Đánh giá khả năng chống oxi hóa và chống viêm của dịch chiết nấm linh chi ganoderma lucidum

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXI HOÁ VÀ CHỐNG VIÊM CỦA DỊCH CHIẾT NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM Chủ trì đề tài: Th.s Tạ Bích Thuận Cán tham gia: CN Nguyễn Thanh Hương CN Nguyễn Thuỳ Trang Đ Ạ I H Ọ C Q U Ô C G IA H A N Ọ I TRUNG TÂM THÒNG TIN THƯ VIỀN Hà Nội - 0 Báo cáo tóm tắt: a Tên đề tài: Đánh giá khả chống oxi hoá chống viêm dịch chiết nấm Linh chi Ganoderma lucidum M ã số: b Chủ trì đề tài: Q T - - 34 Ths Tạ Bích Thuận c Các cán tham gia CN Nguyễn Thanh Hương CN Nguyễn Thuỳ Trang d Mục tiêu nội dung nghiên cứu: Mục tiêu: Đánh giá khả chống viêm động vật thực nghiệm, chống oxi hoá đối tượng vi sinh vật động vật thực nghiệm nấm Linh chi Ganoderma ỉucidum Nội dung: - Đánh giá khả chống oxi hoá dịch chiết từ nấm Linh chi đối tượng vi sinh vật động vật thực nghiệm - Đánh giá khả chống viêm dịch chiết nấm Linh chi đối tượng động vật thực nghiệm e Các kết đạt được: - Thu dịch chiết Ganoderma lucidum từ sinh khối sợi nấm , sử dụng làm nguyên liệu thí nghiệm đề tài - Đánh giá khả chống viêm thực nghiệm chuột nhắt trắng cho uống tiêm dịch chiết Ganoderma lucidum - Khả bảo vệ peroxit hoá lipit tế bào gan chuột dịch chiết Ganoderma lucidum, sử dụng CC14 làm tác nhân gây độc Các kết thu xem xét số men gan, đọc hình ảnh tiêu mơ học f Tinh hình kinh p h í : Tổng kinh phí đề tài là: 20.000.000 VNĐ Thanh tốn dịch vụ công cộng: 1.700.000 VNĐ Hội nghị: 1.000.000 VNĐ Chi phí thuê mướn: 8.000.000 VNĐ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 9.300.000 VNĐ Summary a) The title of subject: Evaluation of anti oxidative and anti inflamable activities of extract from Ganoderma lucidum Numerical code: b) The grant holder: QT - 08 - 34 M.Sc Ta Bich Thuan c) The Participants: B.Sc Nguyen Thanh Huong B.Sc Nguyen Thuy Trang d) Objectives and contents * Objectives: Investigate the biomedical activities of Garnoderma lucidum extract (GLE) including anti-inflammatory on mice , and anti oxidation on microorganism, anti­ lipid peroxidation on mice * Contents : > Evaluate the anti-inflammatory of GLE on the animal in laboratorial condition > Evaluate the anti-lipidperoxidation of GLE on mice liver cells e) The obtained results: y Prepare extract of Ganoderma lucidum > Data about the anti-inflammatory activity of GLE on white mice through oral and injection route > Data about the anti oxidation on microorganism , and resuls anti- Iipidperoxitdation of GLE against carbon tetrachloride induced liver mice injury XÁC NHẬN CỦA BAN CHỦ NHIỆM KHOA (ký ghi rõ họ tên) CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI (ký ghi rõ họ tên) MỤC LỤC MỞ ĐẨU ’ .! Ị Chương - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giói thiệu Ganoderma lucidum 1.1.1 Vị trí Ganoderma lucidum hệ thống phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh học Ganoderma lucidum .2 1.1.2.1 Đặc điểm hình th i 1.1.2.2 Chu trình sống đặc điểm sinh sản 1.1.2.3 Các yếu tố sinh th i 1.1.2.4 Thành phần hoá dược 1.1.3 Giới thiệu số tác dụng sinh y dược Ganoderma lucidum 1.2 Tác dụng chống viêm Ganoderma lucidum 1.2.1 Phản ứng viêm thể sinh vật 1.2.2 Nguyên nhân gây viêm 1.2.3 Các giai đoạn phản ứng viêm 1.2.4 Những nghiên cứu tác dụng chống viêm Ganoderma ỉucidum 1.3 Tác dụng chống oxy hoá Ganoderma lucidum 1.3.1 Quá trình tạo gốc tự thể sinh v ật 1.3.2 Tác hại gốc tự thể sinh v ật 10 1.3.3 Những nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá Ganoderma lucidum 11 Chương - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 Nguyên liệu 13 2.2 Hoá chất thiết b ị 13 2.2.1 Hoá chất 13 2.2.2 Thiết b ị 13 2.3 Phương pháp nghiên c ứ u 2.3.1 Nuôi cấy tách chiết Ganordema lucid u m .14 2.3.2 Phương pháp chống viêm thực ng h iệm 14 MỞ ĐẨU Trong thể sinh vật, viêm oxy hố hai q trình có nhiều ảnh hưởng lớn Viêm đáp ứng bảo vệ nhằm đưa thể trở lại tình trạng bình thường trước bị tổn thương đáp ứng viêm không phù hợp có gia tăng q mức trở thành có hại, gây đau đớn, tổn thương mơ lành, rối loạn chức Bên cạnh đó, q trình oxy hóa với tham gia gốc tự hình thành trình trao đổi chất trao đổi lượng nguyên nhân dẫn đến tổn thương oxy hoá thể sinh vật Do quan, tổ chức mơ bị phá hoại nghiêm trọng gây biến đổi bệnh lý : ung thư, hoại tử, polymer hoá, lão h ó a Vì việc sử dụng hợp chất tự nhiên tách chiết chủ yếu từ thực vật có khả chống viêm, chống oxy hố cao mà không gây tác dụng phụ yêu cầu cấp thiết ngành y dược học Ganoderma lucidum từ lâu biết đến thảo dược quý, vị thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khoẻ chữa trị nhiều loại bệnh Ngoài G lucidum làm tăng thải độc gan, cắt ho suyễn, điều hoà