3.2.1. Theo dõi sự thay đổi thể tích chân chuột.
Thí nghiệm được tiến hành trên 5 chuột, trọng lượng từ 100-130g. Các chuột được đánh dấu từ gan bàn chân tói khuỷu để đo thể tích chân chuột khi chưa gây viêm. Sau khi đánh dấu theo thứ tự, chuột được tiêm dưới gan bàn chân sau 0,05ml dung dịch dextran 6%. Sau khi tiêm cứ cách 1 giờ lại đo thể tích chân chuột 1 lần. Dựa theo công thức ở mục 2.5.4 tính được độ tăng thể tích chân chuột. Kết quả được trình bày như sau:
Bảng 3.7: Sự biến đổi thể tích chân chuột theo thời gian
Thời gian (giờ) Thể tích chân chuột (ni) Sự thay đổi thể tích chân chuột (%) p 0 220 0 1 295 34,1 ±5,1 p<0,01 2 325 47,7 ± 8,2 p<0,01 3 340 54,5 ± 3,6 p<0,01 4 310 40,9 ± 3,6 p < 0,01
Ghi chú: s ố liệu ở bảng trên là kết quả trung bình độ tăng thể tích chân chuột ±S.E của 5 chuột.
Thời gian (giờ)
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi thể tích chân chuột theo thời gian
Số liệu trong bảng trên cho thấy mức độ phù chân chuột tăng dần theo thời gian tính từ thời điểm gây viêm. Sau khi tiêm dextran 1 giờ, độ phù tăng so với lúc chưa tiêm là 34,1%, sau 2 giờ là 47,7%, sau 3 giờ là 54,5% và đến 4 giờ thi giảm phù xuống còn 40,95%. Như vậy, khi gây phù chân chuột bằng cách tiêm dung dịch dextran 6%, độ phù chân chuột đạt giá trị lớn nhất ở thời điểm 3 giờ sau khi gây viêm. Do vậy, đối với các lô chuột thử tác dụng chống viêm của thuốc được tiến hành đo thể tích chân chuột vào thời điểm 3 giờ sau khi gây viêm để so sánh với thể tích chân chuột lúc bình thường (thời điểm 0 giờ).
3.2.2. Tác dụng chống viêm của a-amylase theo nồng độ.
Với mục đích theo dõi tác dụng chống viêm của a-amylase ở các nồng độ khác nhau, chúng tôi tiến hành xác định độ giảm thể tích chân chuột trong các trường hợp cho chuột uống a-amylase với các nồng độ khác nhau. Do điều kiện thời gian có hạn nên sơ bộ khảo sát một số nồng độ. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.8: Sự thay đổi thể tích chân chuột theo nồng độ của a-amylase.
Lô Liều lượng của
a-amylase/lkg Số chuột Thể tích chân chuột (|Al) Độ tăng thể tích chân chuột (%) Tỷ lệ ức chế phù(%) p 1 o u 5 340,0 54,5 ± 3,6 0 2 1500 u 5 299,0 35,9 ± 8,9 34,1 p<0,01 3 3000 Ư 5 290,0 31,8 ±5,8 41,6 p<0,01 4 6000 u 5 285,3 29,7 ± 5,4 45,5 p<0,01
Ghi chú: s ố liệu ở bảng trên là kết quả trung bình độ tăng thể tích chân chuột ±S.E của 5 chuột.
Như vậy, với liều a-amylase tăng dần từ 1500 đến 6000 u/lkg thì tỷ lệ ức chế phù tăng dần tương ứng từ 34,1% đến 45,5%. Trên cơ sở đó, chúng tôi chọn liều lượng 6000 u/kg với tỷ lệ ức chế phù là 45,5% (tỷ lệ không cao quá và cũng không thấp quá) để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Tác dụng chống viêm cấp của dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần, a-amylase và dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần kết họp với a-amylase.
Thí nghiệm được tiến hành trên 5 lô chuột.
• Lô 1: Lô chứng (lô chuột gây viêm), cho uống NaCl 0,9%.
• Lô 2: Lô thử, chuột uống dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần với liều tương ứng l,5g kim ngân/kg (liều lượng dùng được quy ra gam dược liệu khô cho lkg thể trọng chuột).
