Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập thành phần flavonoit từ lá cây me rừng (phyllanthus emblica)

Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Cùng với phát triển khoa học công nghệ ô nhiễm môi trường nảy sinh vấn đề khác, ví dụ bệnh nguy hiểm (ung thư, kháng sinh, cúm H1N1, H7N9, ) Nguyên nhân bệnh đến từ nhiều nguồn khác nhau, ô nhiễm môi trường, kháng sinh Trước tình trạng đó, nhiều quốc gia giới tiến hành chương trình nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất từ thiên nhiên, với hy vọng dược phẩm có nguồn gốc thực - động vật giúp giảm thiểu bệnh nguy hiểm nêu trên, tăng cường công tác chăm sóc sức khỏe kéo dài tuổi thọ người Những nghiên cứu tìm kiếm họp chất có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng y học, nông nghiệp mục đích khác đời sống người trở thành nhiệm vụ quan trọng quốc gia giới Là quốc gia nằm khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa tương đối lớn, độ ẩm cao (khoảng 80%), nhiệt độ trung bình khoảng từ 15 - 27°c, Việt Nam có điều kiện thuận lợi cho sinh vật phát triển tạo phong phú nhiều loài động thực vật nhiều hệ sinh thái khác Điều có ý nghĩa quan trọng tới phát triển y học cổ truyền Việt Nam Trong số loài thực vật Việt Nam, loài thực vật thuộc họ Thầu dầu thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học Ví dụ như: Me rừng ịPhyỉỉanthus embỉica), thuộc họ Thầu dầu, loài sử dụng làm thuốc chữa bệnh từ lâu y học dân gian chữa huyết áp cao, viêm ruột, viêm da, đau họng, đau răng, rắn cắn, Tuy nhiên, để có sở khoa học nhằm phát triển ứng dụng cụ thể loài này, cần có nghiên cứu cụ thể hóa học, hoạt tính sinh học nghiên cứu sâu hon duợc lý để giải thích tác dụng y học cổ truyền loài này, qua tạo sở để tìm kiếm phuơng thuốc điều trị bệnh Xuất phát từ ý nghĩa thục tiễn chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là: Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu phân lập thành phần Oavonoit từ ỉá Me rừng” Khóa luận tập trung nghiên cứu thành phần ílavonoit từ Me rừng bao gồm nội dung là: Thu mẫu Me rừng (Phyllanthus emblica), xử lý mẫu tạo dịch chiết Phân lập họp chất ílavonoit Xác định cấu trúc hóa học họp chất phân lập đuợc CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN 1.1 1.1.1 Giới thiệu chung Me rừng Thực vật học me rừng Cây Me rừng (Hình 1.1) hay gọi chùm ruột núi, chùm ruột rừng, ngót, cam tú, ngưu cam tú, du cam tú, mắc kham Cây có tên khoa học Phyllanthus emblica Đây gỗ nhỏ bụi, cao 3-8(-10) m, vỏ mỏng, màu nâu nhạt, nâu màu xám, nhẵn Thân thường cong queo, phân cành nhiều, cành nhỏ mềm, cành già màu xám nhạt, mang nhánh nhỏ, có lông Cành mang mảnh, màu xanh nhạt Cành mang xếp gần mặt phẳng Phiến hình bầu dục khuôn, hai đầu tù, kích thước (3-)12-20 X (l-)3,5 - mm, nhẵn; gần không cuống ngắn Lá kèm nhỏ, hình tam giác, màu đỏ nâu Hoa đơn tính gốc Hình 1.1 Mẩu lá, tiêu me rừng Hoa nhỏ mọc thành xim co nách phía cành, gồm nhiều hoa đực 12 hoa Hoa đực có cuống ngắn; đài gồm mảnh màu hồng xanh nhạt, hình bầu dục Hoa gần không cuống; đài có thuỳ tương tự hoa đực Quả hình cầu, kích thước 13-25 X 20-30 mm, mọng nước, màu vàng xanh; khô thành nang, tự mở Hạt dạng cạnh, màu hồng nhạt hay nâu nhạt [1, 2, 4, 5] 1.1.2 Phân bố sinh thái Cây mọc phổ biến khắp nơi Việt Nam, tỉnh miền núi trung du phía bắc [1, 2, 4, 5] Me rừng loài có vùng phân bố rộng nhiều nước châu Á, từ Ấn Độ đến Myanmar, Nepal, Thái Lan, Malaysia, Lào, Campuchia, miền nam Trung Quốc Hiện me rừng đưa vào trồng Nhật Bản, Hoa Kỳ Australia 1.1.3 Công dụng Nhiều phận loài Me rừng (p emblỉca L.) có hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, chống suy giảm miễn dịch, kháng độc bảo vệ tế bào gan kim loại màu gây [1, 2, 4, 5], Trong y học dân gian, dùng chữa phù thũng, viêm da, mẩn ngứa Hạt dùng chữa hen, viêm cuống phổi thiểu mật Rễ dùng để chữa huyết áp cao, đau thượng vị, viêm ruột lao hạch bạch huyết [5], Quả thường dùng ăn tươi, làm ô mai, nước hoa quả, giải khát, hầm thịt, làm thuốc nhuộm răng, nước gội đầu để kích thích mọc tóc Quả dùng làm thuốc chữa bệnh thiếu vitaminC (bệnh Scorbut), viêm đau gan, vàng da, rối loạn tiết mật, viêm đau dày, kiết lỵ, tiêu chảy, nhuận tràng, kích thích tiêu hóa, lợi tiểu, đái đường, giải nhiệt, xuất huyết, cầm máu, thiếu máu, giảm huyết áp, đau nhức đầu, đau nhức mắt, giảm sốt, choáng váng, ho, viêm phế quản, viêm sưng phổi, Hạt dùng chữa hen suyễn, viêm phế quản, thiểu mật, Hoa dùng làm thuốc nhuận tràng, giải nhiệt làm thuốc xổ Lá me dùng làm thuốc giải nhiệt, chữa phù thũng số bệnh da Vỏ thân dùng làm thuốc chữa tiêu chảy, lỵ amip, cầm máu Rễ dùng để chữa trị bệnh cao huyết áp, đau thượng vị, viêm ruột, lao hạch bạch huyết, Cộng đồng dân tộc miền núi Việt Nam nước Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, thường sử dụng phận Me, đặc biệt để ăn làm thuốc rộng rãi [1, 2, 4, 5] 1.1.4 Thành phần hóa học Quả me rừng có vị chua, nguồn nguyên liệu giàu vitamin c Trong chứa trigalloyglucose, ellagic acid, corilagin, terchebin, phylleblin, phyllemblic acid emblicol Các nghiên cứu gần cho biết vitamin c acid gallic có đặc tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn Hoạt tính ức chế trình oxy hóa tác dụng tannin, emblicanin A, emblicanin B, punigluconin pedunculagin me rừng [5] Phyllemblin coi hoạt chất có tác dụng tương tự adrenalin, gây giảm đau, an thần, đặc biệt với hệ thần kinh trung ương [5], Những acid hữu me rừng như: acid aspartic, ellagic, gallic, myristic, ascorbic, alanine, glycine, histidine, methionine, niacin, tyrosine với số họp chất tannin coi có tác dụng phòng chống số dạng ung thư kìm hãm phát triển virut HIV [5], Lá nguồn nguyên liệu giàu ílavonoid, tannin sterol Từ tách chiết hoạt chất ellagic acid, amlaic acid, kaempferol-3- glucoside, kaempíerol, lupeol, a-amyrin acetat, phytosterol C29 P- sitosterol, poriíerasterol, P-sitosterol-3-O-D-glucopyranosid [5], Vỏ chứa P-sitoserol,(+)-leucodelphinidin (3,75%), lupeol (2,25%) tannin Thành phần chủ yếu tannin gồm phyllembin, gallotannin 1,2,3trigalloyglucose, ellagitannin terchebin, corilagin, chebulagic acid, chebulinic