huyết áp, giảm cholesteron, chống viêm, chống lão hoá chống oxy hoá cao Với tiềm chữa bệnh đa dạng trên, ỏ nước Châu Á Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Đ ộ việc nghiên cứu, phát triển sử dụng G lucidum triển khai với quy mô rộng lớn phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ động, nghiên cứu thành phần hoá học, tác dụng dược liệu điều trị lâm sàng Những nghiên cứu y, dược học đưa kết luận cho thấy rõ loài G lucidum nhiều vùng khác sản sinh loại hợp chất sinh học có tính chất biệt dược quý khác Hiện nay, việc nghiên cứu tác dụng dược liệu G lucỉdum - chủng phàn lập nuôi trồng thành công Việt Nam nhiều nhà khoa học quan tâm đến Tuy nhiên nguyên nhân, tác dụng khả chữa bệnh, đặc biệt khả chống viêm, chống oxy hoá G lucidum chưa nghiên cứu nhiều sâu Bởi giao thực đề tài: “ Đánh giá khả chống viêm chống oxy hoá dịch chiết Ganoderma lucidum ” với hi vọng góp phần tạo sở cho việc khai thác ứng dụng nguồn nguyên liệu tự nhiên quý sản phẩm chống viêm, chống oxy hoá, phục vụ đời sống người C h n g - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VÊ G a n o d e r m a ỉu c id u m 1.1.1 Vị trí G anoderm a lucidum hệ thống phân loại Trong tiếng Latinh, G anoderm a danh từ ghép, gano láng bóng, derm a nghĩa lớp vỏ, thể nét chủ đạo hình thái thể bên ngồi đa số lồi họ G anoderm ataceace Tuy nhiên, tính cao cấu trúc bào tử loài họ yếu tố để phân loại Do lịch sử nghiên cứu hệ thống tự nhiên họ G anoderm ataceace coi trình nghiên cứu cấu trúc bào tử đảm chúng K hoảng 120 năm trước, Karten - nhà nấm học Phần Lan lần tách từ nấm Polypore m ột nhóm nấm đặc biệt, xây dựng nấm độc lập chi G anoderm a theo kiểu bào tử đảm đặc trưng Đó kiểu bào tử đảm có lớp vỏ kép, hình trứng cụt, bề m ặt sần sùi m ụn cóc, gờ nhỏ Do đó, việc phân loại Ganoderma có bước tiến quan trọng [4], Người ta dễ dàng lọc từ nhóm Poplypore, Formes, B oletus lồi mà vị trí tự nhiên chúng thuộc Ganoderma Ngày nay, G lucidum phân loại theo quy ước quốc tế sau: Loài G anoderm a ỉuciảum Chi G anoderm a Họ Linh Chi G anoderm ataceace Bộ nấm lỗ A phyllophorales Lớp nấm đảm Basidiom ycetes N gành nấm đảm Basidiom ycota Giới nấm M ycetalia 1.1.2 Đặc điểm sinh học G anoderm a lucidum 1.1.2.1 Đ ặc điểm hình thái Nấm có tai nấm hố gỗ, mũ x tròn, bầu dục hình thận Quả thể có cuống dài, ngắn hay khơng có cuống M ũ nấm dính lệch hay dính bên, màu nâu đỏ, bóng láng Trên mặt mũ có vân gợn tâm có tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu đến vàng cam, đỏ cam, đỏ nâu, nâu tím nâu đen, mũ nấm sẫm m àu dần theo tuổi Đường kính tán biến động từ - 30 cm , dày 0.8 - 2.5 cm Thịt nấm dày từ 0.4 - cm, màu vàng kem - nâu nhạt - trắng Hệ sợi nấm kiểu trim itic, đầu tận lớp sợi phình hình trứng m àng dày đan xít vào tạo thành lớp vỏ láng phủ mặt mũ cuống [9 ] A B Hình Hình thái đặc trưng Ganoderma lucidum (Nguồn www.sinhhocvietnam.com) A - Hình thái bên ngồi; B - Mặt cắt dọc 1.1.2.2 Chu trình sống đặc điểm sinh sản Các bào tử đảm đơn bội, điều kiện thuận lợi nảy m ầm tạo hệ sợi sơ cấp (prim ary hyphase) Hệ sợi sơ cấp đơn bội mau chóng phát triển, phối hợp với (plasm ogam ie) tạo hệ sợi thứ cấp hay gọi sợi song hạch (dicargon hyphase) Khi hệ sợi phát triển, phân nhánh m ạnh, lan khắp giá thể Lúc thường có tượng hình thành bào tử vơ tính màng dày (gasterospores) Các bào tử dễ dàng rơi gặp điều kiện phù hợp nảy m ầm cho hệ sợi song hạch tái sinh [39J Hệ sợi thứ cấp phát triển mạnh đạt tới giai đoạn cộng bào, tức vách ngăn (septum ) hoà tan Tiếp theo giai đoạn sợi bện kết (m ating) để chuẩn bị cho hình thành m ầm m ống thể Hệ sợi nguyên thuỷ phát triển thành sợi cứng (skeletal hyphase) có màng dày, phân nhánh thành cấu trúc bó gắn chặt sợi bện thừng (binding) phân nhánh m ạnh [13], [39] Từ phát triển thành m ầm m ống thể màu trắng mịn vươn dài đến trụ tròn mập Dần đần phần đỉnh trục bắt đầu xoè thành tán, lúc lớp vỏ láng đỏ da cam dần xuất Tán lớn phát triển dần thành bào tầng (hym enium ) bắt đầu phát tán bào tử đảm liên tục nấm già sẫm màu, khô tóp lại lụi dần vòng - tháng Thể sinh sản dạng ống, gắn ống nhỏ thẳng đứng, m iệng tròn trắng - vàng ánh xanh, có bốn đảm bào tử hình trứng cụt Bào tử giá có vỏ với lớp cấu trúc hai lớp màng, m àng ngồi nhẵn khơng màu, màng m àu nâu gỉ sắt, phát triển thành gai nhọn vươn sát màng [9 ], [13] 1.1.2.3 Các yếu t ố sinh thái G ỉucidum loài phân bố rộng Trong q trình phát triển, G lucidum mọc gốc, rễ sống chết, nhiều loài gỗ mọc rừng hay ăn [5] Điều kiện phát triển tốt nấm dạng sợi 26 - 30°c Quả thể gặp rộ vào m ùa mưa từ tháng tới tháng 11 Nấm mọc tốt bóng rợp, có ánh sáng khuyếch tán yếu Do có lớp vỏ bóng láng m chịu nắng rọi chịu mưa liên tục Đối với hệ sợi nấm, nuôi cấy mơi trường dịch thể