• Lô 3: Lô thử, chuột được uống a-amylase với liều 6000 Ư/lkg. • Lô 4: Lô thử tác dụng chống viêm của dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần kết hợp với a-amylase ở liều giống lô 2 và lô 3.
• Lô 5: Lô so sánh, chuột uống indomethacin với liều 5mg/kg. Kết quả thu được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.9: Tỷ lệ ức chế phù của các lô chuột thử Lô Chất thử tác dụng Số chuột Thể tích chân chuột(|j.l) Độ tăng thể tích chân chuột (%) Tỷ lệ ức chế phù(%) p
1 Chuột gây viêm
(không dùng thuốc) 5 340,0 54,5 ± 3,6 0 2 Dịch chiết FKN 5 298,4 35,6 ±5,2 34,6 p<0,01 3 a-amylase 5 285,3 29,7 ± 5,4 45,5 p<0,01 4 Dịch chiết FKN + a-amylase 5 270,0 22,7 ± 3,6 58,3 p<0,01 5 Indomethacin 5 268,9 22,2 ± 3,3 59,2 p<0,01
Ghi chú: Số liệu ở bảng trên là kết quả trung bình độ tăng thể tích chân chuột ±S.E của 5 chuột.
Quy ước: Thể tích chân chuột ở thời điểm 0 giờ (chưa gây viêm) là 0%.
Qua bảng trên ta thấy: dịch chiết ũavonoid kim ngân toàn phần với liều tương ứng l,5g kim ngân /kg có tác dụng giảm phù chân chuột rõ rệt, tỷ lệ ức chế phù là 34,6%, a-amylase với liều 6000 u/kg có tác dụng giảm phù chân chuột cao, tỷ lệ ức chế phù là 45,5%, khi kết hợp dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần (với liều l,5g kim ngân/kg) với a-amylase 6000 u/kg tác dụng chống viêm tăng lên tới 58,3% (P<0,01) tương đương vối tỷ lệ ức chế phù của indomethacin với liều uống 5mg/kg là 59,2% (P<0,01). Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p >0,05. Như vậy, tỷ lệ ức chế phù của lô chuột uống kết hợp dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần với a-amylase cao hơn lô chuột dùng dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần và lô chuột dùng a-amylase đơn độc. Trên cơ sở đó, bước đầu nhận xét rằng, phối hợp dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần với a-amylase đã làm tăng rõ rệt tỷ lệ ức chế phù và đạt hiệu quả tương đương với indomethacin 5mg/kg.
Chương IV BÀN LUẬN
Qua kết quả thực nghiêm trên chúng tôi đưa ra một số bàn luận sau:
1. Ảnh hưởng của dịch chiết Aavonoid toàn phần của kim ngân đối với a- amylase của nước bọt trên in vitro.
Nước bọt được sử dụng để tiến hành thử in vitro với lý do: a-amylase là thành phần chính của nước bọt đồng thời đây cũng là nguyên liệu sẩn có và thường được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt độ của a-amylase.
Khi kết hợp a-amylase với dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần thì hoạt tính của a-amylase tăng cao hơn so với dùng đơn độc, điều đó chứng tỏ dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần gây kích hoạt a-amylase và với nồng độ dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần 0,05% thì % thay đổi hoạt tính của a-amylase là mạnh nhất.
Kết quả thực nghiệm cũng cho thấy dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần không làm thay đổi quy luật ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hoạt động của a-amylase. Khi thời gian và nhiệt độ càng lớn thì mức độ thuỷ phân tinh bột của a-amylase càng tăng, nhưng đến một lúc nào đó mức độ thuỷ phân sẽ chậm lại, chứng tỏ dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần chỉ có tác dụng kích thích mà không làm thay đổi hoạt tính của a-amylase.
Bên cạnh đó, kết quả thực nghiệm cũng cho thấy a-amylase ở nồng độ 0,035mg/ml tức là nước bọt pha loãng 100 lần khi kết hợp với dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần 0,05% cho % thay đổi hoạt tính của a-amylase là cao nhất.
