Nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm, độc tính của chế phẩm naphtoquinon từ củ Sâm đại hành (Eleutherine bulbosa (Mill.), URB.) trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIM HUẾ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM, ĐỘC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM NAPHTOQUINON TỪ CỦ SÂM ĐẠI HÀNH (ELEUTHERINE BULBOSA (MILL.), URB.) TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIM HUẾ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM, ĐỘC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM NAPHTOQUINON TỪ CỦ SÂM ĐẠI HÀNH (ELEUTHERINE BULBOSA (MILL.), URB.) TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 8720205 Người hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Thị Nguyệt Quế TS Bùi Kim Anh HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Với tất lòng kính trọng biết ơn tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Nguyệt Quế, môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, động viên, khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn TS Bùi Kim Anh TS Phạm Thị Bích Hạnh, Viện hóa học – Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam bảo giúp đỡ tơi nhiều suốt q trình nghiên cứu hồn thiện luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên, em sinh viên nghiên cứu khoa học môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội bên tôi, giúp đỡ tơi q trình tơi thực hồn thiện luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ suốt trình học tập Luận văn hỗ trợ kinh phí Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (VAST) đề tài mã số VAST.ƯDCN.01/16-18 Tôi chân thành cảm ơn thành viên nhóm thực đề tài giúp đỡ tơi q trình thực nghiệm hồn thiện luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đồng hành, động viên, chia sẻ với gần hai năm học tập nghiên cứu mái trường Dược thân yêu! Hà Nội, ngày 01 tháng năm 2019 HỌC VIÊN Nguyễn Thị Kim Huế MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Phần TỔNG QUAN Tổng quan đau đích tác dụng thuốc giảm đau 1.1 Định nghĩa, phân loại, đường dẫn truyền cảm giác đau 1.2 Một số đích tác dụng thuốc giảm đau 1.2.1 Kích thích receptor opioid (µ, k, δ): 1.2.2 Ức chế enzym cyclooxygenase (COX) Tổng quan viêm số đích tác dụng thuốc chống viêm 2.1 Khái niệm, phân loại sinh lý viêm 2.2 Một số đích tác dụng thuốc chống viêm 2.2.1 Ức chế cyclooxygenase (COX) 2.2.2 Ức chế enzym lypoxygenase (LOX) 11 2.2.3 Ức chế phospholipase A2 12 2.2.4 Một số đích tác dụng khác Một số mơ hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau, chống viêm 14 3.1 Một số mơ hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng giảm đau 14 3.1.1 Mơ hình gây đau quặn chuột Koster (Writhing test) 14 3.1.2 Mô hình gây đau phiến nóng (hot plate method) 14 3.2 Một số mơ hình thực nghiệm nghiên cứu tác dụng chống viêm 15 3.2.1 Mơ hình nghiên cứu chống viêm cấp in vivo 15 3.2.2 Mơ hình đánh giá tác dụng chống viêm mạn in vivo 16 3.2.3 Mơ hình nghiên cứu chống viêm in vitro 17 Tổng quan dược liệu nghiên cứu 19 4.1 Giới thiệu Sâm đại hành 19 12 4.2 Một số nghiên cứu thành phần hóa học Sâm đại hành 20 4.3 Một số nghiên cứu tác dụng sinh học củ Sâm đại hành 22 Phần NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Nguyên vật liệu 25 2.1.1 Dược liệu nghiên cứu mẫu nghiên cứu 25 2.1.2 Động vật tế bào thí nghiệm 27 2.1.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 27 2.2 Thiết kế nghiên cứu 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm NEB 30 2.3.1.1 Đánh giá tác dụng giảm đau phương pháp gây đau quặn acid acetic 30 2.3.1.2 Đánh giá tác dụng chống viêm cấp NEB 32 2.3.1.3 Đánh giá tác dụng chống viêm mạn NEB 33 2.3.1.4 Đánh giá tác dụng ức chế COX-2 tế bào RAW264.7 35 2.3.2 Phương pháp đánh giá độc tính mẫu thử 37 2.3.2.1 Phương pháp đánh giá độc tính cấp tính 37 Sơ đồ 2.5 Đánh giá độc tính cấp tính 38 2.3.2.2 Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn 38 2.4 Xử lý số liệu 40 