhằm tạo ra điều kiện vi mơi trường tương tự như trong não đề chúng cĩ thê sĩng và phát triển và các protein dùng bao phủ đĩa nuơi cấy thường là các protein chuyên biệt cho sự bám dính của các tế bào tại vi mơi trường não Khi bám dính vào dụng cụ nuơi cấy, sự hiện diện của các mitogen (EGF, FGF) sẽ làm cho các NSC duy trì trạng thái tăng sinh mà khơng biệt hĩa Tuy nhiên, theo nhiều tác giả thì hạn chế của phương pháp này là khĩ giữ cho tế bào khơng biệt hĩa khi nuơi cấy trong thời gian dài
2.3.7.2 Nuơi cấy neurosphere
Để cĩ thể phân lập và tăng sinh các tế bào NSC, Reynolds và Weiss (1992) đã
Trang 31khi đĩ các tế bào ở lớp ngồi của neurosphere sẽ bắt đầu biệt hĩa Kỹ thuật này cho phép hình thành các neurosphere thứ cấp từ sự phân tách của các neurosphere ban đầu, kiểm tra và đánh giá khả năng tự làm mới lâu đài và biệt hĩa của các tế bào thành ba dạng tế bào thần kinh chủ yếu (Gritti et al., 1995, 1996; Marshall et al., 2007; Reynolds va Weiss, 1996; Reynolds et al., 1992) Nhung đối với các nhĩm tế bào khác nhau, điều kiện nuơi cấy cũng phải khác nhau, do đĩ kỹ thuật này địi hỏi phải cĩ sự đồng nhất về điều kiện cũng như phương pháp nuơi cấy (Chaichana et al., 2006) Ngồi ra, các nhĩm tê bào khác nhau sẽ cĩ các marker kiêu hình khác nhau
(a) (b)
Hình 2.6 Neurosphere (a) Neurosphere 6 trang thai lo lirng va c6 dang trịn
đều, rắn chắc (b) Neurosphere cĩ các tế bào ở lớp ngồi cùng đã bắt đầu biệt hĩa (Nguơn: htup:/jcssdb.jp, 21/12/2012 và htIp:/awww.nrc-cnrc.ge.ca,, 21/12/2012)
2.3.8 Các phương pháp đánh giá sự tăng sinh NSC in vitro
Để biết được tế bào cĩ tăng sinh trong diều kiện nuơi cay in vitro hay khong,
nhiều phương pháp được sử dụng để xác định số lượng tế bào qua từng thời kì nuơi
cấy Trong đa số phương pháp, các tế bào cần được tách thành tế bào đơn đề cĩ kết quả chính xác
2.3.8.1 Đếm tế bào bằng máy đếm tự động
Để tránh các sai số do thao tác của người thực hiện, các máy đếm tế bào tự động đã được chế tạo Mẫu chứa tế bào được cho vào dung dịch nạp mẫu, sau đĩ đặt vào buồng đếm của máy Trong buồng đếm, dung dịch điện phân yếu chứa tế bào được cho
đi qua một lỗ nhỏ Một dịng điện sẽ chạy qua lỗ và các điện cực đặt ở hai phía lỗ sẽ đo
điện trở của dịng điện Do tế bào khơng cĩ tính dẫn điện hoặc dẫn điện yếu hơn dung
Trang 32
dịch điện phân nên khi tế bào đi qua lỗ thì điện trở lại tăng lên (hoặc độ dẫn điện giảm) va té bao duoc đếm và hiển thị trên máy
2.3.8.2 Đo kích thước neurosphere
Đây là phương pháp xác định số lượng tế bào chỉ áp dụng cho các tế bào được nuơi cấy bằng phương pháp neurosphere Với một khối neurosphere hình cầu, số lượng tế bào cĩ trong neurosphere tỉ lệ với thể tích sphere Bằng cách xác định kích
thước đường kính của sphere dưới kính hiển vi cĩ thể tính được số lượng tế bào trong sphere thơng qua kích thước của nĩ Kích thước của neurosphere ảnh hưởng quan
trọng đến khá năng sống của tế bào và sự chuyển hĩa của NSC như vận chuyển chất