2. Tác dụng chống viêm cấp của dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần và a-amylase trên in vivo.
Chuột được gây phù chân bởi dung dịch dextran 0,6% và cho kết quả phù to nhất sau 3 giờ. Kết quả này phù hợp vói các nghiên cứu trước. Chính vì vậy, để đánh giá tác dụng chống viêm của thuốc, phải tiến hành đo phù chân chuột vào thời điểm độ phù đạt giá trị cao nhất và so sánh với lô chứng.
Chuột được uống dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần (với liều l,5g kim ngân/kg) vào các thời điểm 60', 30' trước khi gây phù và 60' sau khi gây phù để đảm bảo hiệu lực của thuốc dù tác dụng có xuất hiện sớm hay muộn. Phương pháp cho uống dịch chiết dược liệu này đã được các nghiên cứu trước tiến hành thử nghiệm và cho kết quả tốt. Trong thực nghiệm này cũng thu được kết quả khả quan là lô chuột uống dược liệu tỷ lệ ức chế phù là 34,6%. Điều đó chứng tỏ dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần vói liều l,5g kim ngân/kg có tác dụng chống viêm cấp trên chuột thực nghiệm.
Maxilase có chứa a-amylase với hàm lượng 3000U đang được lưu hành trên thị trường được chỉ định trong lâm sàng để chống viêm, giảm phù nề. Từ liều dùng cho người tính được liều dùng cho chuột. Tuy nhiên, để xác định được liều phù hợp có tác dụng chống viêm trên chuột trong thực nghiệm này, chúng tôi đã xác định tỷ lệ ức chế phù chân chuột của 3 liều a-amylase là 1500U/kg, 3000U/kg, 6000 u/kg và thu được liều phù hợp là 6000 u/kg với tỷ lệ ức chế phù là 45,5%. Liều này được dùng để thử tác dụng chống viêm kết hợp giữa a-amylase với dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần với liều tương ứng là l,5g/kg.
Như vậy, a-amylase ở 3 nồng độ 1500, 3000, 6000 u/kg và dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần l,5g/kg đều có tác dụng chống viêm trên chuột thực nghiệm, tuy nhiên tỷ lệ ức chế phù của các lô dùng đơn độc này vẫn thấp hơn tỷ lệ ức chế phù của lô dùng indomethacin (59,2%).
3. Tác dụng chống viêm khi kết hợp dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần với a-amylase trên in vivo.
Khi kết hợp dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần (liều l,5g kim ngân/kg) với a-amylase (liều 6000U/kg) thì thấy tác dụng giảm phù tăng rõ rệt, tỷ lệ ức chế phù là 58,3% tương đương với tỷ lệ này của indomethacin liều uống 5mg/kg đạt 59,2%. Tỷ lệ ức chế phù của lô chuột dùng kết hợp cao hơn so với lô chuột dùng dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần và a-amylase đơn độc. Kết quả này cho thấy có tác dụng hiệp đồng cộng về tác dụng chống viêm cấp của dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần và a-amylase.
Trong khuôn khổ đề tài này, dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần được chứng minh là có tác dụng chống viêm cấp trên in vivo. Hơn nữa, khi phối hợp với oc-amylase thì tác dụng chống viêm được tăng cường và đạt hiệu quả tương đương với một số hoá dược làm thuốc. Đồng thời, trên in vitro dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần cũng có tác dụng kích hoạt a-amylase. Điều này gợi ra một hướng nghiên cứu mới về thuốc chống viêm kết hợp giữa đông và tây y, đồng thời tiếp tục nghiên cứu về khả năng kết hợp giữa a- amylase với các dược liệu chống viêm khác nhằm thu được hiệu quả chống viêm tốt hơn và phát huy tác dụng của nguồn dược liệu sẵn có trong nước.
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
Qua các kết quả nghiên cứu chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần với nồng độ 0,05% có khả năng kích thích hoạt tính của a-amylase trên in vitro mạnh nhất, với nồng độ nhỏ hơn hay lớn hơn nồng độ này khả năng kích thích giảm đi.
