Nghiên cứu phân lập thành phần Flavonoit từ lá cây Me rừng (phyllanthus Emblica)

Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Cùng với phát triển khoa học công nghệ ô nhiễm môi trường nảy sinh vấn đề khác, ví dụ bệnh nguy hiểm (ung thư, kháng sinh, cúm H1N1, H7N9,…) Nguyên nhân bệnh đến từ nhiều nguồn khác nhau, nhiễm mơi trường, kháng sinh Trước tình trạng đó, nhiều quốc gia giới tiến hành chương trình nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất từ thiên nhiên, với hy vọng dược phẩm có nguồn gốc thực - động vật giúp giảm thiểu bệnh nguy hiểm nêu trên, tăng cường công tác chăm sóc sức khỏe kéo dài tuổi thọ người Những nghiên cứu tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học cao để ứng dụng y học, nơng nghiệp mục đích khác đời sống người trở thành nhiệm vụ quan trọng quốc gia giới Là quốc gia nằm khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa tương đối lớn, độ ẩm cao (khoảng 80%), nhiệt độ trung bình khoảng từ 15 270C, Việt Nam có điều kiện thuận lợi cho sinh vật phát triển tạo phong phú nhiều loài động thực vật nhiều hệ sinh thái khác Điều có ý nghĩa quan trọng tới phát triển y học cổ truyền Việt Nam Trong số loài thực vật Việt Nam, loài thực vật thuộc họ Thầu dầu thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học Ví dụ như: Me rừng (Phyllanthus emblica), thuộc họ Thầu dầu, loài sử dụng làm thuốc chữa bệnh từ lâu y học dân gian chữa huyết áp cao, viêm ruột, viêm da, đau họng, đau răng, rắn cắn, Tuy nhiên, để có sở khoa học nhằm phát triển ứng dụng cụ thể lồi này, cần có nghiên cứu cụ thể hóa học, hoạt tính sinh học Chu Kim Ngân K35C – Khoa Hóa Học Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội Chu Kim Ngân Khóa luận tốt nghiệp K35C – Khoa Hóa Học nghiên cứu sâu dược lý để giải thích tác dụng y học cổ truyền lồi này, qua tạo sở để tìm kiếm phương thuốc điều trị bệnh Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là: “Nghiên cứu phân lập thành phần flavonoit từ Me rừng” Khóa luận tập trung nghiên cứu thành phần flavonoit từ Me rừng bao gồm nội dung là: Thu mẫu Me rừng (Phyllanthus emblica), xử lý mẫu tạo dịch chiết Phân lập hợp chất flavonoit Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung Me rừng 1.1.1 Thực vật học me rừng Cây Me rừng (Hình 1.1) hay gọi chùm ruột núi, chùm ruột rừng, bơng ngót, cam tú, ngưu cam tú, du cam tú, mắc kham Cây có tên khoa học Phyllanthus emblica Đây gỗ nhỏ bụi, cao 3-8(-10) m, vỏ mỏng, màu nâu nhạt, nâu màu xám, nhẵn Thân thường cong queo, phân cành nhiều, cành nhỏ mềm, cành già màu xám nhạt, mang nhánh nhỏ, có lơng Cành mang mảnh, màu xanh nhạt Cành mang xếp gần mặt phẳng Phiến hình bầu dục khn, hai đầu tù, kích thước (3-)12-20 x (1-)3,5 - mm, nhẵn; gần không cuống ngắn Lá kèm nhỏ, hình tam giác, màu đỏ nâu Hoa đơn tính gốc Hình 1.1 Mẫu lá, tiêu me rừng Hoa nhỏ mọc thành xim co nách phía cành, gồm nhiều hoa đực 1-2 hoa Hoa đực có cuống ngắn; đài gồm mảnh màu hồng xanh nhạt, hình bầu dục Hoa gần khơng cuống; đài có thuỳ tương tự hoa đực Quả hình cầu, kích thước 13-25 x 20-30 mm, mọng nước, màu vàng xanh; khô thành nang, tự mở Hạt dạng cạnh, màu hồng nhạt hay nâu nhạt [1, 2, 4, 5] 1.1.2 Phân bố sinh thái Cây mọc phổ biến khắp nơi Việt Nam, tỉnh miền núi trung du phía bắc [1, 2, 4, 5] Me rừng lồi có vùng phân bố rộng nhiều nước châu Á, từ Ấn Độ đến Myanmar, Nepal, Thái Lan, Malaysia, Lào, Campuchia, miền nam Trung Quốc Hiện me rừng đưa vào trồng Nhật Bản, Hoa Kỳ Australia 1.1.3 Công dụng Nhiều phận loài Me rừng (P emblica L.) có hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, chống