ĐẬT VẤN ĐÈ Viêm là một bệnh lý rất phổ biến, gặp ở nhiều bệnh, do nhiều nguyên nhân gây ra. Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm.Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn đến những rối loạn chức năng của các cơ quan, bộ phận cơ thể, gây ra nhiều ảnh hưởng xấu có khi nguy hiểm tới tính mạng của người bệnh. Vì vậy, việc ngăn ngừa các yếu tố có hại của viêm là rất cần thiết và quan trọng. Từ nhiều năm nay, các loại thuốc chống viêm có nguồn gốc hoá dược đã ra đời và được ứng dụng rộng rãi như: thuốc có cấu trúc steroid và phi steroid. Các thuốc này có ưu điểm là tác dụng tốt và đạt hiệu quả cao trong việc hạn chế và ngăn chặn quá trình viêm. Tuy nhiên, chúng có nhiều yếu tố bất lợi đối với cơ thể như; suy giảm miễn dịch, xốp xương, teo cơ, loét dạ dày tá tràng, ảnh hưởng tới quá trình đông máu, tạo máu... Vì vậy, việc sử dụmg các enzym nội sinh có tác dụng chống viêm cũng được coi trọng như achymotrypsin, papain, serratiopeptidase, a amylase.. .Chúng là những chất gần gũi với cơ thể, ít gây những ảnh hưởng xấu tới cơ thể, phần nào khắc phục được nhược điểm của nhóm thuốc chống viêm trên, nhất là chúng có thể dùng cho các bệnh nhân không sử dụng được thuốc chống viêm có nguồn gốc hoá dược. Song song với hướng nghiên cứu về các enzym chổng viêm thì các nghiên cứu về dược liệu trên quá trình viêm đã và đang được chú ý. ở nước ta, nhiều dược liệu có tác diing chống viêm tốt. Cây kim ngân là một trong những cây thuốc phổ biến ở Việt Nam có tác dụng chống viêm được sử dụng để điều trị viêm đã được ghi nhận trong nhiều tài liệu.
B ộ Y TÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ DUNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM SAPONIN KIM NGÂN {LONICERA JAPONICA THUNB. CAPRIFOLIACEAE) ĐỐI VỚI a - AMYLASE (Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học khoá 2001 - 2006) Người hướng dẫn : Th.s Lê Thị Diễm Hồng Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá Sinh • • • Thời gian thực hiện ; 3/2006 - 5/2006 ' ' 'x. \ HÀ NỘI, 5/2006 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Xuân Thắng, chủ nhiệm bộ môn Hoá sinh trường Đại học Dược Hà Nội. Người thầy đã giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới Th.s, Lê Thị Diễm Hồng, giảng viên bộ môn Hoá sinh trường Đại học Dược Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo đã trực tiếp truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường, các thầy cô giáo và các cô kỹ thuật viên bộ môn Hoá sinh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn. Tôi xin cảm ơn cha mẹ, những người thân và bạn bè đã luôn động viên, cổ vũ, giúp đỡ tôi trong cuộc sống và trong học tập. Hà Nội tháng 5 năm 2006 Sinh viên: Trần Thị Dung MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN Đ È 1 Chương I : TỔNG QUAN 3 1.1. Cơ SỞ LÝ THUYÉT VÈ VIÊM 3 1.1.1. Nguyên nhân gây viêm 3 1.1.2. Phân loại viêm 5 1.1.3. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm 5 1.1.4. Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm 6 1.2. CÁC THUỐC CHỐNG VIÊM 8 1.2.1. Thuốc chống viêm steroid 8 1.2.2. Thuốc chống viêm phi steroid 8 1.2.3. a-Am ylase 8 1.3. CÂY KIM NGÂN 11 Chương II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 14 2.1. NGUYÊN LIỆU 14 2.1.1. Kim ngân cuộng 14 2.1.2. Saponin kim ngân cuộng toàn phần 14 2.1.3. a- Amylase 16 2.1.4. Dung dịch cơ chất tinh bột 1%, pH = 6,8 16 2.1.5. Dung dịch albumin 5 mg/ml 16 2.1.6. Súc vật thí nghiệm 16 2.1.7. Thiết bị, dụng cụ 16 2.1.8. Hoá chất thí nghiệm 17 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 17 2.2.1. Phương pháp định lượng protein nước bọt bằng phản ứng biure 17 2.