2. Sự kết hợp dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần không làm thay đổi quy luật ảnh hưởng của tác nhân thòi gian và nhiệt độ đến hoạt tính của oc- amylase.
3. Dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần với liều tương ứng l,5g kim ngân/kg có tác dụng chống viêm trên mô hình chống viêm cấp.
4. Khi kết hợp dịch chiết Havonoid kim ngân và a-amylase với liều tương ứng l,5g kim ngân/kg + 6000 u/kg, tác dụng chống viêm tăng cao thể hiện tác dụng hiệp đồng của 2 hoạt chất trên mô hình gây viêm cấp. Tác dụng hiệp đồng này tương đương với indomethacin liều uống 5mg/kg.
Từ những kết quả thu được trong quá trình làm thực nghiệm, chúng tôi xin đưa ra một số đề xuất sau:
1. Nên tiếp tục nghiên cứu mối tương quan liều kết hợp hoạt chất cây kim ngân với a-amylase để tìm được nồng độ kết hợp đạt hiệu quả chống viêm tốt nhất.
2. Theo dõi sự biến đổi những chỉ số hoá sinh để đánh giá đầy đủ hơn về hiệu quả chống viêm của thuốc.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ môn Hoá sinh Đại học Dược Hà Nội (2004), Hoá sinh, NXB Y học, tr.129-192.
2. Bộ môn miễn dịch và sinh lý bệnh Đại học Y Hà Nội (2002), Sinh lý bệnh học, NXB Y học, tr. 202-218.
3. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, NXB Y học chi nhánh TP. Hồ Chí Minh, tr.243-293.
4. Nguyễn Hoàng Hải (2001), Nghiên cứu tác dụng chống viêm của núc nác kết hợp với a-chymotrypsin, Luận văn Thạc sỹ Dược học, tr. 9-11.
5. Hội đồng Dược điển Việt nam, Dược điển Việt nam III, tr. 394-395.
6. Lê Thị Diễm Hồng (2002), Góp phần tìm hiểu tác dụng chống viêm của hoa cây kim ngân kết hợp với a-chymotrypsỉn, Luận văn Thạc sỹ Dược học, tr. 1-
22.
7. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam, NXB Y học, tr. 75-77.
8. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hoá sinh học, NXB khoa học và kỹ thuật, tr. 78-80.
9. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzỵm, NXB khoa học và kỹ thuật, tr. 40-55.
10. Lê Đình Roanh, Nguyễn Đình Mão (1997), Bệnh học viêm và nhiễm khuẩn, NXB Y học, tr. 1-132.
11. Phạm Thiệp, Vũ Ngọc Thuý (2001), Thuốc biệt dược và cách sử dụng,
NXB y học, tr.61.
12. Bế Thị Thuấn (1996), Flavonoid và một số tác dụng sinh học của chúng,
13. Từ điển bách khoa dược học (1999), NXB Từ điển bách khoa, Hà Nội, tr. 346, 630-632.
14. Vũ Đình Vinh, Đặng Hạnh Phức, Đỗ Đình Hồ (1974), Kỹ thuật y sinh hoá, Trường Đại học quân y, tr. 222-223, 328-331.
15. Brendan Doane (2003), "Alpha - amylase", Ohio State
<httn:ỉ/userpages. wittenberp.edu/s04.bdoane>
16. E.Myles Glenn, Barbara J. Bowman and T.C.Koslowske (1968), "The systemic response to inllammation", Biochemical Pharmacology, Supplement, Pergamon Press, p. 27-49.
17. Kwal WJ (2003), "Loniceroside c, antiinílammatory Saponin from Lonicera japonica", Chem. Pharm. Bull, p. 333-335.
18. Martindal (1999), The complete Drug conỷerence - 32nd edition, The pharmaceutical Press, p. 1549.
19. Tae Jin (2002), "Anti- inAammatory effect of Lonicera in proteinase- activated receptor 2-mediated paw edema", Clinica Chimica Acta, p. 165-171. 20. c. A. Winter et al (1962), Carragenin-induced oedema in hind paw ofthe rat as assayỷor anti-inflammatorỵ drugs, Proc. Soc. Exp. Biol. Med, No 111, p. 544-547.