Góp phần tìm hiểu tác dụng chống viêm của hoa cây kim ngân (lonicera japonica thump caprioliaceae) kết hợp với anpha chymotrysin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ■ ■ ■ BỘ Y TÊ a TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI ■ ■ ■ ■ LÊ THỊ DIỄM HỒNG ■ GÓP PHẤN TìM HIểU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA HOA CÂY KIM NGÂN {LON/CERA JAPON/CA THUNB CAPRIFOLIACEAE) KẾT HỢP VỚI alpha-CHYMOTRYPSIN CHUYÊN NGÀNH Dược LÝ-DƯỢC LÂM SÀNG MÃ Số: 03.02.02 LUẬN VĂN THẠC SỸ Dược HỌC ■ ■ ■ ■ Người hướng dẫn khoa học: X ~ ' - N PGS TS NGUYỄN XUÂN THắ NG / 'v\ : iề f f , J ệ § ù ; X' ' x - /ậ' s ^ HÀNỘI-2002 '}Jíìi xin /à y tỏ /òiưỵ fiêf (ỉn ưĩrt iịắc (ới &*8iSP &ĨP J\fỹuyẽn 0Cuđn (€ỉtử nỉtìêm fn ■J/Ì(ì mên 'lJfố íũn/t, an/i, r/ti, /tan /tè ffmty nyỉtiêịt fỉã đơìiỹ triền, ạiú/t nỉtiêt ũii/t h o ' tânỉt ỉtcc t(à // rớ- /tiên đê tài ■f{(f jVfii Hựày J5 //tány J nãnt 2002 (Ê íf tyê 'JJỈÙ (J}-iẽm yfo tty KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT a-CT a-chymotrypsin BC Bạch cầu cox Cycloxygenase ESR Erythrocyte sedimentation rate (Tốc độ lắng hồng cầu) FKNH Flavonoid kim ngân hoa IL Interleukin INF Interferon KNH Kim ngân hoa NSAID Non-steroid anti-inflammatory drug (Thuốc chống viêm phi steroid) PAF Platelet activating factor (Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu) TNF Tumor necrosis factor (Yếutố hoại tử khối u) MỤC LỤC Mở đ ầu .1 Chương 1: Tổng quan 1.1 Cơ sở lý thuyết viêm .3 1.2 Một số nghiên cứu enzym chống viêm 12 1.3 Dược liệu có tác dụng chống viêm 15 Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên u 21 2.1 Nguyên liệu 21 2.2 Súc vật thí nghiệm .23 2.3 Thiết bị dụng cụ 23 2.4 Hố chất thí nghiệm 24 2.5 Phương pháp nghiên cứu 24 Chương 3: Thực nghiệm kết 29 3.1 Ảnh hưởng nước sắc kim ngân hoa đối vói hoạt tính occhymotrypsin .29 3.2 Ánh hưởng Serin đối V(5i hoạt tính a-chymotrypsin .38 3.3 Ảnh hưởng dịch chiết flavonoid kim ngân hoa tồn phần hoạt tính a-chym otrypsin 39 3.4 Kết thử tác dụng chống viêm cấp nghiên cứu 46 3.5 Kết theo dõi biến đổi mộtsố số hoá s in h 49 Chương 4: Bàn luận 56 Kết luận đề xuất 62 Tài liệu tham khảo 64 MỞ ĐẦU Viêm trình bệnh lý phổ biến, gặp nhiều bệnh, nhiều nguyên nhân gây Nhìn chung, viêm phản ứng bảo vệ thể, giúp thể chống lại tác nhân gây viêm Tuy nhiên, viêm nặng kéo dài dẫn đến rối loạn chức quan, phận thể, gây nhiều ảnh hưởng xấu, có nguy hiểm tới tính mạng người bệnh Vì vậy, việc phát huy tác dụng bảo vệ ngăn ngừa yếu tố có hại viêm cần thiết quan trọng Việc nghiên cứu, ứng dụng loại thuốc chống viêm thuốc có cấu trúc steroid, thuốc chống viêm phi steroid (NSAID) nhằm hạn chế trình viêm đáp ứng yêu cầu Các thuốc đa phần có nguồn gốc hoá dược, sử dụng từ nhiều năm Bên cạnh tác dụng chống viêm đa dạng hiệu quả, chúng chứa đựng yếu tố bất lợi thể gây suy giảm miễn dịch, xốp xương, kích ứng đường tiêu hố, ảnh hưởng tới q trình đơng máu, tạo máu Chính vậy, thuốc chống viêm có chứa enzym protease (papain, a-chymotrypsin) chế tạo từ chất gần gũi với thể người nghiên cứu Các protease có vai trò quan trọng điều trị kích thích tiêu hố, chống viêm phần khắc phục nhược điểm nhóm thuốc Bên cạnh đó, nước ta lại có nguồn dược liệu phong phú đa dạng góp phần vào việc nghiên cứu thuốc chống viêm Nhiều cơng trình nghiên cứu tác dụng dược liệu cho thấy nhóm hoạt chất xuất