Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro.. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với

ĐẠI HỌC THÁI NGUYấN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NễNG LÂM

TRIỆU MINH HUỆ

Tờn đề tài:

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo

mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro

KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC

Hệ đào tạo : Chớnh quy Chuyờn ngành : Cụng nghệ sinh học

Khoa : CNSH - CNTP Khoỏ học : 2010 - 2014 Giảng viờn hướng dẫn: ThS Lõm Mai Tựng

Trung tõm ứng dụng tiến bộ Khoa học và Cụng nghệ tỉnh Lạng Sơn

ThS Lương Thị Thu Hường

Khoa CNSH-CNTP, trường Đại học Nụng Lõm Thỏi Nguyờn

Thỏi Nguyờn, năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm Khoa Công

nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo

mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro”

Qua 6 tháng thực tập tại phòng Kỹ thuật của Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn em đã hoàn thành đề tài Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc trung tâm cùng các thành viên phòng Kỹ thuật đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ths Lâm Mai Tùng, Ths Lương

Thị Thu Hường và KS Vi Thị Minh Tâm đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong

thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vất chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày 27 tháng 05 năm 2014

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần hóa học trong tinh dầu gừng 6Bảng 4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2

0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 26

Bảng 4.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của việc kết hợp khử trùng bằng HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy cây gừng Núi đá trong

điều kiện in vitro 28

Bảng 4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 -D đến khả năng tạo

mô sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro 30

Bảng 4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả

năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 31

Bảng 4.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA

đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 33

Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả

năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1 Một số hình ảnh mô tả đặc điểm hình thái cây gừng Núi đá 5Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến

hiệu quả khử trùng mẫu cấy cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 27

Hình 4.1.2 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc kết hợp khử trùng bằng HgCl20,1% với Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều

kiện in vitro 29

Hình 4.2.1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D đến khả năng hình

thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 30

Hình 4.2.3 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến

khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 34

Hình 4.3 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả

năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 36

LSD : Least Significant Difference Test

MS : Murashige and Skoog’s

NAA : α- Naphlene axetic acid

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

MỤC LỤC

Trang

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về gừng núi đá 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm phân bố 3

2.1.3 Đặc tính sinh học 4

2.1.4 Thành phần hóa học 6

2.1.5 Tác dụng 8

2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào 8

2.2.1 Tính toàn năng di truyền của tế bào 8

2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 9

2.2.3 Nuôi cấy mô sẹo 10

2.2.4 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

2.3 Tình hình nghiên cứu cây gừng trong nước và thế giới 17

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 18

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 19

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 19

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 19

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 19

3.3 Điều kiện nuôi cấy 19

3.4 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 19

3.5 Nội dung nghiên cứu 19

3.6 Phương pháp nghiên cứu 20

3.6.1.Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu 20

3.6.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 20

3.6.3 Nuôi cấy mô sẹo 20

3.6.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 20

3.7 Chỉ tiêu theo dõi 24

3.8 Xử lý số liệu 25

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng thích hợp tạo vật liệu sạch phục vụ nuôi cấy cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 26

4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0.1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 26

4.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của việc kết hợp khử trùng bằng HgCl2 0.1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy cây gừng Núi đá 28

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 29

4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro 29

4.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 31

4.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro 33

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 35

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Gừng (Zingiber officinable Roscoe.) là một loại cây thân thảo, lấy củ, sống

lâu năm được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và thảo dược [32] Chúng được trồng phổ biến ở hầu hết các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Bangladet, Jaiwan, Jamaica, Nigieria, Indonesia, Ceylon, Sierraleone, Australia, Trung Quốc

và Nhật Bản [21], gồm hơn 1200 loài cây thuộc 53 chi Chi Zingiber gồm 85 loài

thảo mộc thơm từ Đông Á và vùng nhiệt đới Australia [19]

Bộ phận chính được sử dụng là củ gừng (thân rễ, rhizome) [17] Gừng có vị

cay, thơm rất giàu các hợp chất thứ cấp như nhựa dầu, dẫn xuất phenol, zingiberene,

gingerol [33] Trong các phương pháp chữa bệnh truyền thống thường được sử

dụng để điều trị bệnh đau đầu, buồn nôn, cảm lạnh, viêm khớp, thấp khớp, nhức mỏi cơ bắp, và viêm [20] Ở Ấn Độ và Trung Quốc thời cổ xưa đã sử dụng gừng