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym 18 2.2.3. Phương pháp gây viêm 19 2.2.4. Phương pháp thử tác dụng chổng viêm 20 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu 21 Chưong III: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 22 3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIÉT SAPONIN KIM NGÂN CUỘNG TOÀN PHẦN ĐÓI VỚI HOẠT TÍNH CỦA a- AMYLASE 22 3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần đối với hoạt tính của a- amylase 23 3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian đối với hoạt tính của a- amylase khi kết hợp với dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần 24 3.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của a- amylase khi kết hợp với dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần 26 3.1.4. Ảnh hưởng của sự kết hợp các nồng độ a- amylase nước bọt với dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần đến hoạt tính của a- amylase 27 3.2. KÉT QUẢ THỬ TÁC DỤNG TRÊN IN VIVO 28 3.2.1. Theo dõi sụ thay đổi thể tích chân chuột 28 3.2.2. Tác dụng ức chế phù của dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần theo thời gian uống thuốc 30 3.2.3. Tác dụng chống viêm cấp của dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần, a-amylase và dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần kết hợp với a-amylase 31 3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA lON CI ĐỔI VỚI HOẠT TÍNH CỦA a-AMYLASE 33 3.4. MỘT SÓ PHẢN ỨNG ĐỊNH TÍNH SAPONIN KIM NGÂN CUỘNGTOÀN PHẦN 34 CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 36 KÉT LUẬN VÀ ĐẺ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIÉT TẮT BC; Bạch cầu ESR Erythrocyte sedimentation (Tốc độ lắng hồng cầu) SKN Saponin kim ngân ư Đơn vị hoạt độ enzym ĐẬT VẤN ĐÈ Viêm là một bệnh lý rất phổ biến, gặp ở nhiều bệnh, do nhiều nguyên nhân gây ra. Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm.Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn đến những rối loạn chức năng của các cơ quan, bộ phận cơ thể, gây ra nhiều ảnh hưởng xấu có khi nguy hiểm tới tính mạng của người bệnh. Vì vậy, việc ngăn ngừa các yếu tố có hại của viêm là rất cần thiết và quan trọng. Từ nhiều năm nay, các loại thuốc chống viêm có nguồn gốc hoá dược đã ra đời và được ứng dụng rộng rãi như: thuốc có cấu trúc steroid và phi steroid. Các thuốc này có ưu điểm là tác dụng tốt và đạt hiệu quả cao trong việc hạn chế và ngăn chặn quá trình viêm. Tuy nhiên, chúng có nhiều yếu tố bất lợi đối với cơ thể như; suy giảm miễn dịch, xốp xương, teo cơ, loét dạ dày tá tràng, ảnh hưởng tới quá trình đông máu, tạo máu Vì vậy, việc sử dụmg các enzym nội sinh có tác dụng chống viêm cũng được coi trọng như a-chymotrypsin, papain, serratiopeptidase, a- amylase .Chúng là những chất gần gũi với cơ thể, ít gây những ảnh hưởng xấu tới cơ thể, phần nào khắc phục được nhược điểm của nhóm thuốc chống viêm trên, nhất là chúng có thể dùng cho các bệnh nhân không sử dụng được thuốc chống viêm có nguồn gốc hoá dược. Song song với hướng nghiên cứu về các enzym chổng viêm thì các nghiên cứu về dược liệu trên quá trình viêm đã và đang được chú ý. ở nước ta, nhiều dược liệu có tác diing chống viêm tốt. Cây kim ngân là một trong những cây thuốc phổ biến ở Việt Nam có tác dụng chống viêm được sử dụng để điều trị viêm đã được ghi nhận trong nhiều tài liệu. Nhược điếm của dược liệu chống viêm thường chậm và yếu hơn hoá dược chống viêm do vậy để tăng cường khá năng chống viêm chúng tôi đã kết hợp enzym chống viêm với dược liệu, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tác dụng chống viêm saponin kim ngân {Lonicera japónica Thunb. Caprifoliaceae) đối với a- amyiase trong quá trình viêm”. Đe tài được thực hiện nhằm một số mục tiêu: • • • • • 1. Bước đầu tìm hiểu tác dụng dịch chiết saponin toàn phần của cây kim ngân đối với hoạt động của a-amylase trên in vitro. 