Nghiên cứu tác dụng chống viêm của dịch chiết cây kim ngân ( lonicera japonica thunb caprifoliaceae ) kết hợp với anpha amylase

Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm.. Chúng là những chất gần gũi với cơ thể, ít gây những ảnh hưởng xấu tới cơ thể, phần nào

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

BÙI THỊ NGỌC THỰC

NGHIÊN cúu TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA DỊCH CHIÉr■ ■

KÍT HỢP VỚI ALPHA- AMYLASE ■

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ KHOÁ 1999 -2004)

Người hướng dẫn: - ThS Lê Thị Diễm Hồng

- GS.TS Nguyễn Xuân Thắng Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá sinh - Trường ĐH Dược HN Thời gian thực hiện: 2/2004 - 5/2004

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn õẫu 5ấc nhất tái G S.Tô Nguyễn Xuân Thắng-

Chủ nhiệm Ỉ3Ộ môn Hoá ôinh Trường Đạ\ học Dược Hà nội và Th.5 Lê Thị Diễm

Hẩng - Giảng viên Bộ môn Hoá ỡinh đẵ tận tình hướng dấn, giúp (đỡ tôi trong

suôt (\uá trình học tạ p và ngiên cứu khoa học.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thây cô giáo dẵ trực tiếp truyêVi đạ t cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tạ i

trường Tôi cũng xin cảm ơn eự giúp đỡ và tạo điều kiện tố i đa của cắc thầy cô giáo và các cô kỹ th u ậ t viên 3Ộ môn Hoá ỗinh Trường Đại học Dược Hà nội cho

tôi trong quá trình học tạp và thực hiện khoá luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn đến cha mẹ, những người thân và bạn bè dã luôn động viên cổ vũ vằ giúp đỡ tôi trong quá trình học tệp và hoàn thành luân

văn t ố t nghiệp.

Hà nội, tháng 5 năm 2004

Sinh viền: Bùi Thị Ngọc Thực

u Đơn vị hoạt độ enzym

Vmax Tốc độ cực đại của phản ứng enzym

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đ ề 1

Chương I: Tổng quan 3

1.1 Cơ sơ lý thuyết về viêm 3

1.2 Các thuốc chống viêm 6

1.3 Cây kim ngân 9

Chương II: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu .12

2.1 Nguyên liệu 12

2.2 Súc vật thí nghiệm 14

2.3 Thiết bị dụng cụ 14

2.4 Hoá chất thí nghiệm 14

2.5 Phương pháp nghiên cứu 15

Chương n i: Thực nghiệm và kết q u ả 19

3.1 Ảnh hưởng của dịch chiết ũavonoid kim ngân toàn phần đối với hoạt tính của a-amylase 19

3.2 Kết quả thử tác dụng trên in vivo 25

Chương IV: Bàn luận .29

Kết luận và đề xuất 32 Tài liệu tham khảo

ĐẶT VÂN ĐỂ

Viêm là một bệnh lý rất phổ biến, gặp ở nhiều bệnh, do nhiều nguyên nhân gây ra Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn đến những rối loạn chức năng của các cơ quan, bộ phận của cơ thể, gây ra nhiều ảnh hưởng xấu, có khi nguy hiểm tới tính mạng của người bệnh Vì vậy, việc ngăn ngừa các yếu tố có hại của viêm là rất cần thiết và quan trọng

Từ nhiều năm nay, các loại thuốc chống viêm có nguồn gốc hóa dược

đã ra đời và được ứng dụng rộng rãi như: thuốc có cấu trúc steroid và thuốc chống viêm phi steroid Các thuốc này có ưu điểm là tác dụng tốt và đạt hiệu quả cao trong việc hạn chế và ngăn chặn quá trình viêm Tuy nhiên, chúng có nhiều yếu tố bất lợi đối với cơ thể như: suy giảm miễn dịch, xốp xương, teo

cơ, loét dạ dày tá tràng, ảnh hưởng tới quá trình đông máu, tạo máu

Chính vì vậy, việc sử dụng các enzym nội sinh có tác dụng chống viêm cũng được coi trọng như a-chymotrypsin, papain, serratiopeptidase, a- amylase Chúng là những chất gần gũi với cơ thể, ít gây những ảnh hưởng xấu tới cơ thể, phần nào khắc phục được nhược điểm của nhóm thuốc chống viêm steroid và phi steroid, nhất là chúng có thể dùng cho các bệnh nhân không sử dụng được thuốc chống viêm có nguồn gốc hóa dược

Song song với hướng nghiên cứu về các enzym chống viêm thì các nghiên cứu về dược liệu trên quá trình viêm đã và đang được chú ý Ở nước ta

có nhiều loại dược liệu có tác dụng chống viêm tốt Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy nhóm hoạt chất xuất hiện nhiều trong các dược liệu có khả năng chống viêm là các ílavonoid Cây kim ngân là một trong những cây thuốc phổ biến ở Việt nam có thành phần là Aavonoid được dùng như một vị thuốc chống viêm, chống dị ứng và giải độc

Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

"Nghiên cứu tác dụng chống viêm của dịch chiết cây kim ngân (Lonicera japonica Thunb Caprỉfoliaceae) kết họp với alpha- amylase "

Đề tài được thực hiên nhằm một số mục tiêu:

1 Bước đầu tìm hiểu tác dụng của dịch chiết ílavonoid toàn phần của cây kim ngân đối với hoạt động của a-amylase trên in vitro

2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của dịch chiết Aavonoid toàn phần của cây kim ngân khi kết hợp với a-amylase trên in vivo

Chương I TỔNG QUAN

1.1 c ơ s ở LÝ THUYẾT VỂ VIÊM

Viêm là quá trình bệnh lý rất nguy hiểm, vì :

- Có vô số yếu tố cụ thể có thể gây viêm

- Bất cứ cơ quan và mô nào cũng có thể bị viêm

Cách đây hơn 2000 năm Celcius đã đặt nền móng quan trọng khi ông đưa ra một khái niệm tổng kết về viêm, với 4 tính chất : sưng, nóng, đỏ, đau

Từ đó, người ta thấy viêm không phải là một bệnh cụ thể mà là một biểu hiện bệnh lý nói chung, gặp ở nhiều bệnh khác nhau Tuy nhiên, Celcius mới nêu các biểu hiện bên ngoài, mang tính chất hình thái của viêm Galen bổ xung thêm một tính chất mới là viêm gây rối loạn chức năng

Tóm lại, có thể nói viêm là phản ứng của cơ thể tại mô liên kết biểu hiện bằng sự thực bào tại chỗ, có tác dụng loại trừ tác nhân gây viêm và sửa chữa tổn thương; đồng thời kèm theo các biểu hiện bệnh lý

Như vậy, viêm vừa là một phản ứng bảo vệ cơ thể chống lại yếu tố gây bệnh, vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối

loạn chức năng cơ quan có thể ở mức độ rất nặng nề, nguy hiểm [2, 202].

1.1.1 Nguyên nhân gây viêm

* Nguyên nhân bên ngoài

- Do nhiễm khuẩn, virút, ký sinh trùng, các sản phẩm chuyển hoá, kháng nguyên ngoại lai

-Tác nhân lý, hoá học: Chấn thương, nhiệt, bức xạ ion, tác dụng của acid, kiềm, các hoá chất

* Nguyên nhân bên trong

- Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng

- Hình thành phức hợp miễn dịch, sự thay đổi nội sinh chất giao bào [10, 6]

1.1.2 Phân loại viêm

* Theo nguyên nhân: Viêm nhiễm trùng và viêm vô trùng

* Theo vị trí: Viêm nông, viêm sâu, viêm ngoài, viêm trong

* Theo thành phần dịch rỉ viêm: Viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ

* Theo tính chất:

- Viêm đặc hiệu: thường là viêm mãn tính do phản ứng kháng nguyên kháng thể

- Viêm không đặc hiệu: thường là viêm cấp [2, 203]

1.1.3 Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm.