với nhiệt độ thích hợp từ 26 - 28°c, phát triển tốt pH từ - 8.5 Sau 15 - 20 ngày phần sợi già bắt đầu ngả vàng xuất mầm thể [4] 1.1.2.4 Thành phần hoá dược Trong khoảng hai chục năm trở lại có nhiều khảo cứu giới Việt Nam tập trung phân tích, tìm hiểu thành phần hố học có hoạt tính G lucidum Bằng phương pháp thơng dụng, người ta phân tích thấy G lucidum có chứa hợp chất sau: nước (12 - 13%); cellulose (54 - 56%); lignine (13 - 14%); hợp chất nitơ (1.6 - 2.1%); lipit (1.9 - 2%); hợp chất phenol (0.08 - 0.1%); hợp chất sterol toàn phần (0.11 -0 % ); hợp chất saponin toàn phần (0.3 -1.33%); akaloid glucosid tổng số (1.82 - 3.06%) Ngồi hợp chất nhóm lacton lên đến 2%, với số hợp chất khác [13], [27] 1.1.3 Giới thiệu sô tác dụng sinh y dược Ganoderma lucidum G lucidum loại dược liệu dân gian có giá trị Hàng nghìn năm nay, Châu Á đặc biệt Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Đ ộ G lucidum với vài loại nấm nấm Hương (.Lentinus edodes), nấm Chân chim (Schizophyllum commune), nấm Vân chi (Tram entes versicolor), nấm Kim châm (.Flammulina velutipes) đề cao thực phẩm vô quý giá, vị thuốc đầy tiềm chúng có tác dụng phục hồi sinh lực, kéo dài tuổi thọ Trong G lucidum coi số m ột, loại nấm khác thuốc bổ dùng để chữa bệnh ốm đau thơng thường Chính vậy, nhiều cơng trình nghiên cứu tiến hành với mục đích tinh chế hợp chất tự nhiên có hoạt tính dược liệu cao từ G lucidum nghiên cứu Hikino H [27] Min B s [35] Các nghiên cứu cho thấy G lucidum gồm thành phần chủ yếu như: polysaccharide, triterpenoid, polysaccharide-protein, polysaccharide-peptide Các thành phần chứng minh thành phần để điều trị bệnh xơ vữa động mạch, điều hoà huyết áp, giảm cholesterol, bệnh trĩ, sâu răng, nhiễm trùng răng, béo phì nhiều bệnh nan y khác [10] Ngồi G ìucidum cho có ảnh hưởng tốt điều trị trường hợp bị đột quỵ, bệnh liên quan đến não tuỷ, hẹp động mạch vành, nhồi máu tim, trường hợp viêm tĩnh mạch, bệnh nảy sinh tắc nghẽn động mạch [41] Hơn G lucidum có hiệu việc điều trị chứng viêm da điển hình, viêm phế quản, hen suyễn, viêm mũi dị ứng, viêm gan mạn tính [10] Đặc biệt, G lucidum có tác dụng tăng cường khả miễn dịch thể, có khả chống ung thư, chống lại q trình oxy hố [2], [41] Các hợp chất tự nhiên có G lucidum chứng minh có khả chống phóng xạ, tia u v tác nhân gây đột biến [7], [ ], [33], Đặc biệt G lucidum có tác dụng ngăn cản hoạt động gốc tự có khả làm thương tổn đến ADN - nguyên nhân gây bất ổn truyền [40] Với tiềm chữa bệnh đa dạng, G lucidum thực loại thảo dược có giá trị cao, có nhiều ứng dụng tốt y học có giá trị thương phẩm lớn đời sống 1.2 TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA Ganoderma lucidum 1.2.1 Phản ứng viêm thể sinh vật V iêm xem phản ứng phức tạp, đặc trưng cho thể động vật có hệ thần kinh phát triển Q trình xuất có diện tế bào chết, vi khuẩn hay chấn thương, ma sát song dù nguyên nhân nào, viêm có biểu lâm sàng sưng, nóng, đỏ, đau kèm theo rối loạn chức quan bị viêm Từ kỷ XVIII, phản ứng viêm nghiên cứu từ đến khái niệm viêm có nhiều thay đổi Đứng góc độ lâm sàng, người ta thường coi viêm đáp ứng có hại cho thể gây đau, nóng, sốt Nhưng đứng quan điểm sinh lý bệnh học, viêm đáp ứng bảo vệ nhằm đưa thể trở lại tình trạng bình thường trước bị tổn thương [12] Viêm phân thành hai loại viêm cấp tính viêm m ạn tính Diễn biến q trình thể Hình Hình Diễn biến trình viêm Ngày nay, với phát triển miễn dịch học người ta thấy có liên quan tượng viêm trình mẫn cảm, viêm giúp thể nhận biết yếu tố xâm nhập nhờ vai trò đại thực bào việc trình diện kháng nguyên Tuy nhiên, đáp ứng viêm khơng phù hợp có gia tăng q mức trở thành có hại cho thể gây đau đớn, tổn thương mô lành, rối loạn chức Bên cạnh đáp ứng viêm lan toả, ảnh hưởng tới nhiều quan hệ thống thể Hậu dẫn tới hội chứng đáp ứng viêm hệ thống (systemic inflammatory response syndrome) với biểu giảm bạch cầu trầm trọng, tăng thân nhiệt, tim đập mạnh, thở nhanh dẫn đến tử vong [24], [37], 1.2.2 Nguyên nhân gây viêm Nguyên nhân bên gây viêm thường thấy vi khuẩn, virut, số loại nấm, kí sinh trùng Ngồi có yếu tố gây viêm khác hố chất, thuốc, chấn thương, áp lực, ma sát, hay nhiệt, tia phóng xạ, x Viêm gây ngun nhân bên thể hoại tử nghẽn mạch, xuất huyết, viêm tắc động mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng, bệnh tự miễn, viêm xung quanh tổ chức ung thư 1.2.3 Các giai đoạn phản ứng viêm Các nguyên nhân gây viêm tác động lên thể sinh vật gây phản ứng viêm Phản ứng viêm điển hình gồm có ba giai đoạn chính: đến lần so với lô đối chứng (lô 1) lơ chuột uống dịch chiết G ìucidum (lơ 2) Kết phù hợp với hình ảnh tiêu chúng tơi quan sát kính hiển vi: nhieu đam tê bào nội mô kuffer bao xung quanh tê bào gan tổn thương để thực bao Chinh trình