BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐẬU THỊ GIANG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM CỦA CÂY GỐI HẠC Leea rubra Blume HỌ GỐI HẠC LEEACEAE TRÊN THỰC NGHIỆ
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐẬU THỊ GIANG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM
CỦA CÂY GỐI HẠC (Leea rubra Blume
HỌ GỐI HẠC LEEACEAE)
TRÊN THỰC NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2016
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐẬU THỊ GIANG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM
CỦA CÂY GỐI HẠC (Leea rubra Blume
Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Nguyễn Thùy Dương
2 TS Phương Thiện Thương
HÀ NỘI 2016
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
tới TS Nguyễn Thùy Dương, bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà
Nội, là người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận văn này
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Phương Thiện Thương và NCS
Nguyễn Thị Phương, khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã
chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên, các em sinh viên đang nghiên cứu khoa học tại bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn bên tôi, giúp đỡ tôi trong quá trình tôi thực hiện và hoàn thiện luận văn này
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè
đã đồng hành, động viên, chia sẻ với tôi trong gần hai năm học tập và nghiên cứu dưới mái trường Dược thân yêu!
Hà Nội, ngày 31 tháng 3 năm 2016
Đậu Thị Giang
Trang 4MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 TỔNG QUAN 2
1.1 Tổng quan về viêm 2
1.1.1 Khái niệm 2
1.1.2 Nguyên nhân 2
1.1.3 Vai trò của COX và LOX trong đáp ứng viêm 2
1.1.4 Các chất trung gian hoá học trong viêm 5
1.1.5 Một số thuốc chống viêm 7
1.2 Tổng quan về đau 8
1.2.1 Định nghĩa 8
1.2.2 Đường dẫn truyền cảm giác đau 9
1.2.3 Thuốc giảm đau 9
1.2.4 Dược liệu có tác dụng giảm đau, chống viêm 10
1.3 Tổng quan về gốc tự do, chất chống oxy hóa 12
1.3.1 Nguồn gốc của gốc tự do 12
1.3.2 Stress oxi hóa, tác hại của stress oxi hóa 12
1.3.3 Hệ thống bảo vệ chống gốc tự do, chống oxy hóa trong cơ thể 15
1.4 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu 15
1.4.1 Tên khoa học 15
1.4.2 Đặc điểm thực vật 15
1.4.3 Phân bố 16
1.4.4 Thành phần hóa học 16
1.4.5 Công dụng 16
1.4.6 Tác dụng dược lý 16
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU/NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1 Nguyên vật liệu 18
2.1.1 Động vật nghiên cứu 18
2.1.2 Dược liệu nghiên cứu 18
2.1.3 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 19
2.1.4 Thuốc thử, hóa chất 19
2.1.5 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 19
2.2 Thiết kế nghiên cứu 20
2.3 Phương pháp nghiên cứu 21
2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm 21
Trang 52.3.2 Phương pháp xác định cơ chế chống viêm in vitro 27
2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 32
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33
3.1 Kết quả đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm của GHL và GHR trên 33
3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng giảm đau trung ương của GHL và GHR bằng phương pháp mâm nóng 33
3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng giảm đau ngoại vi của GHL và GHR bằng phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic 34
3.1.3 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm cấp của GHL và GHR trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan 35
3.1.4 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm mạn của GHL và GHR trên mô hình gây u hạt 39
3.2 Kết quả xác định cơ chế in vitro của GHL và GHR 41
3.2.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế COX in vitro của GHL và GHR 41
3.2.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế LOX in vitro của GHL và GHR 42
3.2.3 Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH in vitro của GHL và GHR 43
3.2.4 Kết quả đánh giá tác dụng dọn gốc tự do superoxid anion (O2-•) in vitro của GHL và GHR 43
Chương 4 BÀN LUẬN 45
4.1 Bàn luận về tác dụng giảm đau, chống viêm của GHL và GHR 45
4.1.1 Về tác dụng giảm đau của GHL và GHR trên mô hình giảm đau bằng mâm nóng 45
4.1.2 Về tác dụng giảm đau của GHL và GHR trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic 46
4.1.3 Về tác dụng chống viêm cấp của GHL và GHR trên mô hình gây phù bằng carrageenan 47
4.1.4 Về tác dụng chống viêm mạn của GHL và GHR trên mô hình gây u hạt 48
4.2 Bàn luận về cơ chế chống viêm in vitro của GHL và GHR 49
4.2.1 Về tác dụng ức chế COX in vitro của GHL và GHR 50
4.2.2 Về tác dụng ức chế LOX in vitro của GHL và GHR 51
4.2.3 Về tác dụng quét gốc tự do in vitro của GHL và GHR 52
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 6Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt
Kí hiệu : Ý nghĩa
AA : Acid arachidonic
ADN : Acid desoxyribonucleic
AMP : Adenosin monophosphat
ATP : Adenosin triphosphat
COX (1,2) : Enzym cyclooxygenase (1, 2)
DMSO : Dimethyl sulfoxid
DPPH : 1,1-dimethyl-2-picryhydrazyl
GHL : Cao dịch chiết cồn lá gối hạc
GHR : Cao dịch chiết cồn rễ gối hạc
IASP : Hiệp hội quốc tế nghiên cứu về đau
NSAID : Thuốc chống viêm không steroid
PARP : Poly( ADP-ribose)polymerase
Trang 738
5
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của GHL và GHR đến khối lượng u hạt trên chuột cống trắng 39
6
Bảng 3.6 So sánh sự khác biệt về mặt thống kê giưã các liều khác nhau của GHL và GHR trên mô hình gây u hạt 41
7 Bảng 3.7 Khả năng ức chế COX in vitro của GHL và GHR 42
8 Bảng 3.8 Khả năng ức chế LOX in vitro của GHL và GHR 42
9 Bảng 3.9 Khả năng dọn gốc DPPH in vitro của GHL và GHR 43
10 Bảng 3.10 Khả năng dọn gốc O2.- in vitro của GHL và GHR 43
Trang 8Danh mục các hình vẽ, đồ thị
1 Hình 1.1 Con đường chuyển hóa acid arachidonic thông qua
2 Hình 1.2 Con đường chuyển hóa acid arachidonic thông qua
3 Hình 1.3 Cơ chế chống viêm của glucocorticoid 8