Trong quá trình viêm, tại ổ viêm và trong cả cơ thể diễn ra hàng loạt các phản ứng, theo nhiều giai đoạn khác nhau Các phản ứng này được tóm tắt như

ở hình 1.1:

QUÁ TRÌNH VIÊM

(Xâm nhập các tác nhân gây viêm )

PHẢN ỨNG TẠI CHỖ

Giãn, chậm tuần hoàn mao mạch

Tăng độ nhớt máu, dò rỉ nội mô

Ngưng hồng cầu, đông vón tiểu cầu

Giải phóng các chất trung gian hoá học

Hình thành cục máu đông ^1

Tích tụ BC trung tính, lympho

Tăng thực bào, phá huỷ mô

Tăng enzym huyết thanh

Giải phóng enzym lysosom bào tương

Tăng sinh và phì đại nội mô

Tăng a, p, Y globulin Giảm sắt, tăng đồng Tăng glycoprotein Tăng mucoprotein

THOÁT DỊCH MÀNG TÊ BÀO

(Tế bào nội mô, bạch cầu, dưỡng bào, màng trong bào tương)

Hình 1.1.Các phản ứng tại chỗ và hệ thông của quá trình viêm [16,28].

1.2 CÁC THUỐC CHỐNG VIÊM

1.2.1 Thuốc chống viêm steroid.

Là nhóm thuốc có cấu trúc giống với các hormon steroid của vỏ thượng thận như hydrocortison, prednisolon, dexamethason, betamethason Nhóm thuốc này ức chế phospholipase A2 thông qua kích thích tổng hợp lipocortin,

do đó làm giảm tổng hợp leucotrien và prostaglandin, nên có tác dụng chống viêm Các thuốc này có tác dụng chống viêm do mọi nguyên nhân cơ học, hoá học, miễn dịch và nhiễm khuẩn Tuy nhiên, chúng có nhiều tác dụng phụ đối với cơ thể như loét dạ dày- tá tràng, loãng xương, xốp xương, teo cơ, suy thượng thận cấp khi dừng đột ngột [13, 632]

1.2.2 Thuốc chống viêm phi steroid

Là nhóm thuốc chống viêm nhưng không có cấu trúc steroid như aspirin, indomethacin, piroxicam, diclofenac, Cơ chế chống viêm của nhóm thuốc này là ức chế enzym cyclooxygenase (COX) nên làm giảm sự tổng hợp prostaglandin Bên cạnh hiệu quả đạt được trong lâm sàng thì nhóm thuốc này cũng có nhiều yếu tố bất lợi đối với cơ thể như gây loét dạ dày, suy thận, chảy máu kéo dài [13, 631]

1.2.3 Amylase

• Một số nghiên cứu về enzym chống viêm.

Các enzym có tác dụng chống viêm như a-chymotrysin, serratiopeptidase, chymopapain, a-amylase được sử dụng ngày càng rộng rãi Bên cạnh các thuốc chống viêm steroid và phi steroid, các enzym có ưu điểm là những chất gần gũi với cơ thể con người đã phần nào giảm được các tác dụng không mong muốn Mặc dù có nguồn gốc, cấu tạo và cơ chất khác nhau, nhưng các enzym này đều có khả năng chống viêm trên cả động vật thực nghiệm và người Cơ chế tác động của các enzym này còn chưa thực sự làm sáng tỏ, tuy nhiên chúng đã đạt hiệu quả cao trong các chỉ định chống

viêm, giảm phù nề và sử dụng hỗ trợ trong các bệnh lý viêm nhiễm đường hô hấp, giảm tiết dịch nhầy, ức chế dịch rỉ viêm.

glicozid ở giữa chuỗi polysaccharid tạo thành dextrin phân tử thấp Dưới tác

dụng của enzym này, dung dịch tinh bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu với iod và bị giảm độ nhớt mạnh a-Amylase bền với nhiệt nhưng kém bền với acid

> P-amylase có nhiều ở hạt, củ thực vật Nó xũc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết l,4-glycozid từ đầu không khử tạo thành chủ yếu maltose và dextrin phân tử lớn Ị3-amylase mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°c, nhưng bền với acid hơn a-amylase

> Glucoamylase có nhiều ở vi sinh vật, gan động vật Nó xúc tác cho phản

ứng thuỷ phân liên kết 1,4- và 1,6- glycozid bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polysaccharid sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin Nó bị mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°c Glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3,5-5,5 [8, 78].