điều trị bệnh trên người và gia súc [47] Trong công nghiệp thực phẩm, gừng được

sử dụng để tạo hương vị trong sản xuất một số sản phẩm như bánh kẹo, trà, mứt, nước giải khát,…[17]

Gừng thường được nhân giống bằng củ, nhưng hệ số nhân rất thấp Năng suất

gừng không cao do nhiễm vi khuẩn gây héo (Pseudomonas solanacearum), thối rễ (Pythium aphanidermatum) và tuyến trùng (Meloidgyne spp.) Những bệnh này sẽ truyền

qua củ giống vào năm sau, do vậy sản xuất những dòng sạch bệnh với tỷ lệ nhân giống cao là cần thiết để có được vụ mùa với năng suất cao [50]

Đã có khá nhiều nghiên cứu về cây gừng trên thế giới như vi nhân giống [31],

nuôi cấy cơ quan [34], phát sinh phôi soma [41], phát sinh cơ quan [38], nuôi cấy tế bào trần, bảo tồn phôi và một số nghiên cứu khác Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về cây gừng Núi đá – một loại cây bản địa, quý và hiếm

Theo quyết định 80/2005/QĐ - BNN về danh mục các nguồn gen quý hiếm cần được bảo tồn do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 05/12/2005, gừng Núi đá là một trong những loài cây quý hiếm cần bảo tồn

Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng

của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro”

1.2 Mục đích của đề tài

- Nghiên cứu phương pháp khử trùng thích hợp để tạo vật liệu sạch phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây

gừng Núi đá trong điều kiện in vitro

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định ảnh hưởng của phương pháp khử trùng (thời gian khử trùng, phương pháp khử trùng) đến khả năng tạo vật liệu sạch phục vụ cho tạo mô sẹo cây gừng Núi đá

- Xác định ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng tạo mô

sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro

- Xác định ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô

sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Sự thành công của đề tài cùng với những nghiên cứu của các tác giả khác sẽ

tạo ra được quy trình nhân giống phù hợp cho cây gừng Núi đá trong điều kiện in

vitro và phục vụ các nghiên cứu chiết xuất các hợp chất hóa học quan trọng của

gừng nói chung và gừng Núi đá nói riêng

- Là cơ sở cho các nghiên cứu khoa học khác

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Cung cấp số lượng cây gừng Núi đá trong tự nhiên góp phần bảo tồn nguồn

gen quý hiếm và khai thác triệt để những giá trị kinh tế và dược liệu của chúng

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về gừng núi đá

Tên Việt Nam : Gừng Núi đá

Tên khoa học : Zingiber sp

Tên khác : Gừng đá, gừng Núi đá Tiếng Tày gọi là khing phia

2.1.2 Đặc điểm phân bố

Gừng là một trong những loài cây trồng phổ biến khắp thế giới, có nguồn gốc từ trung tâm Châu Á, được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Chúng đã trở thành cây trồng kinh tế cho nông dân ở Châu Mỹ La - tinh, Châu Phi và Đông Nam Á Gần 50% sản lượng gừng thu hoạch xuất xứ từ Ấn Độ, một phần từ Châu Phi, Brazil, Jamica Trong vùng Đông Nam Á, Trung Quốc là nước có diện tích trồng gừng cao nhất (50.000

đến 80.000 ha), kế đến là Thái Lan, Hàn Quốc và Việt Nam [47]

Ở Việt Nam, gừng được trồng từ rất lâu đời, ở khắp mọi nơi trên khắp các địa

phương từ Bắc vào Nam [9] Tuy nhiên, gừng chỉ được trồng rải rác ở trong các vườn hộ gia đình [2]

Gừng Núi đá phân bố ở một số tỉnh như Lạng Sơn, Nà Rì, Bắc Cạn, Cao Bằng, Hà Giang, Tây Bắc và miền Trung Tây Nguyên, Khánh Hòa, Gia Lai, Đắc Lắc, cây mọc tự nhiên trên các vùng núi đá, mọc xen trong đá, ở các bờ suối nơi ẩm mát - dưới tán rừng già , cây thường phát triển theo cụm (5,6 thân) Tên gừng Núi