4 Hình 2.1 Ảnh chụp cây gối hạc (Leea rubra Blume,
5 Sơ đồ 2.1 Thiết kế các nội dung nghiên cứu 21
6 Hình 2.2 Quy trình thí nghiệm giảm đau theo phương pháp
7 Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm giảm đau ngoại vi bằng
phương pháp gây đau quặn bằng acid acetic 24
8 Hình 2.4 Quy trình thí nghiệm tác dụng chống viêm cấp trên
mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan 25
9 Hình 2.5 Quy trình thí nghiệm tác dụng chống viêm mạn
10 Hình 3.1 Ảnh hưởng của GHL và GHR đến mức độ phù của
11 Hình 3.2 Ảnh hưởng của GHL và GHR đến khối lượng u hạt
Trang 91
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nước ta có khí hậu quanh năm nóng ẩm với hệ thực vật vô cùng phong phú
và đa dạng Đây là nguồn nguyên liệu thiên nhiên quý giá cung cấp nguyên liệu cho ngành hương liệu, mỹ phẩm và hóa dược Ngày nay những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp cũng như nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc phòng, chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công ngiệp thực phẩm Những cây thuốc dân gian cùng với vốn sử dụng phong phú của đồng bào các dân tộc vẫn là kho tàng quý giá để khám phá, tìm kiếm nhiều loại thuốc mới có hiệu lực cao cho công tác phòng và chữa bệnh [5], [6], [7], [9]
Cây gối hạc có tên khoa học là Leea rubra Blume họ Gối hạc Leeaceae đã
được y học cổ truyền sử dụng trị nhiều chứng bệnh Đông y cho rằng: rễ gối hạc có
vị đắng ngọt, tính mát sử dụng tiêu sưng, thông huyết Nó thường được sử dụng chữa sưng tấy, đơn bắp chuối hay phong thấp sưng đầu gối và chữa đau bụng, rong kinh [5], [7] Tuy nhiên các công trình khoa học nghiên cứu về cây gối hạc còn rất
ít Có một số công trình nghiên cứu gần đây về tác dụng chống gốc tự do và chống
oxy của một số loài thuộc chi Leea mang lại kết quả khá khả quan [30], [57], [61],
[66] Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tác dụng
giảm đau, chống viêm của cây gối hạc (Leea rubra Blume họ Gối hạc Leeaceae)
trên thực nghiệm” Bộ phận dùng để điều trị viêm đau khớp trong y học cổ truyền
của gối hạc được ghi trong các tài liệu là rễ cây Tuy nhiên, nghiên cứu này đã tiến hành đánh giá tác dụng dược lý liên quan đến tính vị của loài này trên cả bộ phận thường dùng là rễ và bộ phận dễ thu hái của gối hạc là lá
Trang 102
Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về viêm
1.1.1 Khái niệm
Viêm là hiện tượng sưng, nóng, đỏ, đau của đã được đề cập tới trong y học
cổ đại và những khái niệm ban đầu về viêm cũng được hình thành từ rất sớm song lại rất khác nhau [77] Viêm là phản ứng bảo vệ của cơ thể chống lại yếu tố gây bệnh, là một quá trình bệnh lý phức tạp bao gồm nhiều hiện tượng: tổn thương tổ chức, rối loạn chuyển hóa, rối loạn tuần hoàn, bạch cầu đến ổ viêm và thực bào, tế bào tăng sinh [10]
1.1.2 Nguyên nhân
Nguyên nhân bên ngoài
Nguyên nhân bên ngoài thường gặp nhất và phức tạp nhất bao gồm:
- Vi sinh vật: vi khuẩn và các độc tố của chúng, virus, ký sinh trùng và côn trùng Đây là nguyên nhân gây viêm thường gặp nhất
- Tác nhân cơ học: chấn thương
- Vật lý: nhiệt độ (nóng, lạnh), điện, bức xạ ion hóa
- Hóa học: các acid, các kiềm, các muối kim loại nặng [10]
Nguyên nhân bên trong
- Hoại tử tổ chức: tắc mạch, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dưỡng
- Lắng đọng các phức hợp miễn dịch (có hoạt hóa bổ thể) (phức hợp kháng nguyên- kháng thể) [10]
1.1.3 Vai trò của COX và LOX trong đáp ứng viêm
Cyclooxygenase (COX) còn được gọi là prostaglandin H/G synthase Đây là enzym chịu trách nhiệm cho quá trình sản xuất các prostanoid Các phospholipid ở màng tế bào bị thủy phân bởi phospholipase A2 cho sản phẩm là acid arachidonic (AA) Acid arachidonic xúc tác bởi COX cho các prostanoid (Hình 1.1) Prostanoid
là thuật ngữ chung dùng để chỉ các phân tử bao gồm: prostaglandin (PG), các prostacyclin (PGI) và thromboxan (Tx) Hai đồng phân của COX đã được xác định
Trang 113
là COX-1 và COX-2 COX-1 sản xuất các PG duy trì hoạt động sinh lý bình thường của tế bào, do đó còn gọi là enzym sinh lý COX-2 được gọi là enzym cảm ứng, một enzym liên quan với phản ứng viêm COX-2 được kích hoạt bởi một số cytokin và các trung gian gây viêm hiện diện trong các tế bào viêm COX-2 chịu trách nhiệm cho sự tổng hợp các prostanoid, mà các prostanoid này liên quan đến các bệnh lý gắn liền với viêm [63] Các prostanoid thường có dạng “số 2” (ví dụ PGE2) và được hình thành từ acid arachidonic (AA), “số 2” này ngầm chỉ số liên kết đôi trong cấu trúc phân tử Các cyclooxygenase (COX) xúc tác cho phản ứng bis-oxy hóa, trong
đó hai phân tử O2 được đưa vào khung carbon của AA để tạo thành PGG2. Peroxidase (POX) xúc tác cho phản ứng khử nhóm 15- hydroperoxyl của PGG2 để cho sản phẩm là PGH2 và nước Phản ứng của POX đóng vai trò quan trọng trong
cơ chế enzym, các peroxidase khác như glutathione peroxidase cũng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng khử PGG2 thành PGH2 trong cơ thể PGH2 không được tích tụ trong tế bào mà được biến đổi nhanh chóng thành những chất khác gây đáp ứng sinh học: PGD2, PGE2, PGF2α, PGI2 and TxA2 Ngoại trừ PGF2α được tạo ra sau phản ứng khử hai electron của PGH2, còn các chất khác được tạo ra dưới xúc tác của các enzym không oxy hóa để sắp xếp lại cấu trúc phân tử Các prostanoid cuối cùng gắn đặc hiệu với một hoặc một số receptor liên kết với protein G, một số prostanoid khác lại thể hiện tác dụng qua receptor ở nhân [75] Thông thường mỗi loại tế bào thường có một hoặc hai sản phẩm prostanoid chủ yếu Ví dụ, ở tiểu cầu chủ yếu có thromboxan Một số PG có tác dụng gây viêm và gây đau, đặc biệt là PGE2 được giải phóng do kích thích cơ học, hóa học, nhiệt, vi khuẩn có tác dụng làm giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch gây viêm và đau PGF1 gây đau xuất hiện chậm nhưng kéo dài PGI1 gây đau xuất hiện nhanh nhưng nhanh hết PG còn làm tăng tính nhạy cảm của các receptor với các chất gây đau như bradykinin [4].