a-amylase nước bọt là thành phần chính của nước bọt có nhiều chức năng trong khoang miệng, Trong hệ thống tiêu hoá, đây là enzym có vai trò chủ yếu ở giai đoạn đầu của qúa trình sinh ra các oligosaccharid:

a-amylase a-amylase

Tinh b ộ t - ► Oligosaccharid -► Maltose + Glucose

a-amylase có pH tối ưu khoảng 7,0 giống hầu hết các protein và các enzym khác Nếu pH quá thấp thì nó chuyển thành dạng proton và mất hiệu lực a-amylase bị ức chế bởi sự có mặt của ure và các amid khác Nếu trong

máu nồng độ acid cao hoặc có mặt các amid thì tỷ lệ enzym giảm xuống dẫn đến Vmax và Km tăng cao a-amylase được kích hoạt bởi sự có mặt của anion Cl' Anion này rất cần cho sự có mặt của enzym này Nó gắn vào vị trí hoạt động của enzym và kích thích sự thay đổi cấu trúc cho phép enzym tiến hành phá vỡ tinh bột hoặc glycogen.

• Cấu trúc của a-amylase

a-amylase là một glycoprotein gồm 1 chuỗi polypeptid đơn với khoảng

496 acid amin có 2 nhóm SH và 4 liên kết disulíid và 1 ion Ca2+ Nó chứa một lượng lớn acid amin có mùi thơm (tryptophan 5,3%, tyrosin 5,5%) và a- amylase chứa nhiều acid amin có nhóm OH (threonin + serin, 9,5%) và mang đặc tính riêng của nhóm acid hay dạng amid

a-amylase giống như hầu hết các protein và các enzym khác đều có

chứa những chuỗi xoắn a và chuỗi thẳng (3 Những cấu trúc thứ cấp này gắn chặt với nhau bằng liên kết hydro

Cấu trúc sơ cấp của a-amylase gồm một phần chính của chuỗi xoắn và chuỗi thẳng liên kết với nhau Hai chuỗi này nối với nhau bằng cách sắp xếp những acid amin thấm nước thành những đường vòng và những vòng xoắn mà hầu hết là valin, prolin, glycin Glycin cũng có mặt vì góc liên kết nhận một dãy giá trị để không gây ra mâu thuẫn không gian giữa các nguyên tử trên bề

mặt chuỗi và những nguyên tử ở khung chính Cấu trúc sơ cấp còn chứa một

lượng lớn acid aspartic và glutamic (là những chất làm cho cấu trúc sơ cấp gắn kết hơn) và đây được coi là chỉ điểm của cấu trúc liên kết sơ cấp bởi vì các acid amin này tạo điều kiện thuận lợi cho liên kết hydro [15]

• Tác dụng của a-amylase.

a-amylase được dùng trong các sản phẩm tiêu hoá thức ăn có chứa tinh bột và biến đổi tinh bột thành đường lên men trong công nghiệp làm bánh và công nghiệp lên men

a-amylase từ các nguồn khác nhau được sử dụng như một thành phần của các chế phẩm enzym tiêu hoá và được sử dụng theo đường uống để giảm viêm đường hô hấp và sưng phù tại chỗ Một số chế phẩm chống viêm, giảm phù nề như Maxilase (Sanoíi-Synthelabo), Megamylase (Leurquin Mediolanum) [18, 1549].

1.3 CÂY KIM NGÂN

• Tên khoa học: Lonỉcera japonica Thunb., thuộc họ kim ngân

+ Cây chứa tanin và một saponin ĩ

+ Hoa chứa một Aavonoid là scolymosid (lonicerin) có cấu tạo luteolin-

7-rutinosid (-caroten, -cryptoxanthin, auroxanthin)

• Một số đặc điểm của nhóm hoạt chất ílavonoid:

Flavonoid là nhóm hoạt chất thường gặp trong thực vật, gặp nhiều trong nhiều loại cây cỏ khác nhau Cho đến nay khoảng 3000 Aavonoid đã được xác định cấu trúc Phần lớn ílavonoid có mầu vàng hoặc xanh Đây là một nhóm hoạt chất có nhiều tác dụng sinh học quan trọng

