Nghiên cứu tác dụng chống viêm của cây tỏa dương (balanophora laxiflora hemsl , họ dó đất balanophoraceae) trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẮM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY TỎA DƯƠNG (Balanophora laxiflora Hemsl., HỌ DÓ ĐẤT BALANOPHORACEAE) TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẮM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY TỎA DƯƠNG (Balanophora laxiflora Hemsl., HỌ DÓ ĐẤT BALANOPHORACEAE) TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 8720205 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thùy Dương PGS.TS Đỗ Thị Hà HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Với tất lòng kính trọng biết ơn tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thùy Dương, môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Đỗ Thị Hà NCS Nguyễn Thị Hồng Anh, khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu bảo giúp đỡ tơi nhiều suốt q trình nghiên cứu hồn thiện luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên, em sinh viên nghiên cứu khoa học môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội bên tôi, giúp đỡ tơi q trình tơi thực hồn thiện luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đồng hành, động viên, chia sẻ với thời gian qua Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2018 Nguyễn Thị Thắm MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu nghiên cứu 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.4 Công dụng 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.2 Tổng quan phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm 11 1.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vitro 11 1.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp in vivo 13 1.2.3 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo 15 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU/NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 20 2.1 Nguyên vật liệu 19 2.1.1 Động vật nghiên cứu 19 2.1.2 Dược liệu nghiên cứu 19 2.1.3 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 19 2.1.4 Hóa chất thuốc thử 20 2.1.5 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 20 2.2 Thiết kế nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp đánh giá khả dọn gốc tự do, chống oxy hóa 22 2.3.2 Phương pháp đánh giá khả ức chế enzym COX-2 in vitro phân đoạn chất phân lập 23 2.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm in vivo 24 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự 29 3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự DPPH in vitro phân đoạn tỏa dương 29 3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự superoxid anion (O2-•) in vitro phân đoạn tỏa dương 30 3.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro phân đoạn chất phân lập 31 3.2.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro phân đoạn………………………………………………………………………… ……31 3.2.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro chất phân lập……… 34 3.3 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm in vivo phân đoạn chất phân lập tiềm tỏa dương 36 3.3.1 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm cấp phân đoạn chất phân lập tiềm tỏa dương mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenan 36 3.3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm mạn phân đoạn chất phân lập tiềm mơ hình gây u hạt 38 Chương BÀN LUẬN 41 4.1 Về tác dụng quét gốc tự phân đoạn tỏa dương 41 4.2 Về tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro phân đoạn chất phân lập 42 4.2.1 Về tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro phân đoạn 42 4.2.2 Về tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro chất phân lập 43 4.3 Về tác dụng chống viêm in vivo phân đoạn chất phân lập 44 4.3.1 Về tác dụng chống viêm cấp in vivo phân đoạn chất phân lập tiềm mơ hình gây phù carrageenan 45 4.3.2 Về tác dụng chống viêm mạn in vivo phân đoạn chất phân lập tiềm mơ hình gây u hạt 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Ý nghĩa A Aceton Ac Acid acetic ALT Alanine aminotransferase AST Aspartate transaminase COX Enzym cyclooxygenase CTCT Công thức cấu tạo D Dichloromethan DCGGP 1,3-di-O-caffeoyl-4-O-galloyl-glucopyranose DMSO Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-Dimethyl-2-picryl hydrazyl ED50 Effective dose 50% (liều có tác dụng 50%) EDTA