Trang 124
Hình 1.1 Con đường chuyển hóa acid arachidonic thông qua COX [44]
Enzym lypoxygenase (LOX) xúc tác cho quá trình chuyển hóa acid arachidonic thành các leucotrien, là một nhóm các chất trung gian gây viêm Leucotrien hoạt động như một chất hóa ứng động tế bào, lôi kéo các tế bào của hệ thống miễn dịch đến ổ viêm [56] Các enzym LOX phổ biến nhất là 5, 12 và 15-LOX [42] Khi acid arachidonic được chuyển hóa bởi 12-LOX và 15-LOX cho các lipoxin là những chất có tác dụng chống viêm bằng cách: tổng hợp các chalon (là phân tử tín hiệu dừng quá trình viêm), ức chế các receptor của leucotrien, giảm hoạt hóa tế bào bạch cầu đơn nhân [13] Ở người, 5-LOX được có mặt trong các tế bào
có nguồn gốc dòng tủy và đặc biệt là bạch cầu [56] 5-LOX xúc tác sự chuyển đổi
của AA thành acid 5S-hydroperoxyeicosatetraenoic (5- HpETE) (hình 1.2) và tiếp
tục chuyển hóa 5- HpETE thành LTA4 LTA4 có thể chuyển hóa thành LTB4 và sau
đó thành các cysteinyl leucotrien dưới xúc tác của LTA4 hydrolase và LTC4synthase tương ứng [64]
Trang 135
Hình 1.2 Con đường chuyển hóa acid arachidonic thông qua 5-LOX [44]
Các sản phẩm được chuyển hóa bởi 5-LOX gây hóa ứng động bạch cầu, kích hoạt bạch cầu hạt, tế bào T, tăng tổng hợp IgG, gây co thắt phế quản, co thắt tế bào
cơ trơn và có liên quan đến quá trình viêm nhiều bệnh lý như ung thư, đái tháo đường, béo phì [44], [49], [64]
1.1.4 Các chất trung gian hoá học trong viêm
Các chất chuyển hóa của acid arachidonic
Prostaglandin (PG)
Trong viêm cấp, các mô và mạch máu sản xuất ra PGE2 và PGI2, các tế bào mast giải phóng ra PGD2 Trong viêm mạn các bạch cầu đơn nhân và đại thực bào giải phóng ra PGE2 và thromboxan A2 Các chất PGE2, PGI2, PGD2 là các chất giãn mạch, đồng thời cũng hiệp đồng tác dụng với các chất giãn mạch khác như histamin
và bradykinin Chúng không trực tiếp làm tăng tính thấm thành mạch mà gián tiếp qua histamin và bradykinin
Tuy nhiên, bên cạnh chức năng trung gian trong viêm, một số PG còn đóng vai trò chống viêm đáng kể do làm giảm hoạt tính của các tế bào viêm Ví dụ, PGE2
Trang 14Các acid amin hoạt mạch
Histamin
Histamin được hình thành và dự trữ sẵn trong các hạt và được giải phóng do
sự vỡ hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng với các kích thích như: tổn thương vật lý, phản ứng miễn dịch làm gắn các kháng thể với dưỡng bào Histamin gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch với các tiểu tĩnh mạch [10]
Serotonin
Serotonin có tác dụng tương tự như histamin
Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF)
PAF hoạt động trên các receptor đặc hiệu cảu nó và có khả năng gây ra nhiều hiện tượng trong viêm PAF hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung tính, kích thích sự xuyên mạch của bạch cầu, giải phóng các men của tiêu thể, gây hoạt hóa và kết dính tiểu cầu [10]
Các cytokin
TNF, IL-1, IL-6 tham gia phát triển phản ứng viêm tại chỗ hoặc hệ thống Tại chỗ, chúng làm hoạt hóa nội mô Chúng còn gây sốt, làm tăng lượng bạch cầu
đa nhân trung tính, tăng nguyên bào sợi và kích thích tổng hợp collagen Còn IL-8
là một tác nhân gây hóa ứng động và hoạt hóa mạnh đối với bạch cầu đa nhân trung tính Nó là chất cảm ứng mạnh của các cytokin khác, chủ yếu là TNF và IL-1 [10]
Trang 157
Các protein huyết tương
Hệ thống bổ thể
Hệ thống bổ thể có các thành phần C3a và C5a làm tăng tính thấm thành mạch C5a hoạt hóa con đường chuyển hóa LOX của AA ở các bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu đơn nhân, gây giải phóng các chất trung gian hóa học của quá trình viêm, C5a còn là tác nhân gây hóa ứng động mạnh bạch cầu [10]
Bradykinin
Bradikinin gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch
Hệ thống đông máu và tiểu tơ huyết
Hệ thống đông máu là một loạt những protein huyết tương có thể bị hoạt hóa bởi yếu tố Hageman Bước cuối cùng là sự chuyển fibrinogen thành fibrin Trong quá trình biến đổi này, các fibrinopeptid được hình thành, nó gây tăng tính thấm mao mạch và nó có hoạt tính hóa ứng động đối với bạch cầu [10]
Oxyd nitơ
NO do đại thực bào sản xuất, có tác dụng làm giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch, tăng sản xuất các PG gây viêm Tuy nhiên nếu đại thực bào bị hoạt hóa sản xuất quá nhiều NO sẽ gây giãn mạch quá mức, gây sốc nhiễm khuẩn [58]
Ngoài ra các thuốc này còn đối kháng với hệ enzym thủy phân protein ngăn cản quá trình biến đổi protein làm bền vững màng lysosom và đối kháng tác dụng của các chất trung gian hóa học như bradykinin, seretonin, histamin, ức chế hóa ứng động bạch cầu, ức chế sự di chuyển của bạch cầu tới ổ viêm [1]
* Một số thuốc trong nhóm: aspirin, indomethacin, piroxicam, ibuprofen, diclfenac,…[4]