đá bắt nguồn từ nơi chúng có khả năng sống và phát triển tốt nhất Loại gừng này

thường mọc ở những dãy núi đá cao khoảng trên 1m, củ bằng đốt ngón tay, có mùi

vị thơm rất lạ lùng giống mùi bọ xít

2.1.3 Đặc tính sinh học

Gừng là cây thân thảo, đa niên, cao từ 50 - 100 cm tùy theo đất, có nơi cao hơn 150 cm Chúng phát triển thân ngầm dưới đất, có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm ngủ, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ đâm chồi thành cây Bẹ lá ôm sát nhau phát triển thành thân giả trên mặt đất Lá đơn mọc cách (so le), lá trơn, không có cuống, hình lưỡi mác, mặt bóng nhẵn, mép lá phẳng, gân giữa hơi trắng nhạt Trục hoa mọc từ gốc (củ gừng), dài khoảng 20cm, hoa tự tạo thành bông, mọc sát nhau, hoa dài khoảng 5 cm, rộng khoảng 2 - 3cm, lá bắc hình trứng, mép lá màu vàng Ðài hoa dài khoảng 1cm, có 3 rãnh ngắn, có 3 cánh hoa, màu vàng hơi nhạt, mép cánh hoa màu tím, nhị hoa cũng màu tím [18]

Tuy nhiên, ở nước ta gừng trồng ít khi ra hoa hoặc chưa ra hoa đã thu hoạch

củ để bán [12]

Gừng là một loại cây ưa ấm Sinh trưởng thích hợp ở những vùng nhiệt đới

và cận nhiệt đới,… Nhiệt độ thích hợp là 25 - 300C, khả năng sinh trưởng giảm nếu nhiệt độ thấp hơn 240C và cao hơn 300C Gừng phát triển tốt trong điều kiện đầy đủ ánh sáng, nhưng cũng có thể thích nghi với kỹ thuật trồng xen [21]

Môi trường tốt nhất cho chúng sinh trưởng là pH = 5,5 – 6,5 Gừng thường

được trồng vào khoảng tháng 3 hằng năm, có thể thu hoạch từ tháng 12 đến tháng 5

năm sau Tuy nhiên chất lượng gừng giảm nếu như thu hoạch quá muộn vào khoảng tháng 5 Sẽ làm giảm thẩm mĩ của gừng so với gừng thu sớm Sau khi trồng phải mất khoảng 6 tuần thì chúng mới bắt đầu nảy mầm Từ đó chúng bắt đầu sinh trưởng tối đa cho đến khi ra hoa Sự hình thành hoa đánh dấu sự trưởng thành của

củ và bắt đầu tăng hàm lượng chất xơ trong củ [21]

Về đặc điểm sinh học của gừng Núi đá hiện này vẫn chưa có những nghiên cứu chính thức về chúng Dưới đây là một số hình ảnh mô tả :

2.1.4 Thành phần hóa học

Trong gừng có chứa hơn 400 chất khác nhau gồm 2 - 3% tinh dầu

(Zingerberen, D -camphen), 3 - 5% chất nhựa cay như zingerol, Shogaol, chất béo,

vitamin, khoáng (K, Ca, Fe, Zn,…)

Những hợp chất hóa học quan trọng quyết định khả năng chữa bệnh của gừng được chia làm hai nhóm là nhóm dễ bay hơi và không bay hơi Nhóm hợp chất dễ bay hơi gồm oleoresin (nhựa dầu) Đây là yếu tố quyết định cho gừng có khả năng làm gia vị, trong đó chủ yếu là gingerol [46]

Những hợp chất hóa học có trong tinh dầu gừng được thể hiện trong bảng 1

Bảng 1 Thành phần hóa học trong tinh dầu gừng

2.1.5 Tác dụng

Gừng (Zingiber officinale Roscoe.) đã được sử dụng làm dược phẩm từ thời

cổ xưa Trong y học thực nghiệm ở Đông Nam Á, gừng khô được sử dụng trong

điều trị chứng khó tiêu, tiêu chảy và buồn nôn Cả chống oxy hóa và hoạt động

androgenic của Z Officinale đã được báo cáo trên các mô hình động vật Những

hoạt động này được phản ánh bởi sự tăng lượng tinh hoàn và mức độ cholesterol

trong huyết thanh, các thành phần chính của Z Officinale như gingeron, gingidiol,

Zingiberene và đặc biệt là gingerol và shogarol có hoạt tính chống oxy hóa Z Officinale được biết đến là có tác động đến tim mạch như hạ huyết áp, nhịp tim và

hàm lượng đường máu Có hai hợp chất được tìm thấy là chịu trách nhiệm về hoạt tính giảm đau, chống nôn, hạ sốt và ức chế tổng hợp prostaglandin Trong điều trị ung thư, gừng có thể sản xuất những hợp chất kháng u hiệu quả bằng cách gây appotosis Chúng còn được biết đến với gingerol có hoạt tính chống khuẩn mạnh cả

in vivo và in vitro Ngoài ra còn có tác dụng chống viêm và chống lại sự chết theo

chu trình [46]