acid Hạt chứa khoảng 16% dầu béo, chủ yếu linoleic acid (44%), oleic acid (28,4%), linolenic acid, stearic acid, palmatic myristic acid [5] r r r Dưới ví dụ vê câu trúc sô họp chât từ me rừng: □H Keamfero □ Quercetin Emblicanin A Emblicanin B Hình 1.2 Cấu trúc ) họp chất từ me rừng 1.2 Giới thiệu lóp chất Havonoit [10-14] Flavonoit nhóm họp chất phân bố rộng rãi tự nhiên Cho đến có 4000 Flavonoit tìm thấy từ thực vật Ban đầu chúng phát với vai trò sắc tố thực vật vào mùa thu loài hoa, dần chuyển sang màu vàng, da cam, đỏ Các Flavonoit tìm thấy rau, quả, hạch, hạt, cỏ, gia vị, thân cây, loại hoa chè rượu vang đỏ Flavonoit có mặt hầu hết phận lá, hoa, quả, phấn, rễ, cư trú thành tế bào Nó tham gia vào tạo thành màu sắc đặc biệt hoa (tạo cho hoa màu sắc rực rỡ để quyến rũ loại côn trùng giúp cho thụ phấn cây) Các ílavonoit lóp chất phổ biến có thực vật Chúng họp chất có cấu tạo gồm vòng benzen A, B nối với dị vòng c với khung cacbon C6-C3-C6 Việc phân loại ílavonoit dựa khác nhóm C3 (các glicosit có màu vàng nhạt màu ngà; antoxianin antoxianiđrin màu đỏ, xanh, tía dạng không màu; isoílavon, catecin leucoantoxianiđrin chất tan nước thường nằm không bào) o Hình 1.5 Khung Hình 1.6 Khung Aavonol c Flavanonol-3 Flavon (Hình 1.4) ílavonol 1.4 phổ Khung biến tự nhiên Hình 1.3 Khung (Hình 1.5) Hình cácCông thức cấu tạo chúng ílavanchỉ khác vị trí cacbon số ílavon Trong thực vật, ílavon ílavonol thường không tồn dạng tự mà thường dạng glycozit Bên cạnh họp chất có dạng khung ílavan, ílavon, ílavonol có họp chất thuộc dạng Flavanonol-3 (Hình 1.6) số họp chất thuộc khung Chalcon (Hình 1.7), khung auron (Hình 1.8) Hình 1.7 Khung Hình 1.8 Khung họp hợp chất chalcon 1.3 chất Auron Các phương pháp chiết mẫu thực vật Sau tiến hành thu hái làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có mẫu khác (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình, ) mà ta chọn dung môi hệ dung môi khác 1.3.1 Chọn dung môi chiết Thường chất chuyển hoá thứ cấp có độ phân cực khác Tuy nhiên thành phần tan nước quan tâm Dung môi dùng trình chiết cần phải lựa chọn cẩn thận Điều kiện dung môi phải hoà tan chất chuyển hoá thứ cấp nghiên cứu, dễ dàng loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy Dung môi lẫn tạp chất ảnh hưởng đến hiệu chất lượng trình chiết cần phải chưng cất để thu dạng trước sử dụng Thường có số chất dẻo lẫn dung môi diankyl phtalat, tri-n-butylaxetylcitrar tributylphosphat Những chất lẫn với dung môi trình sản xuất khâu bảo quản thùng chứa nút đậy nhựa Methanol chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2- etylhexyl)phtalat bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất làm sai lệch kết phân lập trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hoạt tính thử nghiệm sinh học làm bẩn dịch chiết Chloroform, metylen clorit methanol dung môi thường lựa chọn trình chiết sơ phần như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa, Những tạp chất chloroform CH2CI2, CtbClBr phản ứng với vài hợp chất ancaloit tạo muối bậc sản phẩm khác Tương