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41 3.1 Kết đánh giá tác dụng giảm đau NEB 41 3.2 Tác dụng chống viêm NEB 42 3.2.1 Tác dụng chống viêm cấp NEB 42 3.2.2 Tác dụng chống viêm mạn NEB 43 3.2.3 Tác dụng ức chế cyclooxygenase (COX-2) tế bào RAW264.7 44 3.3 Kết đánh giá độc tính NEB 45 3.3.1 Kết đánh giá độc tính cấp NEB 45 Từ kết bảng 3.5 bảng 3.6 ta thấy: 46 3.3.2 Kết đánh giá độc tính bán trường diễn NEB 46 3.3.2.1 Tình trạng chung thay đổi cân nặng chuột 46 3.3.2.2 Kết ảnh hưởng NEB số huyết học 48 3.3.2.3 Kết ảnh hưởng NEB đến chức gan chuột cống trắng giống thực nghiệm 50 3.3.2.4 Kết ảnh hưởng NEB đến chức gan chuột cống trắng giống đực 53 3.3.2.6 Kết ảnh hưởng NEB đến chức thận chuột cống trắng giống 55 3.3.2.7 Kết ảnh hưởng NEB đến chức thận chuột cống trắng giống đực 57 Phần BÀN LUẬN 59 4.1 Về tác dụng giảm đau NEB mơ hình gây đau quặn aid acetic 59 4.2 Tác dụng chống viêm in vivo NEB 60 4.2.1 Tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù chân chuột carrageenin 60 4.2.2 Tác dụng chống viêm mạn mơ hình gây u hạt thực nghiệm 62 4.2.3 Về tác dụng COX-2 NEB 63 4.3 Về độc tính cấp NEB 65 4.4 Độc tính bán trường diễn 65 KẾT LUẬN 68 KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ COX -1 Enzym cyclooxygenase -1 COX-2 Enzym cyclooxygenase -2 DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-liked immunosorbent assay eNOS Endothelial nitric oxide synthase IASP International Association for the Study of Pain IC50 Inhibitory concentration 50%, nồng độ ức chế 50% IgG Immunoglobulin G IL-6 Interleukin-6 INF Interferon iNOS Nitric oxyd synthase iNOS Inducible nitric oxide synthase LD50 Lethal dose, 50%, liều gây chết 50 % LOX Enzym Lypooxygenase LPS Lipopolysaccharid MCV Thể tích trung bình hồng cầu MCH Số lượng hemoglobin trung bình NEB Chế phẩm naphtoquinon từ củ sâm dại hành NF-κB Nuclear factor-kappaB nNOS Neuronal nitric oxide synthase NO Nitric oxide NSAIDs Thuốc chống viêm không steroid PG Prostaglandin PGI Protacyclin VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ PLT Số lượng tiểu cầu RBC Số lượng hồng cầu ROS Reactive oxygen species TNF Tumor necrosis factor TNF-α Tumor necrosis factor-alpha WBC Số lượng bạch cầu DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình Hình 1.1 Con đường chuyển hóa acid arachidonic thơng qua COX [63] 10 Hình 1.2 Con đường chuyển hóa acid arachidonic thơng qua 5-LOX [31] 11 Hình 1.3 Cây Sâm đại hành (Eleutherine bulbosa) 20 Hình 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu (thái lát: trái; bột: phải) 25 Hình 2.2 Quy trình chiết tách chế phẩm NEB quy mơ 30 kg dược liệu khô/mẻ 27 Sơ đồ Sơ đồ 2.1 Thiết kế nội dung nghiên cứu 30 Sơ đồ 2.2 Nghiên cứu tác dụng giảm đau quặn acid acetic 31 Sơ đồ 2.3 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenin 32 Sơ đồ 2.4 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn mơ hình gây u hạt 34 Sơ đồ 2.5 Đánh giá độc tính cấp tính 38 Sơ đồ 2.6 Đánh giá độc tính bán trường diễn 39 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Công thức stacking gel resolving gel 36 Bảng 3.1 Số đau quặn chuột thời điểm thí nghiệm 41 Bảng 3.2 Ảnh hưởng NEB lên mức độ phù bàn chân chuột (%) 42 Bảng 3.3 Ảnh hưởng NEB lên khối lượng u hạt chuột cống trắng 43 Bảng 3.5 Số chuột chết 72 đầu thử độc tính cấp NEB 45 Bảng 3.6 Mơ tả tình trạng chuột lơ thử nghiệm vòng ngày 45 Bảng 3.7 Ảnh hưởng NEB đến tỷ lệ tăng khối lượng chuột cống 474 Bảng 3.8 Ảnh hưởng NEB đến tỷ lệ tăng khối lượng chuột cống đực 47 Bảng 3.9 Ảnh hưởng NEB số huyết học chuột cống trắng 48 Bảng 3.10 Ảnh hưởng NEB số huyết học chuột cống trắng đực 49 Bảng 3.11 Ảnh hưởng NEB đến số protein toàn phần, cholesterol toàn phần, AST, ALT chuột cống trắng giống 50 Bảng 3.12 Hình ảnh vi thể gan lơ chuột (Nhuộm HEx400 PAS x400) 52 Bảng 3.13 Ảnh hưởng NEB đến thông số protein toàn phần, cholesterol toàn phần, AST, ALT chuột cống trắng giống đực 53 Bảng 3.14 Hình ảnh vi thể gan lơ chuột đực (Nhuộm HEx400 PAS