Trang 16Hình 1.3 Cơ chế chống viêm của glucocorticoid
* Một số thuốc trong nhóm: hydocortison, prednisolon, methylprednisolon,
Theo Geissner và Wurtele, đau theo sinh lý học thần kinh là một khái niệm trừu tượng phụ thuộc những yếu tố như: cơ địa, cảm xúc và sự chịu đựng khác nhau của từng người bệnh [36]
Trang 179
Đau là một trải nghiệm khó chịu về cảm giác cũng như cảm xúc do tổn thương có thực ở mô hoặc được cho là có tổn thương như thế gây ra [3]
1.2.2 Đường dẫn truyền cảm giác đau
* Tín hiệu đau từ ngoại biên được truyền về tủy sống nhờ hai sợi thần kinh là sợi
Aδ (truyền cảm giác đau cấp: đau nhói, đau tại chỗ) và sợi C (truyền cảm giác đau mạn: đau âm ỉ, đau lan tỏa, đau do bỏng) [3]
* Dẫn truyền cảm giác từ tủy lên não (nơron thứ hai):
Cảm giác đau được dẫn truyền theo nhiều hướng: bó gai – thị nằm ở cột trắng trước – bên; bó gai – lưới tận cùng các vùng khác nhau của hành não, cầu não, não giữa ở cả hai bên Từ cấu tạo lưới nằm ở các vùng này, nhiều nơron đi tới các nhân của đồi thị và một số vùng ở nền não, có những sợi đi lên hoạt hóa ở vỏ não Tại các synap với nơron thứ hai ở sau cùng tủy, các sợi C tiết ra chất truyền đạt là chất P Chất P là chất trung gian hóa học chủ yếu trong đường dẫn truyền cảm giác đau [3]
* Trung tâm nhận thức cảm giác đau:
Đường dẫn truyền cảm giác đau tận cùng ở cấu trúc lưới của thân não, trung tâm dưới vỏ như nhân lá trong của đồi thị và vùng S-I, S-II, vùng đỉnh, vùng trán của vỏ não Cấu trúc lưới và trung tâm dưới vỏ có chức năng nhận thức đau vừa, tạo
ra các đáp ứng về tâm lý khi đau Vỏ não có cấu trúc phân tích cảm giác đau tinh vi, phân biệt vị trí, đánh giá mức độ đau [3]
1.2.3 Thuốc giảm đau
1.2.3.1 Thuốc giảm đau trung ương
* Cơ chế :
Các opioid gắn vào các receptor opioid (𝜇, k, δ) làm kích thích các receptor này Tất cả các receptor của opioid đều cặp đôi với protein Gi Khi kích thích các receptor của opioid, gây ức chế adenylcyclase, ức chế mở kênh Ca2+
và hoạt hóa kênh K+ (tăng ưu cực) Vì vậy, ức chế giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh (chất P, acid glutamic) và ngăn cản dẫn truyền xung động thần kinh Các tác động
cụ thể [2]:
Trang 18+ Thuốc chủ vận trên receptor opioid:
Các opioid tự nhiên: morphin, codein,…
Các opioid tổng hợp: pethidin, methadon,…
+ Thuốc chủ vận – đối kháng hỗn hợp và chủ vận từng phần trên receptor opioid: pentazocin, nalorphin, nalbuphil, butorphanol,…
+ Thuốc đối kháng đơn thuần trên receptor opioid: naloxon, naltrexon [2]
1.2.3.2 Thuốc giảm đau ngoại vi
Các thuốc nhóm này chỉ có tác dụng với các chứng đau nhẹ, đau khu trú, tác dụng tốt với các chứng đau do viêm (đau khớp, viêm cơ, viêm dây thần kinh, đau răng)
* Cơ chế:
Thuốc làm giảm tổng hợp prostaglandin F2, làm giảm tính cảm thụ của ngọn dây thần kinh cảm thụ với các chất gây đau của phản ứng viêm nhƣ bradykinin, seretonin….[1]
* Các thuốc trong nhóm: paracetamol, ibuprofel, indomethacin, diclofenac,…
1.2.4 Dược liệu có tác dụng giảm đau, chống viêm
Dây đau xương, họ Tiết dê
+ Tên khoa học: Tinospora sinensis, Menispermaceae
Trang 19+ Tên khoa học: Drynaria fortunei J Sm, Polypodiaceae
+ Bộ phận dùng: thân rễ phơi khô
+ Công dụng: có khả năng bổ thận, trị đau xương, hành huyết phá huyết ứ Dùng chữa đạp xương, đau xương, bong gân, sai khớp, tai ù, đau răng, thận hư [7]
+ Tên khoa học: Wedelia calendulacea (L.) Less, Asteraceae
+ Bộ phận dùng: toàn cây tươi
+ Công dụng: trị viêm tấy ngoài da, xương khớp, răng, vú, lở loét, mụn nhọt, chốc
đầu, đau mắt [6]
Ké đầu ngựa, họ Cúc
+ Tên khoa học: Xanthium strumarium L, Asteraceae
+ Bộ phận dùng: quả, bộ phận trên mặt đất
+ Công dụng: có tác dụng làm ra mồ hôi, tán phong, dùng trong các chứng phong
hàn, đau nhức, phong thấp, tê dại, mờ mắt, chân tay co đặt [7]
Trang 20Một số nguồn ngoại sinh gốc tự do là: khói thuốc lá, ô nhiễm môi trường, sự bức xạ, một số loại thuốc, thuốc trừ sâu, dung môi công nghiệp, ozon [15] Một số nguồn nội sinh của gốc tự do là: hoạt động của ti thể, hoạt động xanthin oxidase, hoạt động của peroxisom, quá trình viêm, quá trình thực bào, con đường arachidonat, tập thể dục quá sức, thiếu máu cục bộ / chấn thương tái tưới máu [15]
1.3.2 Stress oxi hóa, tác hại của stress oxi hóa