Các Aavonoid có tác dụng sinh học gọi chung là bioAavonoid Tác dụng sinh học của bioílavonoid rất đa dạng, trên nhiều cơ quan và hệ cơ quan khác nhau với hiệu quả khá rõ rệt Một số tác dụng của biollavonoid có thể kể đến là:

Flavonoid có khả năng điều hoà làm giảm tính thấm thành mạch, chống lại hiện tượng thoát dịch ra khỏi lòng mạch

Flavonoid có khả năng tiêu diệt gốc tự do Giả thiết cho rằng, khi vào cơ thể ílavonoid tạo thành các gốc tự do bền vững ít hoạt động hơn các gốc tự do hình thành trong quá trình viêm, ung thư .Từ đó, các ílavonoid thể hiện được các chức năng chống viêm và bảo vệ tế bào gan Flavonoid ngăn cản sự oxy hoá màng tế bào gan dẫn đến ngăn chặn quá trình huỷ hoại cấu trúc và chức năng của gan, ngăn cản sự hoại tử mô và sự phân huỷ phospholipid màng

tế bào

Flavonoid có tác dụng ức chế enzym cyclooxygenase và lipoxygenase

là enzym xúc tác sự tổng hợp các prostaglandin từ phospholipid Điều này góp phần giải thích cơ chế chống viêm và chống dị ứng của các chất Aavonoid và các dược liệu chứa Aavonoid Flavonoid có khả năng hoạt hoá enzym histaminase và một số enzym khác để hạn chế sự giải phóng histaminase và các chất trung gian khác trong cơ thể gây ra hiện tượng viêm nhiễm, dị ứng, choáng phản vệ [12, 11-18]

• Tác dụng dược lý của cây kim ngân:

+ Tác dụng kháng khuẩn: Kim ngân có phổ kháng khuẩn rộng Nước sắc hoa kim ngân có tác dụng ức chế rất mạnh đối với liên cầu khuẩn, tụ cầu

khuẩn, vi khuẩn thương hàn, trực khuẩn lỵ Shigella, trực khuẩn lỵ coli, phế cầu khuẩn Nước sắc lá kim ngân vói nồng độ 1,2-20% có tác dụng ức chế trực khuẩn lỵ Shigella, 5-20% ức chế vi trùng phó thương hàn A, 100% ức chế tụ cầu khuẩn.

+ Tác dụng trên đường huyết: Sau khi cho thỏ uống nước sắc hoa kim ngân thì lượng đường huyết tăng, hiện tượng này kéo dài 5-6 giờ mới trở lại bình thường

+ Tác dụng ngăn chặn choáng phản vệ: Năm 1966, Đỗ Tất Lợi, Bùi Năng An và Bùi Chí Hiếu (Hội nghị thuốc nam lần thứ 4, Hà Nội) đã báo cáo nước sắc kim ngân có khả năng ngăn chặn choáng phản vệ trên chuột lang: Khi cho chuột uống nước sắc kim ngân, không thấy có sự thay đổi đáng kể số lượng và hoạt tính tế bào hạt (mastocytes) ở màng treo ruột của các súc vật này Hàm lượng histamin ở phổi chuột lang bị choáng phản vệ lớn hơn 1,5 lần chỉ số này ở chuột lang bình thường hoặc ở chuột uống nước sắc kim ngân trước khi gây choáng phản vệ

+ Độ độc: Cũng theo các tác giả trên, cho chuột nhắt trắng uống nước sắc kim ngân trong thời gian 7 ngày với liều gấp 150 lần liều điều trị cho người (tính theo gam thể trọng), không dẫn đến sự thay đổi đáng kể trong phủ tạng và 100% chuột sống sót Điều này chứng tỏ rằng nước sắc kim ngân thực

tế không độc

• Công dụng và liều dùng:

+ Công dụng: Thường dùng trị mụn nhọt, ban sởi, mày đay, lở ngứa, nhiệt độc, tả lị, ho do phế nhiệt Người ta còn dùng kim ngân trị dị ứng (viêm mũi dị ứng và một số trường hợp dị ứng khác) và trị thấp khớp

+ Liều dùng: Ngày dùng 4-15g hoa hay 10-16g cành lá dưới dạng thuốc sắc, hãm, cao, rượu thuốc hoặc hoàn tán Có thể dùng riêng kim ngân hay phối hợp với nhiều vị thuốc khác [7, 76-77]

Chương II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 NGUYÊN LIỆU.