tiêu huỷ tê bào làm tăng cao m ột sơ enzym chuyển hố axit amin máu GOT, GPT Trong lơ chuột uống CC14 kết hợp VƠI dich chiêt G lucidum (lô 3) hoạt độ GOT GPT giảm đáng kể Điều chưng to qua trình tiêu huỷ tế bào gan hạn chế Quan sát tiêu chúng tơi thấy bờ gan phẳng, tê bào gan bị chết, ranh giới tế bào rõ ràng Như vậy, co thê kêt luận dịch chiết G lucidum chúng tơi có tác dung làm giảm cac gôc peioxit hpit tự gây hại, bảo vệ gan chuột không bị tổn thương nặng CC14 Kết luận phù hợp với công bố Lakshmi B [32] Yang X Y [40], Tóm lại, với kết thu từ đề tài chứng minh kha nang chong viêm, chông oxy hoá dịch chiết G lucidum Kết gop phân tạo tiên đê, sở cho nghiên cứu sau nhằm m ục đích đánh giá tiem nang sinh y dược to lớn chủng G lucidum phân lập nuôi trồng tai Việt Nam 30 KẾT LUẬN Dựa kết nghiên cứu trình bày chúng tơi rút số kết luận sau đây: Dịch chiết Ganoderma lucidum tách chiết điều kiện phòng thí nghiệm có tác dụng dược lý cao Sử dụng dịch chiết G lucidum để chống viêm cấp in vivo đường uống tiêm cho hiệu cao Tuy nhiên nồng độ dịch chiết 10% thể khả chống viêm cao so với nồng độ % Dịch chiết Ganoderma lucidum 10% có hoạt tính chống oxy hố in vitro cao 84,68%, làm giảm lượng MDA sinh q trình peroxit hố lipit hoạt tính chống oxy hoá dịch chiết Ganoderma lucidum phụ thuộc vào nồng độ Dịch chiết Ganoderma lucidum làm giảm tổn thương gan chuột trước tác nhân gây độc CC14 Các kêt tiêu tế bào cho thấy rõ trình phục hồi màng tế bào gan chuột sử lý với dịch chiết, dịch chiết G lucidum có khả hạn chế gốc peroxit lipit tự do, bảo vệ tế bào gan chuột Các tiêu xác định men gan GOT, GPT mẫu gan lơ thí nghiệm lơ đối chứng phù hợp với kết tiêu tê bào khẳng định rõ khả chống oxi hoá cao dịch chiết G.lucidum KIẾN NGHỊ Sử dụng dung môi khác để tiến hành chiết rút Ganoderma lucidum bước đầu tinh dịch chiết thu So sánh đặc điểm sinh y dược dịch chiết Ganoderma lucidum từ dung môi khác Tim hiểu thêm chất hoá dược dịch chiết thu điều kiện phòng thí nghiệm 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thị Mai Anh, Đào Văn Phan, Phạm Thị Vân Anh (2005), Bước đầu nghiên cứu tác dụng nấm Linh chi Việt Nam 0Ganoderma lucidum) qua số số lipid máu chuột cống, Tạp chí nghiên cứu y học Việt Nam, 38(5), tr - Đàm Trung Bảo, Hồng Tích Huyền, Nguyễn Văn Vinh (1999), Chất chống oxy hóa bệnh tật chống lão hố, NXB Y học, Hồ Chí Minh Hà Việt Bảo, Hoàng Thanh Hương, Đỗ Thị Gấm (2006), Thăm dò hoạt tính chống oxy hố hoạt chất chiết xuất từ diếp cá Houttuynia cordata ThunB (Saururaceae), Hội nghị Khoa học lần thứ 12, tr 27 - 34 Bộ Y tế (1995), Chuyên san hỉấm Linh Chi Ganodermataceae Denk Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam , NXB Y học Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập Vi sinh vật học, NXB Đại Học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Trịnh Xuân Hậu, Nguyễn Thị Kim Ngân, Đoàn Suy Nghĩ (2000), Tác dụng bảo vệ phóng xạ nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum Karst.) chuột nhắt trắng Swiss, Những vấn đề nghiên cứu Sinh học, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr 419 - 422 Trịnh Xuân Hậu, Nguyễn Thị Chính, Nguyễn Thị Hồng Nụ (2005), Thăm dò tác động bột sinh khối bào tử nấm Linh Chi (Ganoderma Karst.) lên cấu trúc mơ học tinh hồn chuột nhắt trắng (Mus musculus L.) dòng Swiss bị chiếu xạ, Những vấn đề nghiên cứu Khoa học sống, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 697 - 699 Trịnh Tam Kiệt (1981), Nấm lớn Việt Nam , NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 10 Phan Quốc Kinh, Phạm Gia Khôi, Nguyễn Lân Dũng (1998), Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, NXB Khoa học Kinh tế, Hà Nội 11 Phan Hải Nam (2004), M ột s ố xét nghiệm hoá sinh lâm sàng, NXB Quân đội nhân dân, Hà Nội 32 12 Lê Đình Roanh, Nguyễn Đình M ão (1997), Bệnh học viêm bệnh nhiễm khuẩn, NXB Y học 13 Lê Xuân Thám (1996), N ấm Linh Chi dược liệu quỷ Việt Nam, NXB Cà Mau 14 Tạ Bích Thuận, Phạm Kiên Cường, Đặng Quang Hưng (2005), Tìm hiểu enzym bảo vệ oxi hố nấm Linh Chi, Tạp chí Di truyền học ứng dụng, ISN: 0866 - 8566, tr 25 - 30 Tiếng Anh 15 Ames B N (1983), O xygen radicals and degenerative diseases, Science, 221, pp 1256 - 1264 16 Amstad p., Cerutti p (1990), Genetic M odulation of the cellular antioxidants defense capacity, Eviron Health Perspect., 8 , pp 77-82 17 Berlett B s., Stadtm an E R (1997), Protein oxidation in aging, disease and oxidative stress, J, Biol Chem, 272 (33), pp 20313 - 20316 18 Bishayee s., Balasubram anian A s (1979), Assay of lipid peroxides formation, J N euro Chem , 18, pp 909 - 913 19 Burger A., Raym er J., Bockrath R (2002), D N A damage-processing in E.coli: on-going protein synthesis is required fo r fixation o f u