Stress oxi hóa là thuật ngữ dùng để mô tả tình trạng mất cân bằng nghiêm trọng giữa sự phát sinh gốc tự do và chất chống oxi hóa bảo vệ trong cơ thể, có thể gây hại trên một phạm vi rộng cho các loại phân tử bao gồm cả lipid, protein và acid nucleic Stress oxy hóa ngắn hạn có thể xảy ra trong các mô bị thương do chấn thương, nhiễm trùng, tổn thương do nhiệt, nhiễm độc tố và tập thể dục quá mức Những mô bị thương này tăng sản xuất các enzym sinh gốc (ví dụ: xanthin oxidase, lipoxygenase, cyclooxygenase) làm kích hoạt các đại thực bào, giải phóng ion sắt, ion đồng hoặc làm gián đoạn chuỗi vận chuyển điện tử của phản ứng phosphoryl hóa và làm sản xuất dư thừa ROS Việc khởi phát và tiến triển của bệnh ung thư, cũng như các tác dụng phụ của xạ trị và hóa trị cũng có liên quan đến sự mất cân bằng giữa ROS và hệ thống bảo vệ chống oxy hóa ROS cũng có liên quan trong sự cảm ứng và các biến chứng của bệnh đái tháo đường, bệnh về mắt ở người già, và các bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh Parkinson [59]
Trang 21và 4-hydroxynonenal [29]
Phản ứng của peroxynitrit với acid béo không bão hòa có thể tạo ra lipid nitrat là chất đóng vai trò như nguồn cung cấp nội sinh của gốc NO. và có thể đóng vai trò như là phân tử tín hiệu [17] Sự oxy hóa của ROS, RNS có thể làm thay đổi cấu trúc protein Các nhóm thiol (-SH) của cystein là mục tiêu đặc biệt nhạy cảm của chất oxy hóa để phản ứng tạo thành acid sulfenic, disulfid, các dẫn xuất được S-glutathiol hóa, acid sulfinic và sulfonic [68] Liên kết thiol của cystein cũng có thể
bị nitrosyl hóa khi phản ứng với nhóm NO.
tạo nhóm S-nitrosyl có thể làm đảo ngược những vai trò chức năng quan trọng của một số lượng lớn protein trong tế bào [52] Tyrosin dư thừa có thể bị nitrat bởi peroxynitrit khi gắn một nhóm NO2.vào vòng phenolic của tyrosin [26] Một sự sửa đổi oxy hóa protein nữa là gắn một nhóm cacbonyl của ceton hoặc aldehyd vào chuỗi acid amin, phần lớn tại vị trí của prolin, threonin, lysin và arginin, protein bị oxy hóa có thể bị suy thoái nhanh và mất chức năng, dẫn đến có khả năng gây độc tế bào đáng kể [28] Ví dụ, protein của của ty lạp thể bị thay đổi (chủ yếu gây ra bởi peroxynitrit) có thể bị kết tủa và gây hoại tử tế bào [35] Sự thay đổi sinh lý của tình trạng oxy hóa khử tế bào đóng vai trò rất quan trọng trong cân bằng nội môi tế bào stress oxy hóa có thể dẫn đến những thay đổi bệnh lý của các tín hiệu tế bào, trong đó đáng chú ý là có thể dẫn
đến một dạng viêm trong tế bào [47], [40]
Trên ADN, oxy hóa có thể làm hỏng các base nitơ, đặc biệt là guanin, dẫn đến sự hình thành của 8-oxoguanin với hậu quả gây đột biến và có khả năng gây ung thư [74] Chất oxy hóa cũng có thể bắt nguyên tử hydro từ nhóm phosphat trên phân tử đường của khung ADN dẫn đến phá vỡ sợi ADN [25] Một hậu quả cần được nhắc đến là gây kích hoạt enzym poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)
Trang 2214
PARP là một họ gồm 17 enzym (chủ yếu PARP-1và PARP-2), các enzym này nhận biết được sự phá vỡ sợi ADN để bắt đầu một chương trình sửa chữa ADN [24] Các enzym PARP gần đây được biết đến như là bộ điều biến quan trọng của các bệnh viêm, do ảnh hưởng đến sự trưởng thành và sự biệt hóa của tế bào miễn dịch và quy định mức độ biểu hiện của nhiều chất trung gian gây viêm [16]
Ảnh hưởng của stress oxi hóa đã được công nhận trong nhiều tiến trình bệnh
lý bao gồm cả xơ vữa động mạch, tình trạng viêm, ung thư và quá trình lão hóa Hiện nay stress oxy hóa được cho là tạo một đóng góp một phần đáng kể trong tất
cả các bệnh viêm nhiễm (viêm khớp, viêm mạch, viêm cầu thận, lupus ban đỏ, hội chứng hô hấp ở người lớn), bệnh thiếu máu cục bộ (bệnh tim, đột quỵ, thiếu máu cục bộ đường ruột), bệnh nhiễm sắc tố sắt mô, hội chứng suy giảm miễn dịch, bệnh khí thũng, viêm loét dạ dày, tăng huyết áp, tiền sản giật, rối loạn thần kinh (bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, bệnh teo cơ), nghiện rượu, các bệnh liên quan đến hút thuốc và nhiều bệnh liên quan khác [73]
Việc sản xuất quá mức và không kiểm soát của ROS (kết quả của stress oxi hóa), đặc biệt ROS có nguồn gốc ti thể kích thích trực tiếp lên điều chỉnh của các cytokin viêm liên quan với các tình trạng bệnh lý khác nhau trong các bệnh liên quan đến viêm ở người [46] Viêm xảy ra như là kết quả của stress oxy hóa Đáp ứng với tình trạng giải phóng quá nhiều gốc tự do (thường có nguồn gốc từ ti thể) sẽ dẫn đến một loạt của các bệnh lý của viêm, khởi động một chu trình đáp ứng tế bào phức tạp bắt đầu và kích hoạt một vài phân tử tín hiệu [54] Một trong những phân
tử trung gian truyền tín hiệu quan trọng là yếu tố sao chép nhân (NF-κB), yếu tố này điều chỉnh quá trình sản xuất các chất trung gian gây viêm hạ nguồn như: NO synthase cảm ứng (iNOS), interleukin-1β (IL-1β), yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α)
và cyclooxygenase-2 (COX-2) NF-κB đóng vai trò quan trọng trong phản ứng viêm và chết tế bào, miễn dịch và đáp ứng stress cũng như điều hòa biểu hiện của các gen khác nhau [54] Sản sinh ROS quá mức có khả năng oxi hóa gây thay đổi