2. Nghiên cứu tác dụng chổng viêm cấp của dịch chiết saponỉn toàn phần của cây kim ngân khi kết hợp vói a-amylase trên in vivo. Chuong I TỎNG QUAN 1.1 CO SỞ LÝ THUYÉT VÈ VIÊM. Cách đây hơn 2000 năm Celcius đã đặt nền móng quan trọng khi ông đưa ra một khái niệm tổng kết về viêm, với 4 tính chất: sưng, nóng, đỏ, đau. Từ đó, ta thấy viêm không phải là một bệnh cụ thể mà là một biểu hiện bệnh lý nói chung, gặp ở nhiều bệnh khác nhau. Tuy nhiên, Celcius mới nêu các biểu hiện bên ngoài, mang tính chất hình thái của viêm. Galen bổ sung thêm một tính chất mới là viêm gây rối loạn chức năng. Có thể nói viêm là phản ứng của cơ thể tại mô liên kết biểu hiện bằng sự thực bào tại chỗ, có tác dụng loại trừ tác nhân gây viêm và sửa chữa tổn thương; đồng thời kèm theo các biểu hiện bệnh lý. Như vậy, viêm vừa là phản ứng bảo vệ cơ thể chống lại yếu tố gây bệnh, vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối loạn chức năng cơ quan .có thể ở mức độ rất nặng nề, nguy hiểm [2, 202]. 1.1.1 Nguyên nhân gây viêm ♦t* Nguyên nhân bên ngoài. - Sinh vật: Do nhiễm vi khuẩn, vims, ký sinh trùng. -Tác nhân lý hoá học: Chấn thương, nhiệt ( bỏng nóng hoặc bỏng lạnh), bức xạ ion, tác dimg của các hoá chất. Nguyên nhân bên trong. - Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng. - Hình thành phức hợp miễn dịch, sự thay đổi nội sinh chất gian bào [2, 203’. QUÁ TRÌNH VIÊM (Xâm nhập các tác nhân gây viêm) PHẢN ỨNG TẠI CHỎ Giãn , chậm tuần hoàn mao mạch Tăng độ nhớt máu, dò rỉ nội mô Ngưng hồng cầu, đông vón tiểu cầu Giải phóng các chất trung gian hoá học Hình thành cục máu đông Tích tụ fibrin và lắng cặn Tích tụ BC trung tính, lympho Tăng thực bào, phá huỷ mô Tăng enzym huyết thanh Giải phóng enzym lysosom bào tương Tăng sinh và phì đại nội mô PHẢN ỨNG HỆ THỐNG Tăng thân nhiệt Đau Tăng BC hạt, lympho bào Tăng ESR, fibrinogen Tăng protein c hoạt hoá Giảm albumin Tăng a, Ị3, Y globulin Giảm sắt, tăng đồng Tăng glycoprotein Tăng mucoprotein GIAI ĐOẠN TOÀN THẺ THOÁT DỊCH MÀNG TÉ BÀO (Tế bào nội mô, bạch cầu, dưỡng bào, màng trong bào tương) Hình 1.1. Các phản ứng tại chỗ và hệ thống của quá trình viêm [15, 28] 1.1.2. Phân loai viêm. ■ Theo nguyên nhâii: V lêm nhiễm trùng và viêm vô trùng. ■ Theo vị trí: Viêm nông, viêm sâu, viêm ngoài, viêm trong. ■ Theo thành phần dịch ri viêm: Viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ. ■ Theo tính chất: - Viêm đặc hiệu: thường là viêm mạn tính do phản ứng kháng nguyên kháng thể. - Viêm không đặc hiệu: thường là viêm cấp [2, 203-204]. 1.1.3. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm. Trong quá trình viêm, tại ổ viêm và trong cả cơ thể diễn ra hàng loạt các phản ứng theo nhiều giai đoạn khác nhau. Các phản ứng này được tóm tắt như ở hình 1.1. Phản ứng tuần hoàn. Phản ứng này xảy ra rất sớm sau tổn thương và phát triển ở mức độ khác nhau phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương mô và theo trình tự sau: Co mạch chófp nhoáng ở các tiểu động mạch xảy ra ngay khi có tác nhân kích thích. Sau đó là giãn các tiểu động mạch rồi mao mạch và tiểu tĩnh mạch dẫn đến tăng tuần hoàn tại chồ nhằm cung cấp năng lượng cho hoạt động tại ổ viêm (gây nóng và đỏ) và đưa nhiều bạch cầu đến ổ viêm làm nhiệm VỊI bảo vệ. Phản ứng tuần hoàn quá mạnh dẫn tới các rối loạn nghiêm trọng như giãn mạch cục bộ, tăng tính thấm thành mạch làm thoát dịch rỉ viêm, ứ máu, ứ trệ tuần hoàn, thiếu oxy, rối loạn chuyển hoá, tổn thương tổ chức và viêm phát triển toàn diện (biểu hiện lâm sàng là phù và đau) [2, 204- 206]. Phản ứng tế bào. [...]