Nghiên cứu tác dụng bảo vệ tế bào gan của me rừng (Phyllanthus emblica L. Euphorbiaceae) trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ UYÊN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA ME RỪNG (PHYLLANTHUS EMBLICA L EUPHORBIACEAE) TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI-2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ UYÊN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA ME RỪNG (PHYLLANTHUS EMBLICA L EUPHORBIACEAE) TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ- DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 8720205 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thùy Dương PGS.TS Đỗ Thị Hà HÀ NỘI-2019 LỜI CẢM ƠN Tôi xin cảm ơn Sở Khoa học Công nghệ Thành phố Hà Nội tài trợ cho đề tài này, phần đề tài “Nghiên cứu bào chế thực phẩm bảo vệ sức khoẻ dạng viên nang cứng có tác dụng bảo vệ gan từ Me rừng (Phyllanthus emblica L.)”, mã số 01C-06/03-2017-3 Với tất lịng kính trọng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thùy Dương rộng lòng trao cho hội làm nghiên cứu thực nghiệm, cổ vũ, đưa nhận xét nghiêm khắc, quan trọng suốt q trình làm nghiên cứu tơi; cẩn thận đọc câu chữ, hiệu đính tỉ mỉ nhiệt thành giúp tơi hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đặc biệt tới PGS.TS Đỗ Thị Hà đưa ý tưởng, chia sẻ, ủng hộ ân cần góp ý với tơi để hồn thiện luận văn Với lịng u mến kính phục, tơi xin dành tặng luận văn tới Ths Phạm Đức Vịnh, người thầy dạy dỗ điều quan trọng đầy lòng yêu thương tận tụy Cảm ơn em Trần Thảo Hương, người cộng mà vô quý mến đồng hành chặng đường làm đề tài Có thể nói, ngày tháng bộn bề cơng việc, khơng có hỗ trợ em tơi gặp nhiều khó khăn đến nhường Cảm ơn tồn thể thầy cơ, anh chị kỹ thuật viên, em sinh viên nghiên cứu khoa học môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội san sẻ cơng việc, giúp đỡ tơi q trình tơi thực hoàn thiện luận văn Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đồng hành, động viên, chia sẻ với gần hai năm học tập nghiên cứu mái trường Dược thân yêu! Hà Nội, ngày 31 tháng năm 2019 Nguyễn Thị Uyên MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Một số chế liên quan đến tổn thương tế bào gan 1.1.1 Vai trị stress oxy hóa gốc tự tổn thương tế bào gan 1.1.2 Vai trò AMPK tổn thương tế bào gan 1.2 Thông tin dược liệu Me rừng 11 1.2.1 Đặc điểm thực vật 11 1.2.2 Phân bố, thu hái chế biến .12 1.2.3 Thành phần hóa học 13 1.2.4 Tác dụng dược lý Me rừng 14 1.3 Các nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ gan Me rừng 20 1.3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Me rừng in vivo 21 1.3.1.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Me rừng mô gây độc gan CCl4………………………………………………………………………………… .21 1.3.1.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Me rừng mơ hình gây độc gan ethanol………………………………………………………………………… 22 1.3.1.3 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Me rừng số mơ hình gây độc gan tác nhân khác 23 1.3.2 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan Me rừng in vitro .23 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Nguyên vật liệu thí nghiệm 26 2.1.1 Hóa chất, thuốc thử .26 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm .26 2.2 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2.1 Dược liệu mẫu nghiên cứu .27 2.2.2 Động vật thí nghiệm 27 2.3 Nội dung nghiên cứu 27 2.3.1 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình in vivo 27 2.3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng in vitro…… 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình in vivo .29 2.4.1.1 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan mơ hình gây độc gan cấp CCl4 29 2.4.1.2 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan mô hình gây độc gan mạn ethanol 30 2.4.1.3 Phương pháp xác định thông số nghiên cứu mơ hình in vivo 32 2.4.2 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng in vitro 35 2.4.2.1 Xác định nồng độ cao định chuẩn Me rừng phương pháp MTT dùng để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro 35 2.4.2.2 Đánh giá khả ức chế tích tụ lipid cao định chuẩn Me rừng tế bào HepG2 