Theo tài liệu cổ: Sinh khương vị cay, tính hơi ôn, vào ba kinh phế, tỳ và vị

Có tác dụng phát biểu tính hàn, ôn trung, làm hết nôn, tiêu đờm, hành thủy giải độc Dùng chữa ngoại cảm, biểu chứng, bụng đầy trướng, giải độc bán hạ, chống nôn mửa, nam tinh, cua cá, đờm ẩm sinh ho Can khương vị cay, tinh ôn, bào khương (can khương bào chế rồi) vị cay đắng tính đại nhiệt Vào sáu kinh tâm, phế, tỳ, vị, thận và đại tràng Có tác dụng ôn trung tán hàn, hồi dương thông mạch, dùng chữa thổ tả, bụn đau, chân tay lạnh, mạch nhỏ, hàn ẩm xuyễn ho, phong hàn thấp tỳ [7]

2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào

2.2.1 Tính toàn năng di truyền của tế bào

Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng di truyền của tế bào thực vật Hanberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh [3]

Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa

đều có mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen (genome)

của thực vật đó Do đó, khi gặp điều kiện thuận lợi cơ quan, mô, tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể mới mang hoàn chỉnh những đặc tính di truyền giống như cây mẹ [3]

2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào

Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên ở tất

cả các loại tế bào đều có nguồn gốc từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai

đoạn đầu, tế bào tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh mang chức năng

chuyên biệt (chưa chuyên hóa) Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục

được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng

khác nhau [5]

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào

Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được

mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa [3]

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối

mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [5]

2.2.3 Nuôi cấy mô sẹo

2.2.3.1 Sự hình thành mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, không có hình dạng nhất định,

do không có lớp nhu mô Mô sẹo được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô và thành phần tế bào rây Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt Điều quan trọng được nhận thấy ở

đặc tính của mô sẹo là mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt

hóa thành rễ, chồi hoặc phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh

Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo,

thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy Sự hình thành mô sẹo được chia ra làm 3 giai đoạn: phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa

- Trong pha phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy

-Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối

- Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện con

đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học [8]

Mô sẹo thường có màu vàng trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin Sự biệt hóa tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mô các loại, tế bào rây,… hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm của sự tạo nên chồi hay rễ

Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo được tạo ra từ những cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang tự dưỡng Theo Hilderbrandt và cs (1963) [30] cho rằng,

mô sẹo có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi trường và cường độ ánh sáng Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng quang tự dưỡng của những tế bào có chứa diệp lục (tế bào màu xanh) như: cường độ ánh sáng mạnh, ánh sáng màu xanh cần thiết cho sự biệt hóa diệp lục và sự hình thành các enzyme, đường thấp, auxin thấp, CO2 cao và tăng hàm lượng photphate, và những tế bào quang tự dưỡng này có khả năng cố định CO2 bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 cacbon Một vấn đề cần quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào Sự biến tính này sảy ra do: độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể có số lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo,

điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhất là hoormon [8]

Để tạo mô sẹo trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng, đôi

khi có dịch chiết [8] Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất kích thích sinh trưởng bổ sung vào có khác nhau [8] Chất hoormon thường tổ hợp thành 4 nhóm:

- Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng

- Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc

Dạng mô sẹo cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cơ quan của khối mô Khả năng tái sinh chồi sớm mất đi ở mô sẹo xốp những vẫn duy trì ở mô sẹo cứng Nguyên nhân có thể do các tế bào mô sẹo sẽ mất đi khả năng sinh ra một số chất thiết yếu cho sự tái sinh của nó khi số lần cấy chuyển tăng lên Vì vậy, khi nuôi cấy

mô sẹo nhằm mục đích tái sinh chồi, phải cố gắng tìm điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự hình thành các khối mô sẹo cứng, chắc; các mô sẹo xốp cần được loại bỏ trong các lần cấy chuyển vì đôi khi dạng mô sẹo này phát triển rất nhanh và lấn át các mô sẹo cứng có khả năng sinh phôi Mô sẹo cấy chuyển càng nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm Ngoài ra, nếu thời gian dài không cấy chuyển thì mô sẹo sẽ hóa nâu và chết