... phần liều l,5g kim ngân/ kg có tác dụng chống viêm cấp trên chuột thực nghiệm Thời điểm cho chuột uống ngay sau khi gây viêm có tỷ lệ ức chế phù cao nhất.Tuy nhiên, chúng tôi chọn thời điểm cho chuột uống sau gây viêm 1 giờ tiến hành thử tác diing chống viêm của saponin kim ngân cuộng toàn phần khi kết hợp với a -amylase để thuận tiện cho việc đánh giá kết quả nghiên cứu 3.2.3 Tác dụng chống viêm cấp của... của cây kim ngân • Thành phần hoá học + Cây chứa tannin và một saponin + Hoa chứa một flavonoid là scolymosid ( lonicerin ) + Lá chứa loganin [11, 633] Năm 2003, Wie Jong Kwar và cộng sự công bố tác dụng chống viêm của saponin cây kim ngân Cũng năm ấy, Jin Tae và cộng sir cho biết hiệu lực chống viêm của cây kim ngân trong bệnh phù chân do chất dẫn truyền receptor 2 kích hoạt proteinase Đồng thời từ cây. .. hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng 11 - Saponin có thể làm chết cá ở những nồng độ rất thấp - Tạo phức với cholesterol hoặc với một só chất 3ß- hydroxy Steroid khác [6, 7] Một số tác dụng của saponin có thể kể đến là: + Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho + Một số saponin có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus + Một số có tác dụng chống ung thư trên thiĩc nghiệm, làm thuốc... hoá và giảm viêm 10 đường hô hấp, sưng phù tại chỗ Một số chế phẩm chống viêm, giảm phù nề như Megamylase (Leurquin Mediolanum), Termamyi iiOL và Fungamyl (Novo) 1.3 CÂY KIM NGÂN • Tên khoa học: Lonicera japónica Thunb thuộc họ kim ngân Caprifoliaceae • Tên gọi khác: Dây nhẫn đông • Bộ phận dùng: + Hoa kim ngân {Flos Lonicera) là hoa phơi hay sấy khô của cây kim ngân + Cành và lá kim ngân {Caiiỉis... vậy, dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần có tác dụng kích thích hoạt tính của a -amylase khi thay đổi nhiệt độ thiiỷ phân 3.1.4 Ảnh hưởng của sự kết hợp các nồng độ a -amylase nưó’ bọt với c dịch chiết saponỉn kim ngân cuộng toàn phần đến hoạt tính của aamylase Để tìm hiểu nồng độ của a- amylase trong nước bọt ở độ pha loãng thích hợp nhất khi kết hợp với dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn... rượu thuốc hoặc hoàn tán Có thể dùng riêng kim ngân hay phối hợp với nhiều vị thuốc khác [11, 633], [4, 77] 13 Chương II NGUYÊN LIỆU VÀ PHU ONG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Kim ngân cuộng Là thân, cành, lá phơi và sấy khô của cây kim ngân: Lonicera japónica Thunb thuộc họ kim ngân Caprifoliaceae Thân, cành, lá cây kim ngân ( Lonicera japónica Thunh .Caprifoliaceae) được thu hái ở thôn Nghĩa... nhiệt độ đối với hoạt tính của a -amylase khi kết hợp với dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần nồng độ l,25mg/ml, thí nghiệm xác định hoạt độ của a -amylase được tiến hành ở các nhiệt độ khác nhau ; 20°, 30‘\ 37^, 50^ trong cùng điều kiện nêu ở phần 2.2.2 Kết quả trình bày ở bảng sau: Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của a- amylase khi kết hợp với dịch chiết saponin kim ngân cuộng... tố bất lợi với cơ thể như gây loét dạ dày, suy thận, chảy máu kéo dài [ 10, 631 ] 1.2.3 a -Amylase • Sơ lược về enzym chống viêm Các enzym có tác dụng chống viêm như: serratiopeptidase, achymotĩypsin, chymopapain, a -amylase được sử dụng ngày càng rông rãi Các enzym này có ưu điểm là những chất gần gũi với cơ thể con người đã phần nào giảm được tác dụng không mong muốn của các thuốc chống viêm 8 steroid... gây viêm ) là 0% 30 60 n 50 -i8.1 36.7 £ 40a ^o < JZ 30o o 20 . năng chống viêm chúng tôi đã kết hợp enzym chống viêm với dược liệu, tiến hành đề tài: Nghiên cứu tác dụng chống viêm saponin kim ngân {Lonicera japónica Thunb. Caprifoliaceae) đối với a- amyiase. NỘI TRẦN THỊ DUNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM SAPONIN KIM NGÂN {LONICERA JAPONICA THUNB. CAPRIFOLIACEAE) ĐỐI VỚI a - AMYLASE (Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học khoá 2001 - 2006) Người hướng. 28 3.2.2. Tác dụng ức chế phù của dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần theo thời gian uống thuốc 30 3.2.3. Tác dụng chống viêm cấp của dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần, a-amylase