v-in d u ced lethality and mutation, Elsevier Science B v 20 Camp R (1982), Prostaglandins, hydroxyfatty acids, leukotrienes, and inflammation of the skin, Clin Exp D erm atol, 7, pp 435 - 444 21 Cabiscol E., Tam arit J., Ros J (2000), Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species, Internatl Microbiol, USA 22 Chang J., Carlson R p., Neill D o , Lam b B., Sharma R N., Lewis A J (1986), Correlation betw een m ouse skin inflammation induced by arachidonic acid andeichanoids synthesis, Inflam m ation, 10, pp 205-214 23 Cooke M s., Evans M D., Dizdaroghi M , Lunec J (2003), Oxidative DNA damage: M echanism s, m utation and disease, The F asebJ., 17, pp 1195-1214 33 24 Coussens L M., Werb z (2002), Inflammation and cancer, Nature, 420, pp 860 - 867 25 Daly M J et a] (2007), Protein oxidation implicatied as the prim ary determinant o f bacterial radioresistance, PloS Biol, (4), pp 769 - 779 26 F aư s B., Kogoma (1991), Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, MicrobiolReview, 55(4), pp 561-585 27 Hikino H., Konno c , Mirin Y., Hayashi T (1985), Isolation and hypoglycemic activity of Ganoderans A and B, glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies, Pla Med, 51, pp 339 - 340 28 Hoerter J D et al ( 2005), Effects of sublethal UVA irradiation on activity levels of oxidative defense enzymes and protein oxidation in Escherichia coli, Journal o f Photochemistry and Photobiology B: Biology, 81, pp -1 29 Jones s., Janardhanan K K (2000), Antioxidant and antitumor activity of Ganoderma lucidum (Curt : Fr.) p Karst - Reishi (Aphyllophoromycetideae) from south India, h it J M ed Mushy, 2, pp 195 - 200 30 Kiffoa A., Sawangwong p (2004), Drugs and cosmetics from the sea, Mar Drugs, 2, pp 73 - 82 31 Kim S D., Nho H J (2004), Isolation and characterization of a - Glucosidase inhibitor from the fungus Ganoderma lucidum, J M icobiol, 42 (3), pp 233 227 32 Lakshmi B., Ajith T A., Sheena N., Gunapalan N., Janardhanan K K (2003), Antiperoxidative, anti - inflamatory, and antimutagenic activities of ethanol extract of the mycelium of Ganoderma lucidum occuring in South India, Tetrato gene sis, Carcinogenesis and M utagenesis, 22, pp 85 - 33 Lakshmi B., Ajith T A., Jose N., Janardhanan K K (2006), Antimutangenic activity of mathanolic axtract of Ganoderma lucidum and its effect on hepatic damage caused by benzo[a]pyrene, Journal o ff Ethnopharmacology, 4200, pp - 34 McCay p B., Lai E K., Lee J (1984), Oxygen and carbon centered free radical formation during carbon tetrachloride metalolism, Vol 259, No 4, Issue o f February 25, pp 2135 - 2143 34 35 Min B S., Gao J J., Nakamura N., Hattori M (2000), Triterpenes from the spores of Ganoderma lucidum and their cytotoxicity against meth - A and LLC tumor cells, Chem Pharm Bull, 48, pp 1026 - 1033 36 Ohkawa H., Ohishi w , Yagi K (1979), Assay for peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction, Annal Biochem, 95, pp 351 -0 37 Serhan c N., Savill J (2005), Resolution of inflammation: the beginning programs the end, Nat Immunol, (12), pp 1191-1197 38 Slater F (1984), Free - radicals mechanisms in tissue injury, Biochem J, 222, pp - 15 39 Ta B T (2006), Evaluation of several biomedical characteristics of Ganoderma lucidum (Leyss Ex Fr) Kart, Journal o f science, Natural sciences and technology, T.XXII, No3C AP, pp 164 - 168 40 Yang X J., Liu J., Ye L B., Gao J R., Wu z H (2006), In vitro and in vivo protective effects of proteoglycan isolated from mycelia of Ganoderma lucidum on carbon tetrachloride - induced liver inury, World J Gastroterol, 12(9), pp - 1385 41 Wong K L., Chao H H., Chan p., Chang L p., Liu c F (2004), Antioxidant activity of Ganoderma lucidum in acute ethanol - induced heart toxicity, Phytotherapy research, 18, pp - 1026 35 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TựNHIÊN KHOA SINH HỌC - Nguyễn Thuỳ Trang ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHÔNG VIÊM VÀ CHÔNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIÊT Ganoderma lucidum K H O Á LU Ậ N T Ố T N G H IỆ P H Ệ Đ Ạ I H Ọ C C H ÍN H Q U Y N gành: Sinh học Cán hướng dẫn: PGS.TS Trịnh Xuân Hậu ThS Tạ Bích Thuận Hà N ộ i-2 0 [ HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI NAM NATIONAL UNIVERSITY, HANOI ISSN Ũ866-B612 JOURNAL J Journal of Science, N a tu r a l Sciences an d T echnology 24, No 2S (2008) 389-393 Evaluation of anti-inflammation and anti-oxidation of the extract from Ganoderma lucidum (Leyss ex fr) kart Ta Bich Thuan*, Nguyen Thuy Trang, Trinh Xuan Hau, Vo Thi Thuong Lari Faculty o f Biology, College o f Science, VNU, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam Received 29 October 2008 Abstract In