tự vậy, có mặt lượng nhỏ axit clohiđric (HC1) gây phân huỷ, khử nước hay đồng phân hoá với hợp chất khác Chloroform gây tổn thương cho gan thận nên làm việc với chất cần thao tác khéo léo, cẩn thận nơi thoáng phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit độc dễ bay chloroform Methanol etanol 80% dung môi phân cực hiđrocacbon clo Người ta cho dung môi thuộc nhóm rượu thấm tốt lên màng tế bào nên trình chiết với dung môi thu lượng lớn thành phần tế bào Trái lại, khả phân cực chloroform thấp hơn, rửa giải chất nằm tế bào Các ancol hoà tan phần lớn chất chuyển hoá phân cực với họp chất phân cực trung bình thấp Vì chiết ancol chất bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn nước có đặc tính tốt cho trình chiết sơ Tuy nhiên có vài sản phẩm tạo thành dùng methanol suốt trình chiết Thí dụ trechlonolide A thu từ Trechonaetes aciniata chuyển thành trechonolide B trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain xảy erythroxylum novogranatense chiết methanol nóng Người ta thường sử dụng nước để thu dịch chiết thô từ mà thay vào dùng dung dịch nước methanol Đietyl ete dùng cho trình chiết thực vật dễ bay hơi, bốc cháy độc, đồng thời có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ, peroxit dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với họp chất khả tạo cholesterol carotenoit Tiếp đến axeton tạo thành axetonit 1,2-cis-diol có mặt môi trường axit Quá trình chiết điều kiện axit bazơ thường dùng với trình phân tách đặc trưng, có xử lý dịch chiết axit - bazơ tạo thành sản phẩm mong muốn Sự hiểu biết đặc tính chất chuyển hoá thứ cấp chiết quan trọng để từ lựa chọn dung môi thích hợp cho trình chiết tránh phân huỷ chất dung môi trình tạo thành chất mong muốn Sau chiết dung môi cất máy cất quay nhiệt độ không 30 - 40°c, với vài hoá chất chịu nhiệt thực nhiệt độ cao hon 1.3.2 Quá trình chiết Hầu hết trình chiết đơn giản phân loại sau: - Chiết ngâm - Chiết sử dụng loại thiết bị bình chiết Xoclet - Chiết lôi theo nước Chiết ngâm phương pháp sử dụng rộng rãi trình chiết thực vật không đòi hỏi nhiều công sức thời gian Thiết bị sử dụng bình thuỷ tinh với khoá đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích họp cho trình tách rửa dung môi Dung môi nóng lạnh nóng đạt hiệu chiết cao Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm kim loại dùng bình thuỷ tinh Thông thường trình chiết ngâm không sử dụng phương pháp chiết liên tục mẫu ngâm với dung môi máy chiết khoảng 24 chất chiết lấy Thông thường trình chiết mẫu thực qua lần dung môi cặn chiết không chứa chất giá trị Sự kết thúc trình chiết xác định vài cách khác Ví dụ: Hình 3.1 Sơ đồ tạo dịch chiết phân đoạn Do thời gian thực nghiệm có hạn, nội dung nghiên cứu khóa luận dừng lại phân lập phần dịch chiết EtOAc, phân đoạn khác đuợc tiến hành đơn vị nghiên cứu Từ phần cặn chiết EtOAc tiến hành sử dụng sắc ký cột thủy tinh với dung môi rửa giải CHCI3 : MeOH (chạy gradient với tỷ lệ dung môi từ 100% CHCI3 đến 100% MeOH), thu ba phân đoạn PE_Et_A (30,6 g); PE_Et_B (41,2 g) PE_Et_C (104,7 