dinh dưỡng từ từ giảm dần cùng với sự gia tăng kích thước của sphere, do đĩ cĩ thé
dẫn tới việc hình thành các tế bào chết bên trong neurosphere Kích thước của sphere là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự tăng trưởng của tế bào bên trong sphere
Theo một nghiên cứu của Schumacher (2003), số lượng tế bào cĩ thể được tính từ kích thước tương ứng của đường kính neurosphere bằng cơng thức (1), trong đĩ R là bán kính neurosphere và r(C1) và r(C2) là hai bán kính của tế bào và r(C2) > r(CT)
, #x.(R@œ))”
Số lượng tế bào — = 2 (RS)
3
eee) ạ0
2.3.9 Các phương pháp chứng minh tế bào ứng viên là NSC 2.3.9.1 Phân tích tính gốc thơng qua sự tạo tập đồn
Phương pháp này được xem như tiêu chuẩn để xác định tính gốc của tế bào gốc nĩi chung và tế bào gốc thần kinh nĩi riêng Phương pháp này dựa trên khả năng phát triển thành tập đồn của các tế bào gốc, trong khi đĩ các tế bào đã biệt hĩa lại khơng cĩ khả năng này Một nhĩm tế bào trong đĩ bao gồm cả tế bào gốc thần kinh sẽ được
nuơi trong mơi trường lỏng khơng huyết thanh cé bé sung EGF, FGF-2, B27, N2,
insulin, transferring, serin và progesteron Trong mơi trường chọn lọc này, chỉ cĩ các
tế bào gốc thần kinh mới phát triển tốt và hình thành các khối tế bào từ các tế bào đơn
Trang 33Các tế bào gốc thần kinh được thu nhận từ các neurosphere khi được nuơi trên mơi trường DMEM/F12 cĩ bổ sung B27, N2, heparin, insulin, FBS 10% (Fetal bonvine serum) và loại bỏ các yếu tố tăng trưởng EGF, FGF trong bình Roux cĩ tráng poly-L-lysine thì chúng sẽ bám và biệt hĩa thành tat ca các loại tế bào của hệ thần kinh như neuron, tế bào hình sao (astrocyte) và tế bào thần kinh đệm ít nhánh (oligodendrocyte) z A ® Tinh gốc ⁄@ Tự làm mới i @ (HES1,5/SOX2/HMGA2/BMI-1/ yee Tang sinh Mh (HES1,5/SOXB1/BMI-1/Gli1,2,3/ ID2/4/OLIG2) Ức chế biệt hĩa (HES1,5/SOXB1/REST/ID4/HESRI,2) ( Tính đa sO Biệt hĩa sớm (MASH1/PHOX2A/NGN1/PAX6/SOX1)
KH v8 NĨ Biệt hĩa giai đoạn cuối
Z (e9.PAX2/PAX6/NGN3)
® ® ©
Hình 2.7 Khả năng tự làm mới bằng cách hình thành neurosphere, khả năng biệt hĩa thành các loại tế bào thần kinh (neuron, astrocyte, oligodendrocyte) của các tế bào gốc thần kinh và các yếu tố phiên mã (transcription factor) điều hịa hai dac tinh nay (Ahmed et al., 2009)
2.3.9.2 Kha nang biét hĩa thành các loại tế bào thần kinh
Các tế bào gốc thần kinh được thu nhận từ các neurosphere khi được nuơi trên mơi trường DMEM/FI2 cĩ bổ sung B27, N2, heparin, insulin, FBS 10% (Fetal bonvine serum) và loại bỏ các yếu tố tăng trưởng EGF, FGF trong bình Roux cĩ tráng
poly-L-lysine thì chúng sẽ bám và biệt hĩa thành tất cả các loại tế bào của hệ thần kinh
Trang 34
như neuron, tế bào hình sao (astrocyte) và tế bào thần kinh đệm ít nhánh (oligodendrocyte)
2.3.9.3 Sự biếu hiện marker của các tế bào gốc thần kinh và tế bào thần kinh
trưởng thành
Các tế bào gốc thần kinh biểu hiện dương tính với marker nestin, một loại sợi trung gian hiện diện trong cấu trúc khung xương của chúng Các tế bào này cịn dương