suy giảm miễn dịch, kháng độc bảo vệ tế bào gan kim loại màu gây [1, 2, 4, 5],… Trong y học dân gian, dùng chữa phù thũng, viêm da, mẩn ngứa Hạt dùng chữa hen, viêm cuống phổi thiểu mật Rễ dùng để chữa huyết áp cao, đau thượng vị, viêm ruột lao hạch bạch huyết [5], Quả thường dùng ăn tươi, làm ô mai, nước hoa quả, giải khát, hầm thịt, làm thuốc nhuộm răng, nước gội đầu để kích thích mọc tóc Quả dùng làm thuốc chữa bệnh thiếu vitaminC (bệnh Scorbut), viêm đau gan, vàng da, rối loạn tiết mật, viêm đau dày, kiết lỵ, tiêu chảy, nhuận tràng, kích thích tiêu hóa, lợi tiểu, đái đường, giải nhiệt, xuất huyết, cầm máu, thiếu máu, giảm huyết áp, đau nhức đầu, đau nhức mắt, giảm sốt, choáng váng, ho, viêm phế quản, viêm sưng phổi,… Hạt dùng chữa hen suyễn, viêm phế quản, thiểu mật,… Hoa dùng làm thuốc nhuận tràng, giải nhiệt làm thuốc xổ Lá me dùng làm thuốc giải nhiệt, chữa phù thũng số bệnh da Vỏ thân dùng làm thuốc chữa tiêu chảy, lỵ amip, cầm máu Rễ dùng để chữa trị bệnh cao huyết áp, đau thượng vị, viêm ruột, lao hạch bạch huyết,… Cộng đồng dân tộc miền núi Việt Nam nước Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ,… thường sử dụng phận Me, đặc biệt để ăn làm thuốc rộng rãi [1, 2, 4, 5] 1.1.4 Thành phần hóa học Quả me rừng có vị chua, nguồn nguyên liệu giàu vitamin C Trong chứa trigalloyglucose, ellagic acid, corilagin, terchebin, phylleblin, phyllemblic acid emblicol Các nghiên cứu gần cho biết vitamin C acid gallic có đặc tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn Hoạt tính ức chế q trình oxy hóa tác dụng tannin, emblicanin A, emblicanin B, punigluconin pedunculagin me rừng [5] Phyllemblin coi hoạt chất có tác dụng tương tự adrenalin, gây giảm đau, an thần, đặc biệt với hệ thần kinh trung ương [5],… Những acid hữu me rừng như: acid aspartic, ellagic, gallic, myristic, ascorbic, alanine, glycine, histidine, methionine, niacin, tyrosine với số hợp chất tannin coi có tác dụng phòng chống số dạng ung thư kìm hãm phát triển virut HIV [5],… Lá nguồn nguyên liệu giàu flavonoid, tannin sterol Từ tách chiết hoạt chất ellagic acid, amlaic acid, kaempferol-3glucoside, kaempferol, lupeol, α-amyrin acetat, phytosterol C29 βsitosterol, poriferasterol, β-sitosterol-3-O-D-glucopyranosid [5], Vỏ chứa β-sitoserol,(+)-leucodelphinidin (3,75%), lupeol (2,25%) tannin Thành phần chủ yếu tannin gồm phyllembin, gallotannin 1,2,3-trigalloyglucose, ellagitannin terchebin, corilagin, chebulagic acid, chebulinic acid Hạt chứa khoảng 16% dầu béo, chủ yếu linoleic acid (44%), oleic acid (28,4%), linolenic acid, stearic acid, palmatic myristic acid [5] Hình 4.6 Phô HSQC hợp chất PUW1 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) trình bày Bảng 4.2 Bảng 4.2 Số liệu phơ cộng hưởng từ nhân hợp chất PUW1 δHb, d mult HMBC C a b, c (H (J = Hz) δC δC → 158.52 158.54 135.62 135.63 - 179.44 179.43 - 162.98 162.99 - 99.95 99.98 6.23 d (2.0) 166.01 166.10 - 94.87 94.89 6.42 d (2.0) 159.35 159.35 - 10 105.66 105.64 - 1' 123.15 123.15 - 2' 117.69 117.70 7.69 d (2.0) 3' 145.84 145.85 - 4' 149.81 149.81 - 5' 116.06 116.07 6.89 d (8.0) 6' 123.55 123.56 7.65 dd (8.0, 2.0) 1'' 104.69 104.72 5.13 (d, 7.5) 2'' 75.74 75.73 3.50e 3'' 78.20 78.21 3.45e 4'' 71.42 71.42 3.29e 5'' 77.25 77.24 3.35e 5, 7, 8, 10 6, 7, 9, 10 2, 3', 4', 6' 1', 3', 4' 6' 2, 2', 4' 3-Glc 6'' 68.56 68.57 3.42e 3.82 dd (11.0, 1.0) 1''' 6'' 6-Rha 1''' 102.42 102.42 4.54 d (1.0) 2''' 72.12 72.11 3.65 dd (1.0, 3.5) 3''' 72.26 72.26 3.55 dd (3.5, 9.5) 4''' 73.94 73.95 3.31e 5''' 69.71 69.71 