this study, we used the ethanol extract from Ganoderm a lucidum (GAL) to investigate anti - inflammation and anti - oxidation in mice The anti - inflammatory activity was determined by paw mice thickness test The results indicated that the effects on anti - inflammation o f GAL extract at concentrations o f mg/ml and 10 mg/ml were 57% and 83%, respectively The anti - oxidant activity in vitro o f the extract was determined by chemical reaction between malondialdehyde (M DA) and thiobabituric acid The effects on anti - oxidation at GAL concentrations o f mg/ml and 10 mg/ml were 58.87% and 84.68%, respectively Moreover, the G lucidurn extract was able to inhibit oxidation induced by carbon tetrachloride (CC14) in mice liver via ameliorated hepatic injury and reduced activities o f Glutamate oxaloacetate transaminase (GOT) and Glutamate pyruvate transaminase (GPT) Keywords: Ganoderm a lucidum, anti - inflammation, anti - oxidation elucidate anti - oxidation and anti inflammation of the extract from G lucidum originated in Vietnam ntroduction Nowadays medicine and pharmacology e intended to investigate mcdical herbs ich not have as much harmful effect as thctic drug G lucidum has been known to itain many biologically active compounds ị] Actually, G lucidum has been used for usands years in traditional oriental medicine 1has been considered as a panacea medicine I ethanol extract of G lucidum could be used inhibition and treatment of various human ỉases such as chronic bronchitis, hepatics, >ertension, tumorigenic diseases and nunological disorder in Asian countries 1,5], In our study, the main aim is to Materials and methods 2.1 Material The ethanol extract from G lucidum was prepared in Medical Biology Lab of Hanoi University of Science Swiss albino mice at - 10 weeks, weighing 20 ± g were provided by National institute of Hygiene and Epidemiology They were fed in condition lab with standard food and water KC1, Dextran, Thiobabituric acid, Trichloacetic acid, Carbon tetrachoride were )[responding author I cl.: 84-4-22134496 mail: thuantbó 1@yahoo.com.vn 89 T.B Thuatueljil / V N U journal of Science, Natural Sciences and Technology 24, No 2S (2008) 389-393 90 from Sigma, Difco, Merck Other chemicals and reagents were of analytical grade purchased 2.2 Methods Preparation the ethanol extract from G lucidum: The process was caưied out following the method of Ta B T [5] Anti - inflammation Assay: Mice were divided into five groups of five mice each In all groups, an inflammation was induced by injection Dextran 5% into mice paw The group treated with Dextran 5% alone served as the control Four groups were supplied the G lucidum extract at concentrations of mg/ml and 10 mg/ml by injection or oral route The paw thickness was measured before and after hours of Dextran 5% injection Percent inhibition was calculated by the formula ( 1- PT /pc) X 100, where PT is the increase in thickness of treated paw and pc is that of control [2,5], Anti - oxidation assay in vitro: Lipid peroxidation inhibiting activity of the GAL extract was determined by the method of Ohkawa et al [6 ] Anti - oxidation assay in vivo: Mice were divided into four groups of five mice each The first group was treated with H20 and served as the control; the second group treated with th GAL extract at concentration 10 mg/ml, th third group treated with the extract 10 mg/ir plus 10 mg/ml carbon tetrachlodride (CCl4)thc was used to induce injury and oxidation c mice’s liver, and the final group treated with mg/ml CC14 CCI4 was used to induce a live injury model After 14 days, the sections c mice’s liver were stained with hematoxylin an eosin for histological evaluation and observe under light microscope [3] The GOT and GP parameters of the blood of mice were analyze in Bach Mai Hospital Results 3.1 Anti - inflammation Ganodenna lucidum extract activity o f ÍÌ Mice paw reached the most swell< thickness after hours injection of 5% Dextra Hence we measured thickness paw at hou after supply of the GAL extract throuỊ injection or oral route At this time, we foul that GAL extract at concentrations of mg/i and 10 mg/ml expressed quite high anti inflammatory effect as indicated by perce inhibition shown in Table Table Anti - inflammation effect o f the G lucidum extract on mice-paw swell induced by 5%Dextran Groups Control Injection Treatment (mg /ml) - '10 Oral route 10 Initial paw thickness (ml) 0.144 ± 0 0.142 ± 0.013 0.144 ± 0.011 0.145 ± 0 1 0.143 ± 0.026 3.2 Anti - oxidation activity in vitro o f the Ganoderma lucidum extract The results shown in Table indicated that the GAL extract significantly inhibited the lipid Paw thickness after 3h (ml) 