tính với CD133 và Sox1 Ngồi ra, do các tế bào gốc thần kinh cĩ khả năng biệt hĩa thành các loại tế bào của hệ thần kinh, chăng hạn như các tế bào hình sao lại cĩ biểu
hiện dương tính với marker GFAP, cịn đối với neuron thì lại biểu hiện dương tính với
MAP2 nên cĩ thể dùng các marker phân tử để nhận biết các tế bào này Phương pháp
phổ biến là sử dụng phan img RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) vi cac cap mỗi đặc hiệu nhằm khuếch đại các gene biểu hiện chuyên biệt trong từng loại tế bào Ngồi ra cịn sử đụng phương pháp nhuộm hĩa mơ miễn dịch và flowcytometry để nhận diện quần thể các tế bào này
se RT-PCR là kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong việc nhận diện RNA Tuy nhiên, khác với real-time polymerase chain reaction (qPCR), RT-PCR được dùng để nhận điện sự biểu hiện của gene thơng qua cDNA, trong khi đĩ qDNA lại được sử dụng để định lượng DNA thơng qua các đoạn mỗi được đánh dấu huỳnh quang Trong kỹ thuật RT-PCR, các gene sẽ được nhân lên thơng qua hai bước: sao mã ngược từ RNA thành cDNA nho enzyme reverse transcriptase và khuếch đại các cDNA bang phan tng PCR
e Phương pháp hĩa mơ miễn dịch (immonocytochemistry — ICC) là phương pháp
kết hợp phán ứng miễn dịch và hố chất đề làm hiện rõ các kháng nguyên hiện diện
trong mơ (bào tương, màng tế bào, nhân) Vì kháng nguyên khơng thể quan sát hình thái được nên người ta phải xác định vị trí của nĩ trên tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hĩa học
Trang 35trúc bên trong, kích thước và hình đạng của tế bào Ánh sáng được phân tán và bức xạ từ các tế bào sẽ được ghi nhận đưới dạng xung điện bởi bộ dị quang học Kỹ thuật này cho phép phân tích một số lượng lớn tế bào trong thời gian ngắn, cĩ thể lên đến 1000
tế bào mỗi giây 2.4 Nắm Linh chỉ
2.4.1 Giới thiệu về nắm Linh chi
Nấm Linh chỉ cĩ tên khoa học là Œanoderma lueidum, thuộc họ nắm
Lim (Ganodermataceae) Nắm Linh chi cịn cĩ những tên khác như tiên thảo, nắm trường thọ, vạn niên nhung
Họ nắm Ganodermataceae bao gồm 322 lồi đại diện (Foroutan và Vaidya, 2007) phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Linh chỉ thường cĩ 6 loại màu sắc khác nhau: Thanh chỉ (màu xanh), Hồng chi ( màu hồng, cịn gọi là Xích chỉ), Đơn chi, Hồng chi ( màu vàng, cịn gọi là Kim chị),
Bạch chi ( màu trắng, cịn gọi là Ngọc chị), Hắc chỉ
Hinh 2.8 Ganoderma lucidum
mau den, con ỌI là Hu én chi › Tử chi ( màu tím g y\ 2
(Nguon: hitp://www.birkmeds.com, ngay
là loại thường được dùng nhất 15/01/2013)
Phần quả thể của nấm Linh chi được đùng rộng rãi trong y học cơ truyền Trung
Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam từ lâu đời (Kleinwatcher et al., 2001) Ngồi