g) Do yêu cầu thời gian nghiên cứu, khóa luận chọn phân đoạn dễ nghiên cứu nhất, phân đoạn PE_Et_B, với lượng vết hiển thị TLC rõ Từ PE_Et_B, tiến hành sử dụng sắc ký cột thủy tinh với dung môi rửa giải Cloroíom : metanol: nước (Tỷ lệ 6:1:0,1) thu họp chất PU1 (120,1 mg) PUW1 (39,7 mg) Hình 3.2 Sơ đồ chiết phân lập họp chất từ me rừng 3.2 Hằng số vật lỷ kiện phổ hợp chất 3.2.1 Hợp chất (PU1) Các thông số vật lý họp chất PU1, số liệu sau: Tinh thể màu vàng Phổ ESI-MS m/z: 303,1 [M+H]+, 325,0 [M+Na]+ 300,9 [M-H]Công thức phân tử C15H10O7 (M = 302) 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) ô (ppm): 6,26 (d, J = 2,0 Hz, H-6); 6,52 (d, J = 2,0 Hz, H-8); 7,83 (d, J = 2,0 Hz, H-2’); 6,99 (d, J = 8,5 Hz, H-5’); 7,70 (dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6’) 3.2.2 Hợp chất (PUW1) Các thông số vật lý họp chất PUW1 sau: chất rắn màu vàng Phổ ESI- MS m/z: 291 [M+H]+, 289 [M-H]" Công thức phân tử CI5HI406, M = 290 Các số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân ^-NMR, 13C-NMR HSQC, HMBC trình bày bảng CHƯƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1 Xác định cấu trúc hóa học họp chất (PU1) Họp chất PU1 thu dạng tinh thể màu vàng họp chất ílavonoit Trên phổ 1H-NMR (Hình 4.1) xuất hai tín hiệu doublet đặc trưng cho hai proton vòng A ô 6,26 (d, J = 2,0 Hz, H-6) 6,52 (d, J = 2,0 Hz, H-8), ba tín hiệu điển hình cho vòng B 1,3,4 với tương tác spin hệ ABX ô 7,83 (d, J = 2,0 Hz, H-2’); 6,99 (d, J = 8,5 Hz, H-5’); 7,70 (dd, J = 2,0; 8,5 Hz, H-6’) Những kiện cho thấy quercetin với công thức phân tử C15H10O7 Kết phổ khối lượng ESI-MS xuất pic ion m/z 303,1 [M+H]+, 325,0 [M+Na]+ 300,9 [M-H]- hoàn toàn tương ứng phù họp với công thức phân tử C15H10O7 (M = 302) Kết so sánh kiện phổ PU1 với quercetin tài liệu [8] hoàn toàn Current PU1-AcetoneD€-1H data phù họp cho thấy họp chất quercetin 1.0 ZST30 65536 u.i 3.2769001 203.2 50.000 a 302.0 !1 o.01500000 J 0.00000000 i 500.1335009 ( sing parametei 500.1300098 p 0.30 I H 1.00 Hình 4.1a Phổ 1H-NMR PU1 6.0 ■ Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 4.1b Phổ 1H-NMR PU1 Display Report - Selected Window Selected Analysis Hình 4.2 Phổ khối lượng ESI-MS PU1 Instrument: Agilent Ion Trap Analysis Bảng 4.1 Kết phổ NMR6310 họp chất FU1 Print Date: Name: 1/14/2009 11:48:24 AM puLd Method: 4.2 c ÔHa’\J (Hz) ÔHC*,J (Hz)[8] 6,26 d (2,0) 6,18 d (2,0) 6,52 d (2,0) 6,40 d (2,0) 2’ 7,83 d (2,0) 7,67 d (2,2) 5’ 6’ 6,99 d (8,5) 7,70 dd (2,0; 8,5) 6,89 d (8,3) 7,53 dd (2,2; 8,6) a đo Acetone, MHz,c đo DMSO, Sô liệu phô ÒH 500 Õ quercetin [8] Hình 4.3 Cấu trúc hóa hoc FU1 * Xác định cấu trúc hóa học hợp chất (PUW1) Phổ !H-NMR (Hình 4.4) PUW1 xuất proton ÔH 7,65 (1H, dd, 8,0; tác J = 8,0 Hz 2,0 Hz MSD Trap2,0); 6,89 (lH,d, 8,0) Pa7,69 (1H, d, 2,0) với số tương -■ Ộ" dự đoán có mặt vòng thơm với nhóm gắn vào vị trí octo, para Các vị trí lại proton vị trí meta, para Dự kiến vòng thơm có dạng sau: X Từ số liệu phổ !H-NMR PUW1 quan sát thấy hai tín hiệu doulet ÔH 6,23 6,42 ppra với số tuơng tác nhỏ ụ = 2,0 