và tổn thương các phân tử sinh học như: lipid, carbohydrat, protein và ADN thông qua các cơ chế khác nhau, kết quả là có thể làm mất chức năng của các phân tử sinh học này vĩnh viễn
Trang 2315
1.3.3 Hệ thống bảo vệ chống gốc tự do, chống oxy hóa trong cơ thể
Chất chống oxy hóa là một phân tử ổn định có khả năng cho hoặc nhận của gốc tự do một electron để trung hòa gốc tự do này, do đó làm giảm khả năng gây nguy hại của nó Những chất chống oxy hóa làm chậm hoặc ngăn chặn sự phá hủy
tế bào chủ yếu là thông qua khả năng dọn gốc tự do của chúng [14] Những chất chống oxy hóa trọng lượng phân tử thấp có thể tương tác một cách an toàn với các gốc tự do và chấm dứt chuỗi phản ứng trước khi các phân tử quan trọng bị phá hủy Các chất chống oxy hóa này được sản xuất trong quá trình trao đổi chất bình thường của cơ thể, ví dụ như: glutathion, ubiquinol, và acid uric [69] Một số chất chống oxy hóa khác cũng có trong chế độ ăn Mặc dù có một số hệ thống enzym trong cơ thể có khả năng sàng lọc các gốc tự do, những vi chất dinh dưỡng (vitamin) cơ bản chống oxy hóa là vitamin E (α-tocopherol), vitamin C (acid ascorbic) và B-caroten Tuy nhiên cơ thể không thể tự sản xuất được các vitamin này mà phải được cung cấp trong chế độ ăn uống [45]
Nhiều chất chống oxy hóa “nhặt rác” đã được biết đến, một số là thân nước
và một số khác thân dầu Vitamin C, acid uric, bilirubin, albumin, và thiol là chất chống oxi hóa thân nước Trong khi vitamin E, lycopen và ubiquinol là chất chống oxy hóa thân dầu Vitamin E được xem là chất chống oxi hóa thân dầu mạnh nhất [30]
1.4 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu
Trang 2416
răng cưa thô, to dài khoảng 5-11 cm, rộng 25-60mm, gần như không có cuống Hoa nhỏ, màu hồng, mọc thành ngù ở ngọn cành Quả có đường kính từ 6-7 mm, chín có màu đen Hạt có từ 4-6, dài 4mm Mùa hoa quả vào tháng 5-10 hàng năm [11], [7]
1.4.3 Phân bố
Cây gối hạc xuất hiện rộng khắp trong những cánh rừng từ Tây Bắc đến Tây Nguyên, cây mọc dọc đường đi trong khu vực núi đá Hòa Bình, Hà Tây, Ninh Bình, Lạng Sơn, Quảng Ninh qua các tỉnh miền Trung đến tận Kiên Giang (đảo Phú Quốc), tiêu biểu nhất là vùng núi Thái Nguyên, Di Linh (Lâm Đồng), An Giang…Tại các nước như Ấn Độ, Trung Quốc, Malaixia, mọc hoang ở chỗ râm mát trên các đồi núi ven rừng, chân núi và cũng trồng bằng cách giâm cành [11]
1.4.4 Thành phần hóa học
Cho đến nay có rất ít công trình nghiên cứu công bố về thành phần hóa học của cây gối hạc Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương và cộng sự, trong lá cây gối hạc có chứa hợp chất phenolic [8]
1.4.5 Công dụng
Theo Đông y, rễ gối hạc có vị đắng ngọt, tính mát, có tác dụng tiêu sưng, thông huyết Do có tác dụng này nên thường được dùng chữa sưng tấy, đơn bắp chuối hay phong thấp sưng đầu gối và chữa đau bụng kinh, rong kinh Hạt được dùng trị giun đũa, giun kim và sán xơ mít Liều thông thường 15-20 g rễ, dùng riêng tán bột hay sắc uống hoặc ngâm rượu uống Phụ nữ sau khi sinh đẻ thường lấy rễ gối hạc sắc uống cho mau khỏe người, ăn uống ngon miệng, đỡ đau người [6], [7]
Trang 2517
chế quá trình peroxyd hóa lipid [66] Dịch chiết methanol của lá cây Leea macrophylla ức chế kích thích sản xuất các chất trung gian gây viêm như:
prostaglandin E2, yếu tố hoại tử khối u α, interleukin-6 và interleukin-1β in vitro ở
đại thực bào phúc mạc chuột Dịch chiết này còn thế hiện tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan và chống viêm mạn trên mô hình gây u bằng hạt bông ở chuột khi thử ở mức liều 100 và 200 mg/kg [30] Ngoài
ra, dịch chiết này cũng thể hiện tác dụng giảm đau ngoại vi khi gây đau quặn bằng
acid acetic khi thử ở các mức liều trên [30] Dịch chiết nước của lá loài Leea guineensis có tác dụng chống viêm, flavonoid và phenolic chiết từ lá loài này có tác
dụng chống oxy hóa [21], [22]
Trang 2618
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU/NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu
tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do
2.1.2 Dược liệu nghiên cứu
Dược liệu dùng trong nghiên cứu là bộ phận lá, rễ của cây Gối hạc được thu hái tại Lạng Giang, tỉnh Bắc Giang vào tháng 12 năm 2012 Mẫu được giám định tên khoa học bởi Tiến sỹ Đỗ Thị Xuyến, Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội và được lưu giữ tại Khoa Hóa Phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu
A B
Hình 2.1 Ảnh chụp cây gối hạc (Leea rubra Blume, Leeaceae)
A Lá cây; B Rễ cây
Trang 2719
2.1.3 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Dược liệu sau khi thu hái, phơi sấy khô, xay thô được chiết bằng cồn 96% ở nhiệt độ phòng 3 lần, mỗi lần 72 giờ Các dịch chiết được gộp lại và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm thu được cao chiết tổng Cao lá có hiệu suất chiết 6,5%, độ