nhiều dược liệu có khả chống viêm flavonoid Cây kim ngân thuốc phổ biến Việt nam, có thành phần flavonoid, dùng loại thuốc chống viêm, chống dị ứng giải độc Trên sở đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Góp phần tìm hiểu tác dụng chống viêm hoa kim ngân (Lonicera japonica Thunb Caprifoliaceae) kết hợp với achymotrypsin Đ ề tài thực nhằm sô mục tiêu sau: Bước đầu tìm hiểu tác dụng kim ngân hoa a-chymotrypsinJjẽn in vitro Tìm hiểu tác dụng chống viêm kim ngân hoa kết hợp với otchymotrypsin in vivo Theo dõi biến đổi số số hố sinh q trình viêm tác dụng kim ngân hoa dùng đơn độc phối hợp với a chymotrypsin Chương TỔNG QUAN 1.1 c s LÝ THUYẾT VỂ VIÊM Theo Ado (1973), viêm phản ứng chỗ mạch máu, tổ chức liên kết hệ thần kinh tác nhân gây bệnh có liên hệ với tính phản ứng thể Theo Vũ Triệu An số tác giả khác viêm phản ứng bảo vệ thể mà tảng phản ứng tế bào, phản ứng hình thành phát triển phức tạp dần q trình tiến hố sinh vật [4, 68] 1.1.1 Nguyên nhân gây viêm 1.1.1.1 Nguyên nhân bên - Sinh vật: Do nhiễm vi khuẩn, virus, ký sinh trùng -T ác nhân lý hoá học: Chấn thương, nhiệt (bỏng nóng hoặcbỏng lạnh), xạ ion, tác dụng acid, kiềm, hoá chất [4, 68] 1.1.1.2 Nguyên nhân bên - Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng - Hình thành phức hợp miễn dịch, thay đổi nội sinh chất gian bào [12, 6-8] 1.1.2 Phân loại viêm - Theo nguyên nhân: viêm nhiễm trùng viêm vơ trùng - Theo vị trí: viêm nơng, viêm sâu viêm bên viêm bên - Theo thành phần dịch rỉ viêm: viêm dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ - Theo tính chất: + Viêm khơng đặc hiệu, thường viêm cấp + Viêm đặc hiệu, thường viêm mạn tính, hậu phản ứngkháng nguyên-kháng thể [4, 69] 1.1.3 Các phản ứng xảy trình viêm Trong trình viêm, ổ viêm thể diễn hàng loạt phản ứng, theo nhiều giai đoạn khác Các phản ứng tóm tắt hình 1.1 QUÁ TRÌNH VIÊM (Xâm nhập tác nhân gây viêm) PHẢN ÚNG TẠI CHỖ PHẢN ỨNG HỆ THỐNG Giãn, chậm tuần hoàn mao mạch Tăng thân nhiệt Tăng độ nhớt máu, dò rỉ nội mơ Đau Ngưng hồng cầu, đơng vón tiểu cầu Tăng BC hạt, lympho bào Giải phóng chất trung gian hố học Tăng ESR, fibrinogen Hình thành cục máu đơng (2) Tăng protein c hoạt hố Tích tụ fibrin lắng cặn Giảm albumin Tích tụ BC trung tính, lympho Tăng a , |3, Y globulin Tăng thực bào, phá huỷ mô Giảm sắt, tăng đồng Tăng enzym huyết Tăng glycoprotein Giải phóng enzym lysosom bào tương Tăng mucoprotein (Tế bào nội mô, bạch cầu, dưỡng bào, màng bào tương) Hình 1.1 Các phản ứng chỗ hệ thống trình viêm [26,28] 1.1.3.1 Các phản ứng ổ viêm ♦> Phản ứng tuần hoàn: Phản ứng xảy sớm sau tổn thương phát triển mức độ khác nhau, phụ thuộc vào trầm trọng tổn thương mơ theo trình tự sau: • Co mạch chớp nhoáng xuất tiểu động mạch, xảy có tác nhân kích thích, hưng phấn thần kinh co mạch trơn bị kích thích [4, 69] • Sau co mạch chớp nhoáng tiểu động mạch tượng giãn mạch Đầu tiên giãn tiểu động mạch mao mạch tiểu tĩnh mạch dẫn đến tăng tuần hoàn chỗ nhằm cung cấp lượng cho hoạt động ổ viêm (gây nóng đỏ) đưa nhiều bạch cầu tới ổ viêm làm nhiệm vụ bảo vệ Nguyên nhân tượng giãn mạch yếu tố sau: Hưng phấn thần kinh giãn mạch; yếu tố thể dịch sinh ổ viêm histamin, bradykinin, leucotrien; cytokin (IL-1, TNF, INF-y ); sợi liên kết vùng mao mạch tiểu động mạch bị tổn thương [4, 70], [12, 53] • Phản ứng tuần hồn q mạnh dẫn tới rối loạn nghiêm trọng giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây tăng tính thấm thành mạch làm thoát dịch rỉ viêm giầu protein vào mô quanh huyết quản Do chèn ép dịch rỉ viêm số yếu tố mạch máu liệt thần kinh vận mạch, tế bào nội mạc sưng to, tăng độ nhớt máu gây ứ máu làm tuần hoàn từ động mạch sang tĩnh mạch, thiếu oxy, gây rối loạn chuyển hoá nghiêm trọng, làm tổn thương tổ chức viêm phát triển toàn diện (biểu lâm sàng phù đau) [4, 70] ♦♦♦ Phản ứng tế bào: Phản ứng tế bào phản ứng phản ánh khả bảo vệ thể chống viêm, phản ứng bạch cầu đóng vai trò quan trọng Hoạt động bạch cầu ổ viêm gồm hai tượng xảy • Bạch cầu mạch: Khi dòng máu chảy chậm, bạch cầu tách khỏi dòng trục lăn chậm theo vách mao mạch tiểu tĩnh mạch dừng lại điểm gọi vách tụ bạch cầu Dưới tác dụng chất trung gian hoá học yếu tố hoại tử u (TNF), interleukin-1 (IL-1), yếu tố giãn mạch prostacyclin (PGIo), yếu tố giãn nguồn gốc nội mô (Endothelium-Derived Relaxing Factor, EDRF), bạch cầu tăng khả bám dính vào tế bào nội mơ Sự tương tác ban đầu L-selectin bề mặt bạch cầu p, E-selectin bề mặt tế bào nội mô định Quá trình tăng cường integrin bề mặt bạch cầu với phần tử kết dính nội bào ICAM (Intracellular Adhension Molecule) tế bào nội mô [23, 1453] Sau dính vào tế bào nội mơ, bạch cầu chuyển động nhẹ dọc theo bề mặt nội mô, luồn chân giả vào kẽ hở tế bào nội mô Chúng xuyên qua vùng nối dãn rộng tế bào nội mô để xen vào tế bào nội mơ màng đáy, từ vào khoảng gian bào mao mạch [29, 351-354] Hiện tượng bạch cầu di chuyển tới ổ viêm gọi tượng hoá ứng động Tác dụng ổ viêm có số chất có tác dụng gây hoá ứng động: sản phẩm vi khuẩn (các peptid có acid amin tận Nformyl-methionin), thành phần hệ thống bổ thể bị hoạt hoá (C3a, C5a, C5b, 6, 7), sản phẩm chuyển hóa acid arachidonic theo đường lipoxygenase hoá (đặc biệt leucotrien B4), cytokin, mảnh vụn sợi tạo keo sản phẩm phân huỷ tế bào, fibrin sản phẩm phân huỷ fibrin [1,252], [12, 64] • Thực bào hạt: Thực bào tượng bạch cầu nuốt tiêu huỷ đối tượng thực bào Tại ổ viêm, bạch cầu hoạt hoá hoạt hoá, khả thực bào chúng tăng lên rõ rệt Từ số liệu bảng 3.19, tiến hành xem xét biến đổi tỷ lệ thành phần protein lô chuột thí nghiệm Tỷ lệ thành phần Albumin, Globulin a , p, Y lô chuột gây viêm (không dùng thuốc) giữ mức tương đương so với lô chuột bình thường (sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05) Xét lô chuột thử thuốc cho thấy tỷ lệ thành phần Albumin, Globulin a , |3, Ỵ so với lô chuột gây viêm (khơng dùng thuốc) lơ chuột bình thường giữ ngun khơng đổi (sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05) Nếu so sánh lô chuột dùng kết hợp lô chuột dùng indomethacin giá trị tỷ lệ thành phần protein thu thời điểm tương đương Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Có thể nhận xét rằng, thời gian gây viêm cấp ngắn nên tỷ lệ thành phần protein huyết lô chuột thí nghiệm khơng thay đổi 3.5.4 Sự thay đổi nồng độ seromucoid huyết Để đánh giá khả chống viêm thuốc, tiến hành so sánh tỷ lệ giảm nồng độ seromucoid lô chuột thử thuốc so với lô chuột gây viêm (không dùng thuốc) Tỷ lệ giảm nồng độ seromucoid lô chuột thử thuốc tính cơng thức mục 2.5.4.2 Kết thu trình bày bảng 3.20 Tỷ lệ giảm Lô Chất thử tác dụng Liều Số lượng chuột Độ đục nồng độ seromucoid p (%) Chuột gây viêm (Không dùng thuốc) 0,503 ± 0,046 Dịch chiết FKNH l,5g/kg 0,329 ± 0,047 34,2