0.718 ± 0 0.358 ± 0 0.241 ± 0 0.390 ± 0.019 0.313 ± 0 Increase in paw thickness (ml) 0.574 ± 0 0.216 ± 0 0.097 ± 0 0.245 ± 021 0.170 ± 0.038 % Inhibition 62 83 57 70 peroxidation in liver mice in vitro The extr at concentration of mg/ml had lower ant oxidant effect (58.87%) than that at 10 mg/ (84.68%) T B Tinian et cử: I V N U journal of Science, Natural Sciences and Technology 24, No 2s (2008) 389-393 391 Table Anti - oxidation effect in vitro o f the G lucidum extract Concentration (m e/m l) v B J Quantity° M D A (xlO M) i % r— — —— % Anti - oxidation comparison with control _ Control 0.079 ± 0.026 mg/ml GAL 0.033 ± 0.014 10 mg/ml GAL _ 0.012 ± 0.051 100 41.13 15.32 Anti - oxidation in vivo o f the Ganoderma "idum extract Histological analysis: We examined the fects of the GAL extract at concentration 10 g/ml on histopathological changes caused by 2\4 that induces liver injury in m ice in vivo obvious histopathological change was (Served in liv er sam p les from the control oup and the GAL treated group Liver from ese both groups had no infiltrations and morrhagic signs (Figure 1A and IB) On the ' _ 58.87 84.68 other hand, we realized clearly necrotic hepatic tissue (Figure 1C and ID) in the mice liver damaged by CCỈ4 However, in the group treated by G lucidum extract, many evident recoveries were found (Figure IE and IF) Biochemical analysis: We analyzed GOT and GPT to evaluate more detail the effect of G lucidum extract on anti - oxidant The results showed that activity of GOT and GPT in the GAL treated group were lower than those in CC14 - treated group (Table 3) Table Comparison GOT and GPT activities among four groups Groups Control 10 mg/ml GAL 10 mg/ml GAL + 1Omg/ml CCI4 10 mg/ml CCI4 GOT (Ư/L) 219.17 ± 25.27 181.02 ± 2 399.24 ±94.71 664.12 ± 4 GPT (U/L) 75.83 ± 15.40 80.13 ± 3.01 173 08 ± 1.03 314 21 ± 9 Discussion SB— Fig, Histological changes o f CCI4 - induced hcpatic cells in the presence or absence o f the G lucidum extract A - Group (control); B - Group (GAL); c, D Group (CCI4); E, F - Group (GAL + CCI4); Normal liver cells; Kupffer cells; Injury liver cells IVIany rcsciirchcs demonstrated that ÍỈÌC extract of G lucidum prevents the arachidonic acid metabolites, kinins and increase amount of leukocytes which related inflammation [2j Our data indicated that the GAL extract in a dose dependent manner decreased remarkable paw thickness in mice induced by Dextran 5% Both two ways of treatment of the extract, injection and oral route, inhibited highly inflammation in paw mice The results have brought available benefit for patients to use drug Beside anti - inflammatory activity, the extract of G lucidutn has been known as a good drug for anti - oxidation In vitro it showed the effect 011 anti - lipid peroxidation significantly in mice’s liver via decreasing quantity of MDA 92 T.B Thuan cial / V N U Journal of Science, Natural Sciences and Technology 24, No s (2008) 389-393 generated in lipid peroxidation In vivo, rapid peroxidation of the membrane structural lipids was caused by CC14, leading to serious damages such as hemorrhage, necrosis in hepatic tissue, abnormal cytoplast and increase in numbers of Kuffer cells (phagocyte cells) These symptoms were observed less in the third group in which mice were treated with CCI4 and GAL (Fig.l) Moreover, the decrease in GOT and GPT activity was also observed in this group These suggested that the GAL extract scavenges the free radicals induced by CCI4, subsequently protects mice liver All these results indicated that the GAL extract had anti - oxidant activity to prevent toxicity of CCI4 In conclusion, our study demonstrated that the extract from G lucidum is beneficial to the clinic for anti - oxidation and anti inflammation References [1] S Jones, K.K Janardhanan, Antioxidant ar antitumor activity o f Ganoderma lucidum (Cui Fr.) P Karst - Reishi (Aphyllophoromycetidea from south India, hit J Med Mushr (2000) 19: [2] B Lakshmi, T.A Ajith, N, Sheena, ] Gunapalan, K.K Janardhanan, Antiperoxidati-V anti - inflamatory, and antimutagenic activiti o f ethanol extract of the mycelium Ganoderma lucidum occuring in South Indi Tetratogenesis, Carcinogenesis and Mutagenei 22 (2003) 85 - 97 [3] X.J Yang, J Liu, L.B Ye, J.R Gao, Z.H w In vitro and in vivo protective effects proteoglycan isolated from mycelia Ganoderma lucidum on carbon tetrachloride induced liver injury, World J Gastroterol (2006) 1379 - 1385 [4 ] K.L Wong, H.H Chao, p Chan, L.p Char C.F Liu, Antioxidant activity o f Ganoderr lucidum in acute ethanol - induced heart toxicii Phytotherapy research 18 (2004) 1024 - 1026 Acknowledgements [5] We thank to the VNU-Hanoi for funding the