Hz) chứng tỏ hai Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp proton có mặt vòng thơm vị trí meta Ngoài ra, phổ !H-NMR X PUW1 quan sát tín hiệu phân X tử đường với giá trị ÔH khoảng từ 3,29 đến 5,13 ppm, điểm dễ nhận dạng proton anome phân tử đường thứ ÔH 5,13 (1H, d, J = 7,5 Hz) phân tử đường thứ proton ÔH4,54 (1H, d, J = Hz) Trên phổ !H-NMR quan sát tín hiệu nhóm metyl ÔH 1,14 (3H, d, J = 6,5 Hz) PUWl- o ĩ2 Cur isiti ren on t Ac Param qu eter : 20110 Da te 211 16 36 pc-2 CHANNEL Multi flct - -an -1nucl zg30 H 65536 10.30 MeOD 16100 00 00Q jJL i i ầ i Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp PUWl—MeOD—C13CPD ỊỊỊS ẻ M s F - Hình 4.5 Phổ 13C-NMR hợp chất PUW1 Các tín hiệu hai tín hiệu cacbon có tín hiệu cao thể đối xứng Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp ôc 130,87 115,09 ppm Tín hiệu cacbon ôc 179,43 ppm cho thấy nhóm cacbonyl c=0, tín hiệu ôc 158,54; 135,63; 159,35; 166,10; 135,63 ppm, cho phép dự đoán cacbon có gắn nằm cạnh nhóm có chứa oxy Kết họp số liệu phổ 13C-NMR dự đoán phân mảnh hợp chất PUW1 sau: X Trường Đợi Học Sư Phạm Hà Nội Khóa ỉuận tốt nghiệp cacbon Quan sát phổ HSQC cho thấy tương tác cặp proton cacbon tương ứng sau: 5c 104,72 §H 5,13 (1H, d, J = 7,5 Hz); 102,42 ỖH4,54 (1H, d, /= 1,0 Hz); ỗc 99,98 ỗH 6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz); ỗc 94,89 ÔH 6,43 (1H, d, J = 2,0 Hz); ỗc 130,87 ỖH 8,04 (2H, d, / = 9,0 Hz); ỗe 115,09 SH 6,88 (2H, d, / = 9,0 Hz); cặp tương tác phân tử đường ỗc 74,20 ỗH 3,17*; 77,48 3,08* 69,88 3,08* ; 76,40 3,20*; 60,83 ỖH 3,32*; 3,56 dd (5,0; 12,0) Trường Đợi Học Sư Phạm Hà Nội Khóa ỉuận tốt nghiệp CDCI3) trình bày Bảng 4.2 Bảng 4.2 Số liệu phổ cộng hưởng từ nhân hợp chất PUW1 ÕH ’ rault Õcb'C HMBC ụ = Hz) ôca (H-»C) 158.52 158.54 135.62 135.63 179.44 179.43 - 162.98 162.99 - 99.95 b c d 3' 99.98 6.23 d (2.0) 5,7, 8,10 Hình 4.6 Phổ - HSQC hợp chất PUW1 166.10 166.01 SỐ liệu phổ ^-NMR (500 MHz, CDCI3) 13C-NMR (125MHz, 68.56 3.42e 94.87 94.89 6.42 d 68.57 (2.0) 6, 7, 9,10 3.82 dd (11.0, 1.0) ■y III 159.35 159.35 105.66 6- 105.64 Rha ■y III 102.42 4.54 d (1.0) 6" 123.15 123.15 102.4 3.65 dd (1.0, 3.5) 2, 3', 4', 6' 117.69 2"'117.70 72.12 7.69 d 72.11 (2.0) 72.26 3.55 dd (3.5, 9.5) 145.84 3"' 145.8572.26 - 4' 149.81 4"' 149.8173.94 - 73.95 3.31e 5' 116.06 5"' 116.0769.71 6.89 d 69.71 (8.0) 3.47e 6' 123.55 10 1' 2' 3-Glc 1', 3', 4' 6' 6"'123.56 17.87 7.65 dd17.87 4"', 5"' (8.0, 2.0) 1.14 (d, 6.5) 2, 2', 4' a5c rutin [9], bĐo CD3ÒD, c125 MHz, d500 MHz, ^ín hiệu bị che lấp 1" 104.69 104.72 5.13 (d, 7.5) 2" 75.74 75.73 3.50e 3" 78.20 78.21 3.45e 4" 71.42 71.42 3.29e 5" 77.25 77.24 3.35e Trên phổ ESI-MS họp chất PUW1 xuất pic ion giả phân tử m/z 611 [M+H]+, kết họp với số liệu NMR cho thấy họp chất PUW1 có công thức phân tử Khóa ỉuận tốt nghiệp C27H30O16, M =Trường 610 Đợi Học Sư Phạm Hà Nội Sử dụng số liệu phổ HMBC để liên kết đon vị cấu trúc dự kiến phổ NMR ESI-MS, kết bảng 4.2 hình 4.7 F> ƠTnTJL 00—HMB C Hình 4.7 Phổ HMBC PUW1 Kết họp với tài liệu công bố [9], họp chất PUW1 xác