ra, nắm Linh chỉ cịn được sử dụng làm thức ăn bồ sung trong chăn nuơi do nĩ cĩ thể tạo thành nhiều hợp chất như steroid, cardia glycoside, resin va amino acid (Ogbe et al., 2009) Nhiéu hoat tinh sinh hoc quan trọng được phát hiện trên các chủng nam khac nhau, cu thé nhu Garnoderma lucidum cé hoat tinh gây độc tế bào (Min et al., 2000) và kháng virus (El-Mekkawy et al., 1998), Ganoderma colossum cé tinh khang viêm, gây độc tế bào (Kleinwatcher et al., 2001) và kháng khuan, Ganoderma applanatum thê hiện hoạt tính kháng khuẩn và ức chế aldose reductase (Lee et al., 2006), Ganoderma concinna gay cam tmg sy chết của tế bào HL-60 (Gonzalez et al., 2002) va Ganoderma pfeifferi co hoạt tính kháng khuẩn (Mothana et al., 2000)
Trang 36
2.4.2 Thành phần hĩa học của nắm Linh chỉ
Nắm Linh chỉ được biết đến như những sinh vật tiềm năng cĩ khả năng sản xuất triterpenoid và trên 130 hợp chất khác
Theo Viện nghiên cứu tỉnh Quảng Đơng, thành phần hĩa học của nắm Linh chỉ
hoang đại cĩ: nước 12 - 13%, lignin 13 - 14%, hợp chất cĩ nitơ 1.6 — 2.1%, hợp chat
phenol 0.08 — 0.1%, tro 0.022%, cellulose 54 - 56%, chất béo 1.9 - 2%, chất khử 4 -
5%, hop chat steroit 0.14 — 0.16% Cĩ tài liệu cho biết trong nắm Linh chỉ cĩ 0.3 —
0.4% ergosterol (CogH44O)
Thanh phần chủ yếu trong nam Linh chỉ bao gồm:
- Hợp chất đường đa: arabinogalactane, beta-D-glucane; ganoderane A, B - Triterpene: ganoderic acid A, B, C, D, F, H, K, M, R, S va Y
- Ganodermadiol, ganodosterone, oleic acid
- Protein: Ling Zhi-8, glycoproteine (lactine), GLP (garnoderma lucidum peptide) cé hoat tinh chống oxy hĩa và bảo vệ gan và ganodermin, một protein cĩ khả năng kháng nấm Ngồi ra Ling Zhi-§ cịn đĩng vai trị như một mitogen trong điều kién in vitro
- Khoang chat: Se, Ge, K, Mg, Fe, Mn, Zn, Ca, Be, Cu, Ag, Al, Na Germanium cĩ liên quan chặt chẽ với hiệu quả lưu thơng khí huyết, tăng cường vận chuyển oxy vào mơ, đặc biệt là giảm bớt đau đớn cho bệnh nhân ung thư giai đoạn cuối Sử dụng với liều lượng thấp thì germanium cịn cĩ khả năng kháng u, chống oxy hĩa và các nhân tổ gây đột biến (Kolesnikova et al., 1997)
- Triterpene của nắm Linh chỉ cĩ tác dụng chống viêm sưng, giảm lượng mỡ thừa trong máu, hạ huyết áp và báo vệ tốt cho gan (tác dụng này được củng cĩ bởi ganodosterone) Một số kiểm chứng cho thấy nấm Linh chi cĩ dụng chống bệnh xơ gan, làm giảm chất collagen trong gan, điều hịa lại hoạt động trong tế bào gan
Trang 37Linh chi Trong bào tử nắm Linh chi cịn chứa các chuỗi acid béo mạch dài giúp chống lại sự hình thành các khối u (Fukuzawa et al., 2008)
Polysaccharides, peptidoglycans, và triterpenes là thành phần chủ yếu cĩ hoạt tinh sinh ly cua Ganoderma lucidum (Boh et al., 2007; Zhou et al., 2007)
2.4.2.1 Polysaccharide va peptidoglycan
Nhiều loại polysaccharide đã được chiết xuất từ quả thé, bào tử và sợi của nắm Linh chi Polysaccharide từ nam G.lucidum duoc ghi nhận là cĩ hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm khả năng chống viêm, giảm glucose huyết, kháng loét, kháng ung bứu và kích thích hệ miễn dịch (Mivazaki và Nishijima, 1981; Tomoda et al., 1986; Bao et