Ethylene Diamine Triacetic Acid EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HPLC High Performance Liquid Chromatograph (sắc ký hiệu cao) Hx n-Hexan IC50 Inhibitory concentration 50% (nồng độ ức chế 50%) iNOS NO synthase cảm ứng IR InfraRed (Tia hồng ngoại) LPS Lypopolysacharid MeOH Methanol NF- kB Nuclear factor –kappa B (Yếu tố chép nhân) NMR NMR-Nuclear Magnetic Resonance: phổ cộng hưởng từ hạt nhân NTB Nitro blue tetrazolium PG Prostaglandin ROS Reactive oxygen species (Các dạng oxy phản ứng) SE Standard Error (sai số chuẩn) SOD Superoxide TCGP 1,2,6-tri-O-caffeoyl-β-D-glucopyranose TGGP 1, 2, 6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose TNF Tumor necrosis factor UV Ultra-violet (tia cực tím) W Water (nước) X X-ray Danh mục bảng Tên bảng STT Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 2.1 Bảng 3.1 CTCT tên khoa học 19 hợp chất phân lập Tóm tắt tác dụng dược lý loài chi Balanophora Hàm ẩm hiệu suất cao toàn phần phân đoạn tỏa dương Đánh giá tác dụng dọn gốc tự DPPH phân đoạn Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Đánh giá tác dụng dọn gốc tự SOD phân đoạn Đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro phân đoạn Đánh giá tác dụng ức chế enzym COX-2 in vitro chất phân lập Trang 13 21 30 31 33 36 Ảnh hưởng chất phân lập phân đoạn Bảng 3.5 tiềm đến mức độ phù chân chuột (%) theo 38 thời gian Ảnh hưởng chất phân lập phân đoạn Bảng 3.6 tiềm đến khối lượng u hạt chuột cống trắng 40 Danh mục hình vẽ, đồ thị Tên hình, tên sơ đồ STT Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình ảnh tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl.) Sơ đồ thiết kế nội dung nghiên cứu Qui trình thí nghiệm đánh gía khả ức chế enzym COX-2 in vitro Trang 20 22 25 Qui trình thí nghiệm đánh giá tác dụng chống Hình 2.4 viêm cấp mơ hình gây phù bàn chân chuột 26 carrageenan Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng chống Hình 2.5 Hình 3.1 Hình 3.2 Quy trình phân lập chất từ phân đoạn EtOAc 34 Hình 3.3 Cơng thức cấu tạo chất phân lập từ phân đoạn EtOAc 35 viêm mạn mơ hình gây u hạt Khả ức chế enzym COX- in vitro phân đoạn tỏa dương 28 32 ĐẶT VẤN ĐỀ Tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl., họ Dó đất Balanophoraceae) hay gọi ngọc cẩu, củ gió đất, củ núi, hoa đất, cu chó, khơng lá, xà dược liệu quý phân bố Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Lào Việt Nam [5], [7] Trong dân gian từ lâu sử dụng để điều trị chứng nhức mỏi chân tay, đau bụng, chữa ho, chảy máu tử cung, trĩ, yếu sinh lý nam, liệt dương, di tinh, mộng tinh làm thuốc bổ cho người già, người ốm dậy, phụ nữ sau sinh [5], [7], [11] Trên giới có nghiên cứu cho thấy số họ Dó đất Balanophoraceae có tác dụng chống viêm [20], [54], [66] Năm 2011, tác giả Wen F.C tác dụng chống viêm cao chiết chất phân lập từ cao chiết loài B laxiflora [66] Ngoài tác dụng chống viêm, số nghiên cứu khác cho thấy chi Balanophora có nhiều hợp chất có tác dụng chống oxy hóa hợp chất tannin có tác dụng tốt [23] Năm 2009, tác giả She G.M cộng tác dụng dọn gốc tự DPPH cao chiết hợp chất phân lập từ cao chiết B laxiflora [57] Những năm sau đó, tác giả Ho S.T tác dụng dọn gốc tự DPPH, superoxid anion cao chiết hoa B laxiflora đồng thời đánh giá tác dụng dọn gốc tự DPPH superoxid hoa đực B laxiflora tốt hoa [31] Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu dược lý đánh giá tác dụng chống viêm tỏa dương nghiên cứu hóa thực vật dựa theo định hướng tác dụng sinh học tỏa dương hạn chế Do vậy, để cung cấp chứng khoa học dược liệu Chúng thưc đề tài “Nghiên cứu tác dụng chống viêm tỏa dương (Balanophora laxiflora Hemsl., Họ Dó đất Balanophoraceae) thực nghiệm” với mục tiêu sau: Sàng lọc tác dụng dọn gốc tự do, chống oxy hóa, chống viêm in vitro phân đoạn chất phân lập từ cao chiết tỏa dương Đánh giá tác dụng chống viêm in vivo phân đoạn tiềm chất phân lập tiềm prostaglandin thúc đẩy trình viêm, thấy hầu hết mô với nồng độ thấp, tế bào tham gia phản ứng viêm Trong mô bị viêm nồng độ COX-2 tăng cao nhiều lần so với mơ bình thường [41] Vì thử nghiệm này, nhóm nghiên cứu lựa chọn đích tác dụng enzym COX-2 Đây hướng nghiên cứu chống viêm sử dụng phổ biến giới [55] Kết quả thử nghiệm cho thấy tế bào bị kích thích viêm LPS µg/ml khơng ủ thuốc có mức độ biểu lớn lần so với tế bào không gây viêm khơng ủ thuốc (p