2.1.1 Cây kim ngân.

Là phần trên mặt đất phơi và sấy khô của cây kim ngân: Lonicera

ịaponica Thunb., thuộc họ kim ngân Capriỷoliaceae.

Nguyên liệu trên được mua tại các cơ sở mua bán dược liệu, đối chiếu theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt nam III [5, 394-395]

2.1.2 Flavonoid kim ngân toàn phần.

Để có được ílavonoid toàn phần từ cây kim ngân trong nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành chiết tách ílavonoid toàn phần từ cây kim ngân theo

quy trình tóm tắt như sau: Dược liệu được sấy ở 60-65°C trong tủ sấy một giờ,

đem tán nhỏ thành bột Sau đó cân 500g bột dược liệu, chiết theo phương pháp ngấm kiệt với cồn 70° Dịch chiết thu được đem cô cách thuỷ đến cắn Hoà tan cắn trong 500 ml nước cất, lọc loại tạp Dịch lọc cho vào bình gạn lắc với ether đầu hoả cho đến khi dịch chiết ether không màu Đun cách thuỷ dịch chiết nước 15 phút để loại hết ether Tiếp tục lắc dịch chiết với cloroíorm trên bình gạn cho đến khi dịch chiết cloroíorm không màu Đun cách thuỷ dịch chiết nước 15 phút để loại hết cloroíorm Dịch nước cho vào bình gạn, chiết bằng ethyl acetat, gộp dịch chiết ethyl acetat, cô cách thuỷ hết dung môi ethyl acetat, thu được cắn Aavonoid toàn phần Quy trình được thực hiện có thể mô

tả như sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình chiết tách ýlavonoid toàn phần từ kim ngân

2.1.3 a-amylase.

Nước bọt người được pha loãng ở các nồng độ khác nhau để tiến hành

thử trên in vitro

Viên nén bao phim Maxilase của hãng Sanoíi-Synthelabo có chứa a- amylase có hàm lượng 3000 Ư dùng để tiến hành thử trên in vivo.

2.1.4 Dung dịch cơ chất tinh bột 1% pH= 6,8.

Dung dịch đệm phosphat pH=6,8

Dinatri hydrophosphat 28,8g Kali dihydrophosphat 11,45 gNước cất vừa đủ 1000 mlDung dịch tinh bột 1%: Hoà lg tinh bột trong 5-10 ml nước lạnh rồi đổ dần lOml dung dịch đệm phosphat pH= 6,8 đang sôi vào, tráng cốc bằng một

ít nước lạnh Tiếp tục đun sôi trong 1 phút rồi để nguội ở nhiệt độ phòng

Thêm nước cất vừa đủ lOOml Bảo quản ở tủ lạnh Chuẩn bị dung dịch tinh

- Máy điều nhiệt

- Dụng cụ đo thể tích chân chuột

- Cân phân tích và cân kỹ thuật Sartorius

2.4 Hoá chất thí nghiệm.

Thuốc thử Gomall [14 ,223]

Dung dịch HCL 0,1N

Dung dịch iod phân tích

Dung dịch iod gốc:

Kali iodua 5,0gNước cất vừa đủ 200mlDung dịch Iod phân tích:

Dung dịch iod gốc 2mlDung dịch HCL 0,1N vừa đủ lOOml

2.5 Phương pháp nghiên cứu.

2.5.1 Phương pháp định lượng protein nước bọt bằng phản ứng biure.

Lắc và để 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đem đo quang ở bước sóng

550nm, cuvet lcm, mẫu trắng là ống 1 Vẽ biểu đồ: Trục hoành ghi lượng albumin (mg), trục tung ghi mật độ quang học (D)

• Định lượng protein của nước bọt Tiến hành như sau:

Bảng 2.2 Thể tích các thuốc thử để định lượng proteỉn của nước bọt.

Dung dịch nước bọt (ml) 1,0 0

Dung dịch NaCl 0,9% (ml) 0 1,0