ẩm 4,6%; cao rễ có hiệu suất chiết 3,1%, độ ẩm 1,5%
- Carrageenan (Sigma Aldrich)
- Hóa chất để pha mẫu dược liệu: dimethyl sulfoxid (Merck)
- Hóa chất pha đệm Na2HPO4.2H2O, KH2PO4, HCl, NaOH (Sigma Aldrich)
- Bộ hóa chất xét nghiệm khả năng ức chế COX của hãng Cayman (No.560131)
- Quercetin, ≥ 98%, dạng rắn, tiêu chuẩn HPLC (Sigma Aldrich)
- Xanthin oxidase (42 mg protein/ml, 0,5 U/ mg protein, Sigma Aldrich)
- Lypoxygenase đậu nành (60.000 đơn vị/ml, Sigma Aldrich)
- Các dung môi, hệ đệm dùng cho phản ứng in vitro đạt tiêu chuẩn phân tích
2.1.5 Máy móc, thiết bị, dụng cụ
- Máy đo pH (EUTECH)
- Máy đo độ phù chân chuột Plethysmometer LE 7500 (Letica Scientific Instruments)
- Máy đo đau dùng mâm nóng Hot plate LE 7406 (PanLab)
- Máy li tâm (HERMLE Z300)
- Máy đo quang phổ UV – VIS (SHIMADZU)
- Máy siêu âm (Power sonic 405)
- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek, Hoa Kì) và máy ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì)
Trang 2820
- Máy cất nước 2 lần (Halminton, Hoa Kì)
- Thiết bị khuấy từ (Heidolph, Đức)
- Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)
- Micropipet một đầu kênh và đa kênh với các loại thể tích: 2-10 µl, 10-100 µl,
100-1000 µl, 100-1000-5000 µl (Eppendorf)
- Đầu côn, microtube các loại
- Đồng hồ bấm giây (Nhật Bản)
2.2 Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu gồm hai nội dung chính để giải quyết hai mục tiêu
Nội dung 1: các thử nghiệm in vivo đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm thực
nghiệm:
Đầu tiên cao dịch chiết cồn lá và rễ gối hạc (GHL và GHR) được thử tác dụng giảm đau trung ương và ngoại vi trên chuột nhắt trắng để đánh giá tác dụng giảm đau và chọn được mức liều phù hợp để thử tác dụng chống viêm cấp và mạn trên chuột cống trắng
Tác dụng giảm đau trung ương được thử trên mô hình mâm nóng
Tác dụng giảm đau ngoại vi được thử trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic
Tiếp đến, GHL và GHR được đánh giá tác dụng chống viêm trên chuột cống trắng dựa trên các mức liều được quy đổi từ các thử nghiệm đánh giá tác dụng giảm đau trên chuột nhắt trắng
Tác dụng chống viêm cấp được thử trên mô hình gây phù bằng carrageenan
Tác dụng chống viêm mạn được thử trên mô hình gây u hạt
Nội dung 2: các thử nghiệm in vitro để tìm hiểu cơ chế chống viêm của GHL và
GHR
Thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế emzym: COX, LOX
Thử nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do: O2.-, DPPH
Trang 2921
Nghiên cứu được thiết kế theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 2.1 Thiết kế các nội dung nghiên cứu
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm
2.3.1.1 Phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau trung ương bằng phương pháp mâm nóng
Bố trí thí nghiệm:
Đánh giá tác dụng giảm đau của thuốc trên thần kinh trung ương bằng phương pháp mâm nóng thực hiện trên chuột nhắt trắng [48] Đặt từng chuột nhắt trắng lên máy đo phản xạ đau bằng mâm nóng có nhiệt độ ổn định trong khoảng 55 – 56 o
C Sử dụng đồng hồ trên thiết bị để xác định thời gian phản ứng đau của từng
Trang 3022
chuột Chỉ chọn những chuột nhắt trắng có thời gian phản ứng đau từ 8 đến 30 giây
để đưa vào nghiên cứu.Sau đó, chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành các lô:
Lô chứng: uống dung môi Na- CMC 5%
Lô đối chiếu: uống codein liều 60 mg/kg pha trong Na-CMC 5%
Các lô thử thuốc: uống GHL và GHR ở các mức liều 100mg/kg, 200 mg/kg, 400mg/kg pha trong Na-CMC 5%
Sau một thời gian để chân trên mâm nóng chuột sẽ có phản xạ nhảy lên hoặc liếm chân sau Ghi lại thời gian từ lúc chuột được đặt lên mâm nóng tới lúc chuột có phản xạ nhảy lên hoặc liếm chân sau trước và sau khi dùng thuốc để tính kết quả Chuột được uống dung môi pha thuốc hoặc chế phẩm nghiên cứu với cùng thể tích 1ml/100g chuột vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 4 ngày trước khi làm thực nghiệm Trước khi dùng chế phẩm nghiên cứu 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường Vào ngày thứ 5, chuột được uống dung môi pha thuốc, chế phẩm đối chiếu, thuốc đối chiếu 90 phút sau sử dụng mâm nóng để xác định thời gian phản ứng với nhiệt của từng chuột
Quy trình tiến hành thí nghiệm được mô tả ở hình 2.2
Hình 2.2 Quy trình thí nghiệm giảm đau trung ương theo phương pháp mâm
nóng
Thông số đánh giá: Thời gian phản ứng với nhiệt độ sau khi cho chuột uống thuốc
[30]
Trang 31 Lô chứng: uống dung môi Na- CMC 5%
Lô đối chiếu: uống indomethacin liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 5%