x400) 54 Bảng 3.15 Ảnh hưởng NEB đến số creatinin huyết chuột cống trắng giống 55 Bảng 3.16 Hình ảnh mô bệnh học thận lô chuột (Nhuộm HEx400 PAS x400) 56 Bảng 3.17 Ảnh hưởng NEB đến số creatinin huyết chuột cống trắng giống đực 57 Bảng 3.18 Hình ảnh mơ bệnh học thận lơ chuột đực (Nhuộm HEx400 PAS x400) 58 tìm hiểu sâu chế tác dụng với đích nghiên cứu chất trung gian đáp ứng viêm có chất protein (COX-2, PGE2, iNOS) cytokin viêm (IL-1β, TNF-α); NO mức độ biểu gen gây viêm COX-2, iNOS (thông qua định lượng mARN) [65], [71], [86] Hiện nay, Việt Nam có cơng trình luận án Sâm đại hành Đỗ Thị Thanh Huyền (2016) Đối với Sâm đại hành, luận án phân lập 14 hợp chất từ củ Sâm đại hành, thử hoạt tính chống viêm theo đường uống bơi 14 hợp chất có nghiên cứu tác dụng ức chế sản sinh cytokine gây viêm từ tế bào tua Dendritic Cell sinh tủy xương kích thích LPS 14 hợp chất phân lập từ củ sâm đại hành Kết cho thấy có hợp chất có hoạt tính tốt ức chế sản sinh các cytokine IL-12 p40 IL-6 từ tế bào tua (DCs) sinh từ tủy xương [9] Chưa có nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế COX-2 Sâm đại hành Chính vậy, đề tài chúng tơi lựa chọn mơ hình RAW264.7 đích phân tử COX-2 để tìm hiểu chế chống viêm Sâm đại hành điểm bổ sung thêm chứng khoa học tác dụng chống viêm dược liệu Đề tài triển khai thành cơng mơ hình gây tăng sản xuất COX-2 RAW264.7 kích thích LPS (1 µg/ml) Mơ hình sử dụng chứng dương indomethacin với nồng độ 0,25 mM ức chế tổng hợp COX-2 RAW264.7 có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) với mức độ ức chế 49,9 % so với lô chứng viêm Tại nồng độ thử 1,5; 3,0 6,0 µg/ml, mức độ biểu COX-2 giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng viêm (p < 0,05), với mức độ ức chế 46,0 %; 49,3 % 52,6 %, đề tài kết luận tác dụng ức chế COX-2 NEB phụ thuộc vào nồng độ Trước lựa chọn nồng độ thử trên, đánh giá ảnh hưởng NEB đến khả sống sót tế bào RAW264,7 phương pháp MTT để xác định nồng độ thử NEB thử với dải nồng độ là: 6,25 ; 12,5 ; 25 ; 50 ; 100 µg/ml phương pháp MTT, Kết thu sau: - Tại nồng độ >= 12,5 µg/ml NEB gây độc với tế bào 64 - Chỉ có nồng độ NEB 6,25 µg/ml khơng gây độc tế bào , nên lựa chọn NEB nồng độ là: 6,0; 3,0; 1,5 µg/ml để đánh giá tác dụng ức chế COX-2 tế bào RAW264.7 kỹ thuật Western blot Nguyên tắc phương pháp MTT: MTT : 3- (4,5 – Dimethylthiazol – 2-yl) – 2,5 – Diphenyltetrazolium Bromid)  Đánh giá độ ảnh hưởng NEB đến khả sơng sót tế bào dựa mức độ hoạt động enzym dehydrogenase ty thể tế bào sống sót lại sau xử lý với mẫu thử  Enzym dehyrogenase biến đổi tetrazolium có màu vàng nhạt sang Formazan có màu vàng đậm, chế phát dưa đo màu bước sóng 570 nm 4.3 Về độc tính cấp NEB Chế phẩm naphtoquinon tách chiết từ củ Sâm đại hành cho uống với liều cao cho uống 23g /kg cân nặng (4ml/kg) chuột hoạt động bình thường, khơng có biểu độc tính Chỉ có 1con chuột chết (trong vòng ngày) Trước chết chuột có biểu thở mạnh, tái nhợt, co giật chết Kết mổ quan sát đại thể cho thấy: dày chứa đầy thuốc, phổi hồng hào, tim gan, thận, phổi, lách, nhu động ruột bình thường, không quan sát biểu bất thường Trong vòng ngày sau uống NEB: Các chuột hoạt động bình thường, phân, nước tiểu bình thường, niêm mạc hồng hào, lông mượt, phản xạ tốt với kích thích Mặt khác lơ chuột nhắt trắng uống NEB liều 18,4 g/kg chuột/ngày (bằng 80% liều cao cho chuột uống), thu kết tất chuột hoạt động, ăn uống bình thường, phân nước tiểu bình thường, phản xạ tốt với kích thích, khơng có biểu bất thường Do không xác định LD50 4.4 Độc tính bán trường diễn Tình trạng chung thay đổi cân nặng chuột - Trong suốt thời gian thí nghiệm chuột lơ hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, lơng mượt, mắt sáng, phân khơ, nước tiểu bình thường Khơng thấy có biểu bất thường lô chuột suốt trình nghiên cứu - Trong suốt 28 ngày nghiên cứu, cân nặng chuột cống tăng lô thử 65 lô chứng Ở lô uống NEB liều 21 mg/kg cân nặng chuột tăng tốt so với lô chứng thời điểm 14 ngày sau uống thuốc (p