al., 2001) do kích thich té bao tiét ra IL-1P, IL-2 va IL-6 Phân tích cấu trúc các
polysaccharide nay cho thay glucose 1a loai đường chính trong cấu trúc của chất này (Bao et al., 2001; Wang et al., 2002) Tuy nhién, Ganodema lucidum polysaccharide 1a nhiing heteropolymer va c6 thé chira xylose, mannose, galactose va fucose voi nhiéu
cấu hình khác nhau, bao gồm các nhĩm thế 1-3, 1-4 va 1-68 và ơ-D (hoặc L) (Lee et
al., 1999; Bao et al., 2002) Cấu trúc phân nhánh và tính tan cĩ ảnh hưởng đến hoạt tính kháng ung bứu của các polysaccharide này (Bao et al., 2001; Zhang et al., 2001)
Nhiều peptidoglycan cĩ hoạt tính sinh học cũng được chiết xuất từ G.lucidum, bao gồm G.lucidum proteoglycan v6i hoat tính kháng virus, các hợp chất điều hịa
miễn dịch, GLPP và F3
2.4.2.2 Triterpene
Trang 38ganoderiol và ganodermic acid Triterpene trong G.lucidum tao nên vị đắng và là hợp chất cĩ lợi cho sức khỏe, chẳng hạn như làm giảm hàm lượng lipid và chống oxi hĩa 2.4.3 Cơng dụng của nấm Lảnh chỉ đối với sức khỏe con người
Nam Linh chi là một được liệu mà con người từ xa xưa đã biết dùng làm thuốc Trong "Thần nơng bản thảo", Linh chỉ được xếp vào loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm; trong "Bản thảo cương mục", Linh chi được coi là loại thuốc quý, cĩ tác dụng bảo can, giải độc, cường tâm, cường phế, kiện não, tiêu đờm, lợi niệu, ích vị Gần đây các nhà khoa học Trung Quốc và Nhật Bản phát hiện nắm Linh chi cịn cĩ tác dụng phịng chống ung thư, chống lão hĩa làm tăng tuổi thọ Ngày nay người ta biết trong nắm Linh chỉ cĩ germanium giúp tế bào hấp thụ oxy tốt hơn; polysaccharide làm tăng sự miễn dịch trong cơ thể, làm mạnh gan, diệt tế bào ung thư; acid ganodermic chống dị ứng, chống viêm
Điều trị trên lâm sàng thì nắm Linh chỉ cĩ những cơng dụng như sau:
- Chống oxy hĩa, khử gốc tự do giúp cơ thể chống lão hĩa và các bệnh tật do cơ
thể lão hĩa, kéo dài tuổi thọ
- Nâng cao khả năng sản xuất các kháng thể nội sinh chống ung thư, chống các virus gây bệnh như viêm gan siêu vi B, cảm lạnh và cả HIV
- Chống các yếu tố gây stress như lo âu, trầm cảm, thời thiết nĩng lạnh thất thường, chuyển múi giờ, phụ nữ trong thời kỳ mãn kinh, người suy nhược thần kinh
- Bảo vệ cơ thể chống ảnh hưởng của các tia xạ khi xạ trị ung thư, chụp điện quang, làm việc thường xuyên với máy tính, tiếp xúc nhiều với lị vi sĩng
- Chống độc: giúp cơ thể thải loại nhanh các chất độc vơ cơ và hữu cơ do ăn uống, tiếp xúc, hít thở, các độc tố do ký sinh trùng, vi trùng gây bệnh trong cơ thẻ, các bệnh suy gan, suy thận
- Giảm cholesterol, chống xơ vữa mạch máu và các biến chứng như đau thất ngực, nhồi máu cơ tim, điều hịa và ổn định huyết ap
Trang 39Nắm Linh chỉ từ lâu được sử dụng như chất xoa diu than kinh trong điều tri
ching bén chén, mat ngủ, và dịch chiết Linh chỉ cũng đã được chứng minh là cĩ tác
dụng an thần Ngồi ra, thành phan triterpenoid trong nấm Linh chỉ cĩ tác đụng tương