Các lô thử thuốc: uống GHL và GHR ở các mức liều 100mg/kg, 200 mg/kg, 400mg/kg pha trong Na-CMC 5%
Chuột được uống dung môi pha thuốc, chế phẩm nghiên cứu với cùng thể tích 1ml/100g chuột vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 4 ngày trước khi làm thực nghiệm Trước khi dùng chế phẩm 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường Ngày thứ năm, 1 giờ sau khi được dùng dung môi, thuốc đối chiếu, chế phẩm nghiên cứu lần cuối cùng, chuột được gây đau quặn bằng tiêm phúc mạc dung dịch acid acetic
Cơn đau sẽ xuất hiện ở chuột sau khi tiêm màng bụng dung dịch acid acetic 1% với thể tích 0,1 ml/10 g chuột cho tất cả các chuột Một cơn đau quặn được tính bằng biểu hiện ép sát bụng xuống bàn, xoáy vặn mình và duỗi ít nhất 1 chân ra sau Đặt mỗi chuột vào 1 lồng trong suốt và đếm số lần đau quặn trong mỗi 10 phút liên tục từ sau gây đau đến phút thứ 30 sau khi tiêm chất gây đau
Quy trình trình thí nghiệm được mô tả như hình 2.3
Trang 3224
Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm giảm đau ngoại vi bằng phương pháp gây đau
quặn bằng acid acetic
Lô chứng: uống dung môi Na- CMC 5%
Lô đối chiếu: uống indomethacin liều 10 mg/kg pha trong Na-CMC 5%
Các lô thử thuốc: uống GHL và GHR ở các mức liều 100mg/kg, 200 mg/kg pha trong Na-CMC 5%
Chuột được uống dung môi pha thuốc hoặc chế phẩm nghiên cứu với cùng thể tích 1 ml/100g chuột vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 4 ngày trước khi làm thực nghiệm Trước khi uống thuốc 1,5 giờ chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường
Trang 3325
Ngày thứ năm, sử dụng máy đo độ phù Plethysmometer LE 7500 (Letica Scientific Instruments) để đo thể tích bàn chân sau phải của từng chuột Sau khi uống dung môi, thuốc đối chiếu hoặc chế phẩm nghiên cứu lần cuối cùng, chuột được tiêm carrageenan 1% trong nước muối sinh lý vào gan bàn chân phải sau Đo thể tích bàn chân phải sau của từng chuột vào các thời điểm 1, 3, 5, 7 giờ sau khi gây viêm
Quy trình tiến hành thí nghiệm được mô tả ở hình 2.4:
Hình 2.4 Qui trình thí nghiệm tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù
bàn chân chuột bằng carrageenan
Thông số đánh giá:
+ Thể tích bàn chân phải sau của từng chuột
+ Mức độ phù bàn chân sau phải của từng chuột được tính theo công thức [60]
∆V (%) = [(Vt – V0)/V0] x 100%
Trong đó:
∆V (%): Mức độ phù bàn chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm
V0, Vt: Thể tích bàn chân chuột trước khi gây viêm tại thời điểm t giờ sau khi
gây viêm
Trang 34I (%): Phần trăm ức chế phù của lô thử so với lô chứng
∆Vc, ∆Vt: Mức độ phù chân chuột trung bình ở lô chứng và lô thử
2.3.1.4 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm mạn bằng mô hình gây u hạt
Bố trí thí nghiệm:
Gây u hạt thực nghiệm bằng cách cấy bông đã tiệt trùng vào dưới da lưng của chuột cống trắng [37] Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành các lô:
Lô chứng: uống dung môi Na- CMC 5%
Lô đối chiếu: uống prednisolon liều 5 mg/kg pha trong Na-CMC 5%
Các lô thử thuốc: uống GHL và GHR ở các mức liều 100mg/kg, 200 mg/kg pha trong Na-CMC 5%
Ngày thứ 1: gây mê cho tất cả chuột bằng ether, gây u hạt bằng cách cấy viên bông đã tiệt trùng được tẩm carrageenan có khối lượng 20 ± 2 g vào dưới da lưng của chuột trong điều kiện bán vô trùng Ngay sau khi gây u hạt chuột được uống chế phẩm nghiên cứu, thuốc đối chiếu, uống Na-CMC 5% (lô chứng) trong 7 ngày liên tục
Đến ngày thứ 7, 5 giờ sau khi cho chuột uống thuốc lần cuối gây mê chuột, bóc tách u hạt cân tươi, sau đấy sấy khô ổ u hạt ở nhiệt độ 600C trong 10 giờ đến khối lượng không đổi và cân khối lượng u hạt sau khi sấy khô
Quy trình thí nghiệm như hình 2.5
Trang 3527
Hình 2.5 Quy trình thí nghiệm tác dụng chống viêm mạn bằng mô hình gây u
hạt
Thông số đánh giá:
+ Khối lượng tăng u hạt trước và sau khi mổ của từng chuột
+ Phần trăm ức chế viêm của lô thử so với lô chứng được tính theo công thức [38],
[71]:
I (%) =
x 100%
Trong đó: I (%): Phần trăm ức chế viêm mạn của lô thử so với lô chứng
mc, mt: khối lượng tăng ổ u hạt của lô chứng và lô thử
2.3.2 Phương pháp xác định cơ chế chống viêm in vitro
2.3.2.1 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme cyclooxygenase (COX-1,
COX-2) in vitro
Đánh giá tác dụng ức chế COX-1, COX-2 theo phương pháp định lượng
Elisa do hãng Cayman (Mỹ, No.560131) cung cấp và hướng dẫn [39], [51]
Nguyên tắc:
Acid arachidonic sẽ chuyển thành PGH2 sau phản ứng được xúc tác bởi
enzym cyclooxygenase (COX), PGH2 tạo ra được khử hóa bởi SnCl2 tạo PGF2α là
chủ yếu Các prostaglandin tạo thành được gắn với kháng huyết thanh và chất đánh
dấu Đo độ hấp thụ quang của phức hợp kháng huyết thanh-prostaglandin-chất đánh