định Quercetin 3-rutinoside gọi Rutin, cấu trúc sau: Cấu trúc tương HMBC PUW1 Trường Đợi Học SưsốPhạm Hàtác Nội OHHình 4.8 OH Khóa ỉuận tốt nghiệp KÉT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký kết họp, họp chất flavonoit phân lập từ dịch chiết Etylaxetate củaHọc Phyllanthus Các họp chất đóKhóa là: ỉuận tốt nghiệp Trường Đợi Sư Phạm Hà Nộiemblỉca Quercetin (PU1) Quercetin 3-rutinoside (PUW1) Quercetin (PU1) OH Cấu trúc họp chất xác định nhờ vào phưong pháp phổ đại phổ cộng hưởng từ hạt nhân (!H-NMR, 13C-NMR, HSQC HMBC) phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI) TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích cộng (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, trang 260-261, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt nam, Nhà xuất Y học [3] Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), ửng dụng sổ phương pháp phổ nghiên cứu cẩu trúc phân tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội [4] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt nam, Nhà xuất trẻ [5] GS TS Lã Đình Mỡi (chủ biên)(2009), TS.Trần Minh Hợi, TS.Dương Đức Huyến, TS.Trần Huy Thái, TS.Ninh Khắc Bản, Tài nguyên thực vật Việt Nam Những chứa hợp chất có hoạt tính sinh học, tập II, trang 232236, Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ [6] Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển I, Nxb Y học Hà Nội [7] Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển II, Nxb Y học Hà Nội F mu 1|Ạ _ n-1 ■ Ạ A 1_ Tài liệu Tiêng Anh [8] Chen Chang Shen, Yuan Shiun Chang, Li Kang Ho, 1993, Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids, Phytochemistry, 34(3), 843845 [9] Tong s, Yan J, Chen G, Lou J., 2009 May-Jun, Purification of rutin and nicotiflorin from the flowers of Edgeworthia chrysantha Lindl, by high-speed counter-current chromatography J Chromatogr Sci.47(5), 341-4 " I I A Lp CO CM U£I r- cn Hình 4.4 Phổ 1H-NMR họp chất PƯVVl Phổ 13C-NMR (Hình 4.5) họp chất PUW1 quan sát 27 tín hiệu cacbon, có tín hiệu đặc trưng cacbon anome phân tử đường với ôc 104,72 102,42 ppm, cacbon khác phân tử đường ôc 75,73; 78,21; 71,42 ; 77,24 68,57 ppm; phân tử đường thứ hai ôc 72,11; 72,26; 73,95 69,71 ppm Các tín hiệu khác cho thấy tồn vòng thơm vị trí octo, vị trí para vòng thơm vị trí octo, vị trí para [...]... đồ tạo dịch chiết phân đoạn Do thời gian thực nghiệm có hạn, nội dung nghiên cứu của khóa luận chỉ dừng lại trong phân lập phần dịch chiết EtOAc, các phân đoạn khác đang đuợc tiến hành tại đơn vị nghiên cứu Từ phần cặn chiết EtOAc tiến hành sử dụng sắc ký cột thủy tinh với dung môi rửa giải là CHCI3 : MeOH (chạy gradient với tỷ lệ dung môi từ 100% CHCI3 đến 100% MeOH), thu được ba phân đoạn lần lượt... và phân lập các họp chất Mầu lá của cây me rừng, được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50°c, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột thu được 7 kg bột khô Phần lá khô của Phyllanthus emblỉca (7 kg) được đem nghiền nhỏ sau đó đem chiết với MeOH 3 lần Phần dịch chiết được quay