tự như NGF (nhân tố tăng trưởng thần kinh) và BDNF (nhân tổ dinh dưỡng thần kinh)
cũng như tăng cường khả năng sống sĩt của các neuron trong điều kién in vitro Tuy nhiên, các polysaccharide trong nắm Linh chỉ lại cĩ thể cảm ứng hoạt hĩa MAPK và sự biệt hĩa của các tế bào neuron ở chuột
2.4.4 Ảnh hướng của dịch chiết nắm Linh chỉ lên sự tăng sinh, biệt hĩa của tế bào
Trong một nghiên cứu của More et al (2012), các tế bào PCI2 (pheochromocytoma cell) khi được xử lý với dịch chiết nắm Linh chỉ ở nồng độ 50 và 100mg/ml đã hình thành nên các kiểu hình neuron bao gồm sự nén chặt của phần thân tế bào và sự kéo dài của các sợi trục Quan trọng hơn, dịch chiết nắm cịn cĩ tác dụng bảo vệ các neuron khỏi sự chết của tế bào do NGF (nerve growth factor) gây ra Đặc tinh nay 1a do su hoat hoa MAPK (Mitogen activated protein kinase) va CREB (CAMP response element-binding protein), hai nhân tố quan trọng trong điều hịa sinh trưởng và biệt hĩa của các tế bào PC12 Kết quả này cũng được chứng minh bởi một nghiên cứu tương tự trước đĩ của Cheung et al (2000)
Ngồi ra, một số thanh phan polysaccharide chiết xuất từ Œ.lwcidum cũng được
chứng minh là cĩ ảnh hưởng đến sự tăng sinh và biệt hĩa của dịng tế bào bạch cầu
đơn nhân ở người, U937 Trong điều kiện mơi trường nuơi cấy cĩ sự hiện diện của PSG thì sự sinh trưởng của các tế bào U937 sẽ bị ức chế và chúng sẽ được cảm ứng biệt hĩa thành các đại thực bào hoặc bạch cầu đơn nhân cĩ chức năng thực bào và tạo nên các superoxide nội bào (Lieu et al., 1992)
F3 (Fucose-containing polysaccharide fraction) được chiết xuất từ nắm Linh chỉ Nhật (Reishi) cũng được ghi nhận là kích thích q trình tăng sinh của các tế bào ở lá
lách và sự biểu hiện của các cytokine
Trang 40CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
CB RRB RE tị 3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm Thời gian: từ 12/2012 đến 04/2013
Địa điểm: Phịng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc — Đại học khoa học tự nhiên — Đại học Quốc gia TP.HCM
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu
Tế bào gốc từ não phơi thai chuột nhat tring (Mus musculus var albino) Chudt khỏe mạnh và sạch bệnh trong giai đoạn mang thai 13.5-15.5 ngày được cung cấp bởi
Viện Pasteur - Thành phố Hồ Chí Minh Chuột được nuơi trong điều kiện sạch tại
phịng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc thuộc trường Đại học Khoa
học tự nhiên — Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
Hình 3.1 Chuột nhat trang (Mus musculus var albino) (Ngay 11/01/2013)
3.1.3 Dung cu, thiết bị, hĩa chất
3.1.3.1 Dụng cụ
- Binh Roux 25cm? (Nunc, Dan Mach)
- Micropipette 10-100u1, 100-1000u1 (Nychiro, Nhat Ban)
- Pipette Pasteur (Assistant, Duc)
- Becher 50ml, 100ml (Schott, Ditc)
- Đĩa nuơi cấy tế bào 6 giếng, 24 giếng va 96 giéng (Costar, Hoa Ky) - Mang loc v6 trùng 0.2um (Minisart, Hoa Ky)
- Màng lọc tế bào 70um (Minisart, Hoa Kỳ)