2.2.3.2 Sự phát triển của tế bào mô sẹo

Giống thực vật cổ điển được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh cơ quan là cây thuốc lá [40] Bước đầu tiên trong nghiên cứu tái sinh là tạo mô sẹo Mô nuôi cấy cho thấy tiêu biểu của sự phân chia tế bào, những chức năng đặc biệt của tế bào và sự hình thành cơ quan như cấu trúc của hệ thống mạch dẫn Sự hình thành mô sẹo từ mô nuôi cấy cho thấy sự phân chia tế bào, những tế bào ít có tính chuyên biệt và mất khả năng hình thành cấu trúc cơ quan [8]

Khi cấy chuyển mô sẹo trên môi trường có agar, tế bào mô sẹo phát triển theo hình chữ S Có 5 pha trong sự phát triển của mô sẹo:

- Pha lag: Tế bào chuẩn bị phân chia

- Pha Exponetial: Tốc độ phân chia tế bào cao nhất

- Pha Linear: tế bào phân chia chậm lại và phát triển kích thước

- Pha Deceleration: tốc độ phân chia tế bào và phát triển kích thước giảm

- Pha Stationary: Số lượng và kích thước tế bào ổn định

Sự phát triển của mô sẹo có thể đo được trọng lượng tươi Đo trọng lượng khô cho thấy chính xác hơn trọng lượng tươi nhưng đòi hỏi mẫu phải đồng nhất Đo đếm

sự phân bào nguyên nhiễm

2.2.4 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy

2.2.4.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo điều

kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm Điều kiện vô

trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro

Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, đèn tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn

Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết

định Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng

thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao Thông thường hay

sử dụng một số hoá chất như: HgCl2 0,1%, nước Clofox, cồn 700, Ca(ClO)2…để khử trùng [5]

- Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

+ Ánh sáng

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: Thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày

Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo Ngược lại, cường

độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi Nhìn chung cường độ ánh sáng thích

hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh

hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng

chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 - 40 cm [3]

+ Nhiệt độ

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới

sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây Tuỳ thuộc vào nguồn gốc của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±20C [3]

2.2.4.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một loại vật liệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ biến như MS, B5, WPM

Tuy có nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau [3]:

+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

+ Nguồn cacbon

+ Các vitamin và amino acid

+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

+ Các chất điều hoà sinh trưởng

- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Đối với cây trồng, các chất khoáng đa lượng và vi lượng đóng vai trò rất

quan trọng Ví dụ Mg là một phần của phân tử diệp lục, Ca cấu tạo màng tế bào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino acid và protein Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một số enzym cần thiết cho hoạt động sống của tế bào

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzym

Các ion của các muối hoà tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môi trường trong tế bào, duy trì điện thế hoá của thực vật Các yếu tố như: K, Ca rất quan trọng trong điều hoà tính thấm lọc của tế bào [13]

- Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năng quang hợp,

do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động dinh dưỡng của tế bào

Nguồn cacbon được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế cho saccarose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thực vật

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường, cần chú ý không nên kéo dài thời gian

để tránh xảy ra hiện tượng caramen hoá, làm cho môi trường chuyển sang màu vàng

dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào [13]

- Các vitamin và axit amin

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở

các loài khác nhau là khác nhau

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất phải

bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino acid Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật Axit nicotinic (B3) và pyridoxin (B6) cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [3]

đã thông qua các tài liệu liên quan đến sự thay đổi pH in vitro và tác giả cho rằng, sự

thay đổi này là do hấp thụ amoniac và nitrate từ môi trường nuôi cấy Dougall đã chứng minh pH ban đầu của môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng đến pH của môi trường sau khi nuôi cấy do ảnh hưởng đến tốc độ hấp thụ amoni và nitrate Khi tế bào hấp thụ amoni, một ion H+ được giải phóng làm cho pH môi trường giảm Sự thay đổi

pH môi trường rắn và môi trường lỏng cũng khác nhau Môi trường rắn và môi trường lỏng có pH ở 5,7 thì sau khi hấp 1 tuần, pH có giá trị lần lượt là 4,6 và 4,4 Sau 6 tuần thì giảm còn 4,4 đối với môi trường rắn và 4,1 với môi trường lỏng [51] Do vậy, sau khi hấp giá trị pH thay đổi nhiều hơn trong môi trường lỏng, môi trường rắn trở nên acid hơn Sự thay đổi pH cũng có khả năng gây ra sự xâm nhập tự do của ion H+ vào thành tế bào, tạo pH tối ưu cho hoạt động của enzyme nới lỏng thành tế bào [51], ion