khô với áp suất giảm để tạo thành cặn chiết MeOH (430 g) Cặn MeOH được hòa vào nước và phân. .. yêu cầu của thời gian nghiên cứu, do đó trong khóa luận này chỉ chọn phân đoạn dễ nghiên cứu nhất, phân đoạn PE_Et_B, với lượng vết hiển thị trên bản TLC rất rõ Từ PE_Et_B, tiến hành sử dụng sắc ký cột thủy tinh với dung môi rửa giải là Cloroíom : metanol: nước (Tỷ lệ 6:1:0,1) thu được họp chất PU1 (120,1 mg) và PUW1 (39,7 mg) Hình 3.2 Sơ đồ chiết và phân lập các họp chất từ lá me rừng 3.2 Hằng số vật... khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược) 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Với việc sử dụng kết họp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của họp chất, kể cả cấu trúc lập. .. nghiệp KÉT LUẬN 1 Bằng các phương pháp sắc ký kết họp, 2 họp chất flavonoit đã được phân lập từ dịch chiết Etylaxetate củaHọc lá cây Phyllanthus Các họp chất đóKhóa là: ỉuận tốt nghiệp Trường Đợi Sư Phạm Hà Nộiemblỉca 2 Quercetin (PU1) và Quercetin 3-rutinoside (PUW1) Quercetin (PU1) OH 2 Cấu trúc của các họp chất này được xác định nhờ vào các phưong pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân... Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, trang 260-261, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật [2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt nam, Nhà xuất bản Y học [3] Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), ửng dụng một sổ phương pháp phổ nghiên cứu cẩu trúc phân tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội [4] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt nam, Nhà xuất bản trẻ [5] GS TS Lã... tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau - Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa trong không gian phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc - Phổ NOESY {Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy):... 0,063 mm) Merck + Silicagel pha đảo ODS hoặc YMC (30 - 50 ịim, FuJisilisa Chemical Ltd.) + Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) + Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck) + Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck) + Các loại dung môi hữu cơ như methanol, etanol, ethyl acetate, chloroform, hexane, acetone, là loại hoá chất tinh khiết của Merck CHƯƠNG... khoảng từ 3,29 đến 5,13 ppm, điểm dễ nhận dạng là proton anome của phân tử đường thứ nhất tại ÔH 5,13 (1H, d, J = 7,5 Hz) và phân tử đường thứ 2 proton ÔH4,54 (1H, d, J = 1 Hz) Trên phổ !H-NMR còn quan sát được tín hiệu của nhóm metyl ÔH 1,14 (3H, d, J = 6,5 Hz) PUWl- 1 o ĩ2 Cur isiti ren on t Ac Param qu eter : 20110 Da te 211 16 36 pc-2 CHANNEL Multi flct - -an -1nucl zg30 H 65536 10.30 MeOD 16100... cứu 2.1 Mẩu thưc vât •• Mầu cây Me rừng thu thập tại Mê Linh - Vĩnh Phúc Người thu thập và định loài: TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định Tiêu bản mẫu (VNB_21) được lưu tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Hình ảnh mẫu và tiêu bản (Hình 1.1) 2.2 2.2.1 Phương pháp phân lập các họp chất sắc ký lớp