3.47e 6''' 17.87 17.87 1.14 (d, 6.5) 4''', 5''' a δC rutin [9], b Đo CD3OD, c125 MHz, d500 MHz, etín hiệu bị che lấp Trên phổ ESI-MS hợp chất PUW1 xuất pic ion giả phân tử m/z 611 [M+H]+, kết hợp với số liệu NMR cho thấy hợp chất PUW1 có cơng thức phân tử C27H30O16, M = 610 Sử dụng số liệu phổ HMBC để liên kết đơn vị cấu trúc dự kiến phổ NMR ESI-MS, kết bảng 4.2 hình 4.7 Hình 4.7 Phơ HMBC PUW1 Kết hợp với tài liệu công bố [9], hợp chất PUW1 xác định Quercetin 3-rutinoside gọi Rutin, cấu trúc sau: OH 3' 2' HO OH 4' 5' O 1' 6' OH 10 OH O HO O OH O O O Me HO HO OH Hình 4.8 Cấu trúc số tương tác HMBC PUW1 KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký kết hợp, hợp chất flavonoit phân lập từ dịch chiết Etylaxetate Phyllanthus emblica Các hợp chất là: Quercetin (PU1) Quercetin 3-rutinoside (PUW1) OH HO O 6' 4' 1' 3' OH 10 OH OH O Quercetin (PU1) OH 3' 2' HO O 4' 5' 1' 6' OH 10 OH OH O HO O OH O O O Me HO HO Quercetin 3-rutinoside (PUW1) OH Cấu trúc hợp chất xác định nhờ vào phương pháp phổ đại phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, HSQC HMBC) phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI) 13 C-NMR, TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích cộng (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, trang 260-261, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật [2] Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt nam, Nhà xuất Y học [3] Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội [4] Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt nam, Nhà xuất trẻ [5] GS TS Lã Đình Mỡi (chủ biên)(2009), TS.Trần Minh Hợi, TS.Dương Đức Huyến, TS.Trần Huy Thái, TS.Ninh Khắc Bản, Tài nguyên thực vật Việt Nam Những chứa hợp chất có hoạt tính sinh học, tập II, trang 232-236, Nhà xuất Khoa học tự nhiên cơng nghệ [6] Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển I, Nxb Y học Hà Nội [7] Trần Đình Sơn, Vũ Thị Kim Ngọc, Nguyễn Thị Hồng Điệp, Phan Thanh Hải (2008), Phổ cộng hưởng từ hạt nhân, Quyển II, Nxb Y học Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh [8] Chen Chang Shen, Yuan Shiun Chang, Li Kang Ho, 1993, Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids, Phytochemistry, 34(3), 843-845 [9] Tong S, Yan J, Chen G, Lou J., 2009 May-Jun, Purification of rutin and nicotiflorin from the flowers of Edgeworthia chrysantha Lindl, by high-speed counter-current chromatography J Chromatogr Sci.47(5), 341-4 [10] Hayerman A.E., Butler I.G., 1994, Assay of condensed tanin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant, Meth, Enz, 234, pp 249 [11] Ternai B., Markham K.R., 1976, C13-NMR of flavonoids-1-Flavones and flavonols, Tetrehedron 32, pp 565 [12] Mabry F.J., Markman R.B., Thomas M.B., 1976, The syrematic indentification of flavonoids, springer Verlag-Berlin-Heidelberg-New york [13] Harborn J.B., 1994, The flavonoids advance in research since 1986, Chaprman & Hall [14] Agrawal P.K., 1989, Carbon-13 NMR of flavonoids, Elsevier Science Pub B.V ... nghiệp là: Nghiên cứu phân lập thành phần flavonoit từ Me rừng Khóa luận tập trung nghiên cứu thành phần flavonoit từ Me rừng bao gồm nội dung là: Thu mẫu Me rừng (Phyllanthus emblica), xử... mẫu tạo dịch chiết Phân lập hợp chất flavonoit Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung Me rừng 1.1.1 Thực vật học me rừng Cây Me rừng (Hình 1.1) hay... 1.2 Cấu trúc số hợp chất từ me rừng OH 1.2 Giới thiệu lớp chất flavonoit [10-14] Flavonoit nhóm hợp chất phân bố rộng rãi tự nhiên Cho đến có 4000 Flavonoit tìm thấy từ thực vật Ban đầu chúng