project QT-08-34, all staff members of the Biomedical Laboratory and the Life Science Research Center B.T Ta, Evaluation o f several biomedic characteristics o f Ganoderma lucidum (Leyss ] Fr) Kart, Journal o f science, Natural scienc and Technology T.XXII No3C AP (2006) 16' [6] H Ohkawa, w Ohishi, K Yagi, Assay peroxides in animal tissues by thiobarbituric a< reaction, Annal Biochem 95 (1979) 351 - 0358 Đánh giá khả chống viêm chống oxy hóa dịch chiết Ganoderma lucidum (Leyss ex fr) kart Tạ Bích Thcuận, Nguyễn Thùy Trang, Trịnh Xuân Hậu, Võ Thị Thương Lan Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Các nghiên cứu gần cho thấy loại thảo dược có tác dụng chữa bệnh c loại tân dược tổng hợp Bên cạnh có tính khác bao gồm gây phản ứng pl ngun liệu sẵn có, giá thành rẻ, dễ sử dụng phù hợp với lứa tuổi Nấm Linh chi Ganoden lucidum từ xưa coi loại thảo dược chữa trị nhiều loại bệnh khác Việt Nam chúng tơi ni trồng hồn thiện quy trình tách chiết ợ lucidum cồn Sử dụ dịch chiết nhằm đánh giá khả chống viêm, chống oxi hóa đối tượng động vật th T B Thuan et al / V N U Journal of Science, N atu ral Sciences and Technology 24, No s (2008) 389-393 393 liệm Ket chổng viêm GAL nồng độ mg/ml 10 mg/ml đối tượng chuột nhắt trắng ần chủng (m = 20 ± gram) bị gây viêm cấp gan bàn chân Dextran 5% 57% 83% dụng dịch chiết tiêm uổng cho hiệu kháng viêm cao Khi sử dụng dịch chiết Ig độ mg/ml 10 mg/ml kiểm tra hoạt tính chơng oxi hóa thông qua xác định hàm lương londialdehydc (MDA) biểu 58.87% 84.68% Chúng sừ dụng carbon tetrachloride tác nhân gây hoại tử gan chuột Trong lơ thí nghiệm cho xử lý dịch chiết GAL Sau ngày điều trị, xét nghiệm máu cho số men gan GOT GPT cho thấy tỷ lệ chống oxitlipit hóa màng tế bào gan chuột lơ đơi chứng thí nghiệm có sai khác đáng kể Ket I nghiên cứu bước đầu cho thấy dịch chiết nơng độ 10 mg/ml có hoạt tính chổng viêm chống hóa cao Thêm vào làm tiêu tê bào học từ mơ gan lơ thí nghiệm đổi chứng Kết cho thấy mức độ tổn thương phục hồi tế bào gan sau bị phá ' CC14 tương đồng với kết xét nghiệm máu nêu z\4) Từ kết nghiên cứu nhận thấy sử dụng dịch chiết nấm Linh chi G a n o d erm a idutn cồn nồng độ 10 mg/ml cho hiệu chơng viêm chống oxi hóa cao đối tượng Ig vật thực nghiệm Từkhoá: Ganoderma lucidum, chống viêm, chơng oxi hố PHIẾU ĐẢNG KÝ KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u KH-CN Tên đề tài: Đánh giá khả chống oxi hoá khả chống viêm dịch chiết nấm Linh chi Ganoderma lucidum M ã số: Q T- 08 - 34 Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi Thanh Xuân Hà Nội Tel: 38584287 Cơ quan quản lý đề tài: Khoa Sinh học Địa chỉ: 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Tel: 38584734 Tổng kinh phí thực chi: Trong đó: - Từ ngân sách nhà nước: khơng - Kinh phí trường: 20.000.000 VNĐ - Vay tín dụng: khơng - Vốn tự có: khơng - Thu hồi: khơng Thời gian nghiên cứu: Năm Thời gian bắt đầu: 3/2008 Thời gian kết thúc: 12/2008 Tên cán phối hợp nghiên cứu: CN Nguyễn Thị Thanh Hương CN Nguyễn Thuỳ Trang Số đăng ký đề tài: Số chứng nhận đăng ký Bảo mật: Ngày: kết nghiên cứu: a Phổ biến rộng rãi: b Phổ biến hạn chế: c Bảo mật: Tóm tắt kết nghiên cứu: - Tách chiết cao nấm Ganoderma lucidum , sử dụng làm nguyên liệu cho mục tiê đề tài - Đánh giá khả chống viêm thực nghiệm chuột nhắt trắng cho uống V tiêm dịch chiết Ganoderma lucidum - Đánh giá khả chống oxi hoá màng tế bào gan chuột bị sử lí CC14 củ dịch chiết nấm Ganoderma ỉucidum Kiến nghị quy mô đối tượng áp dụng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu loại nấm có tính dược liệu cao, gần ứng dụn nhiều Công nghệ sinh học Yêu cầu nghiên cứu sâu tinh , xá định thành phần hợp chất tự nhiên dịch chiết nấm Linh chi Chủ nhiệm đề Thủ trưởng Chủ tịch Hội Thủ trưởng co tài quan chủ trì đồng đánh giá quan quản lý đề tài Họ tên chínM ® N S M NKHOA Học* CƠNG ỊRUỎNG BAN Tạ Bích Thuận fh ữ h ịL Lù i: / lỳ ẩ ẫ ^ Học hàm học vị Thạc sĩ Ký tên Đóng dấu u?rn • TC>} tf^y r M.SãgÉ^ H \ Ạ *M H U c \ 't\ khoẠ — sV 'a ? -—_ 'i’>rfr**s'k X™ :., - TƯ N H ÌcN * 6s ĩ sKH U y&Ẫ: 'Ổ /Sl ** ... tiêu: Đánh giá khả chống viêm động vật thực nghiệm, chống oxi hoá đối tượng vi sinh vật động vật thực nghiệm nấm Linh chi Ganoderma ỉucidum Nội dung: - Đánh giá khả chống oxi hoá dịch chi t từ nấm. .. uống tiêm dịch chi t G lucidum 20 3.2 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHốNG OXY HÓA VÀ BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CHUỘT CỦA DỊCH CHI T Ganoderma lucidum 3.2.1 Xác định hoạt tính chống oxy hố Trong q trình peroxit hố... từ nấm Linh chi đối tượng vi sinh vật động vật thực nghiệm - Đánh giá khả chống viêm dịch chi t nấm Linh chi đối tượng động vật thực nghiệm e Các kết đạt được: - Thu dịch chi t Ganoderma lucidum