thử nghiệm Oil Red O 36 2.4.2.3 Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK ức chế ACC tế bào HepG2 cao định chuẩn Me rừng phương pháp Western blot 37 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 39 PHẦN KẾT QUẢ 40 3.1 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng in vivo 40 3.1.1 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình gây độc gan CCl4 40 3.1.1.1 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hoạt độ ASAT ALAT huyết chuột bị gây độc gan CCl4 40 3.1.1.2 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hàm lượng MDA gan chuột bị gây độc gan CCl4 .41 3.1.1.3 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hàm lượng GSH gan chuột bị gây độc gan CCl4 .42 3.1.1.4 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hoạt độ SOD gan chuột bị gây độc gan CCl4 44 3.1.1.5 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hình ảnh vi thể gan chuột bị gây độc gan CCl4 45 3.1.2 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình gây độc gan ethanol .47 3.1.2.1 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hoạt độ ASAT ALAT huyết chuột bị gây độc gan ethanol .47 3.1.2.3 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hàm lượng GSH gan chuột bị gây độc ethanol .50 3.1.2.4 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hoạt độ SOD gan chuột bị gây độc ethanol .51 3.1.2.5 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng đến hình ảnh vi thể gan chuột bị gây độc gan ethanol 52 3.2 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng in vitro 54 3.2.1 Xác định nồng độ cao định chuẩn Me rừng phương pháp MTT dùng để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan in vitro 54 3.2.2 Khả ức chế tích tụ lipid tế bào HepG2 cao định chuẩn Me rừng thử nghiệm Oil Red O 55 3.3.3 Khả hoạt hóa AMPK ACC tế bào HepG2 cao định chuẩn Me rừng phương pháp Western Blot 58 PHẦN BÀN LUẬN 61 4.1 Bàn luận kết đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng in vivo .61 4.1.1 Tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình gây độc gan cấp tính CCl4 61 4.1.2 Tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng mơ hình gây độc gan mạn tính ethanol .64 4.2 Bàn luận kết đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan cao định chuẩn Me rừng in vitro 67 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) ACC Acetyl-CoA Carboxylase AICAR Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide AMPK AMP activated protein kinase ALAT Alanin amino transferase ASAT Aspartat amino transferase CAT Catalase CCl4 Carbon tetraclorid CPT I carnitine palmitoyl transferase I DMSO Dimethyl sulfoxid DMF Dimethylformamid DTNB 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl HepG2 liver hepatocellular cells GSH Glutathion dạng khử GSH-Px Glutathion peroxidase IL-1β Interleukin beta MCD Malonyl-CoA decarboxylase MDA Malondialdehyd MTT 3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid NBT Nitrotetrazolium clorid LPO Phosphoryl ACC p-ACC Phosphoryl AMPK p-AMPK Lipid peroxidation PPARα peroxisome proliferator-activated receptor-α PUFAs Polyunsaturated fatty acids SREBP Sterol regulatory element-binding protein SOD Superoxid dismutase ROS Reactive oxygen species THF Tetrahydrofuran TGF-β Transforming growth factor beta TNF-α Tumor necrosis factor alpha VLDL Very low-density lipoprotein DANH MỤC BẢNG STT Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Thành phần hóa học Me rừng 13 Bảng 1.2 Tác dụng bảo vệ tế bào gan Me rừng 16-17 Bảng 1.3 Tác dụng bảo vệ tim mạch Me rừng 18 Bảng 1.4 Tác dụng bệnh đái tháo đường Me rừng 19 Ảnh hưởng cao định chuẩn Me rừng so đến hoạt độ Bảng 3.1 ASAT ALAT huyết chuột bị gây độc gan 40 CCl4 Bảng 3.2 Tỷ lệ tế bào HepG2 sống sót ủ với cao định chuẩn Me rừng mức nồng độ khác 54 HepG2 thử nghiệm Oil red O Western Blot, đánh giá khả sống sót tế bào ủ với cao định chuẩn Me rừng tế bào ung thư gan HepG2 mức nồng độ khác cần thiết Trước tiên, nghiên cứu đánh giá tỷ lệ tế bào HepG2 sống sót ủ với cao định chuẩn Me rừng nồng độ 3, 10, 30, 100 µM thơng qua thử nghiệm MTT Kết nghiên cứu cho thấy mức nồng độ cao định chuẩn Me rừng