H+ trong môi trường sẽ thâm nhập vào thành tế bào hoạt hóa enzyme phân hủy các liên kết polysaccharide liên kết giữa các sợi cellulose làm cho chúng lỏng lẻo và tạo điều kiện cho thành tế bào giãn dưới tác động của áp suất thẩm thấu của không bào trung tâm, kích thích sự sinh trưởng của tế bào

pH môi trường quá cao hoặc quá thấp làm giảm khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của tế bào từ môi trường, dẫn tới tế bào sinh trưởng chậm

Nếu pH của môi trường thấp hơn 5 hay cao hơn 6 đều có ảnh hưởng đến trạng thái của môi trường nuôi cấy và sự hòa tan các chất dinh dưỡng

- Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất điều tiết sinh trưởng gồm chất kích thích và ức chế Trong nhân giống cây trồng, người ta thường sử dụng chất kích thích sinh trưởng để kích thích

sự phát sinh cơ quan

+ Auxin

Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid (IAA) IAA có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ Ngoài IAA còn có các dẫn xuất của nó là napthyl axetic acid (NAA) và 2,4 - dichlorophenoxy acetic acid (2,4 - D) Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ

NAA có tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ NAA tác động ở mức độ phân tử trong tế bào theo ba cơ chế đó là cơ chế thứ nhất:

NAA gắn với phân tử enzym và kích thích enzym hoạt động Tác dụng của auxin

là kích thích hoạt tính của ATPase, cơ chế thứ hai: auxin tác động vào gen và các enzym phân giải acid nucleic, cơ chế thứ ba: auxin tác động thông qua sự thay đổi tính thẩm thấu của màng Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy NAA dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt động như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H+ làm màng tế bào mềm và kéo dài ra, do đó tế bào lớn lên và sinh trưởng Trong tế bào, NAA có tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic [14]

Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng

đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây

- Cytokinin

Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào do chúng hoạt hóa mạnh mẽ sự tổng hợp acid nucleic và protein Các cytokinin thường gặp là kinetine, BAP

Kinetine được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất acid nucleic Kinetine thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine BAP là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều kinetine Kinetine và BAP cùng

có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp DNA, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzym Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon với DNA, tạo điều kiện cho sự tổng hợp DNA [14]

Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) [40] đã cho thấy không phải các chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinh trưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều khiển bằng sự tác động tương hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đến sự phát triển và phát sinh hình thái của tế bào

và mô Những nghiên cứu của Skoog [40] cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, và thấp thì thích hợp cho quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận lợi cho phát triển mô sẹo (callus)

Giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảm ứng bởi auxin còn giai đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả hai chất kích thích sinh trưởng Skoog và Miller (1957) [40], đã khẳng định vai trò của cytokinin trong quá trình phân chia tế

bào cụ thể là cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bình thường Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang phát triển [14]

2.3 Tình hình nghiên cứu cây gừng trong nước và thế giới

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Gừng Núi đá là một loại cây mới mang tính địa phương do vậy hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về chúng Tuy nhiên, các nghiên cứu về gừng nói chung

đã được rất nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu

K.Nirmal Babu và cs (1991) [47] đã nghiên cứu tái sinh cây gừng (Zingiber

officinale Rose.) từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá Mảnh lá non của gừng được nuôi

cấy trên môi trường MS với nồng độ khác nhau của chất kích thích sinh trưởng Sự

có mặt của 2,4 - D trong môi trường từ 9,0 - 22,6 µM kết quả thu được mô sẹo sinh trưởng tốt Sự hình thành cây và cơ quan xảy ra khi nồng độ của 2,4 - D giảm xuống 0,9 µM và với sự tăng thêm 44,4 µM BA vào môi trường Tỷ lệ tái sinh cây tăng chất điều hòa sinh trưởng loại bỏ hoàn toàn môi trường nuôi cấy trong những lần nuôi cấy tiếp theo Cây con kéo dài rễ khi đặt trong môi trường MS lỏng với 5,4 µM NAA Khả năng phát triển của những cây con này trong đất là khoảng 80%

Faridah và cs (2011) [28], đã nghiên cứu thành công hiệu quả tái sinh in vitro loài gừng Gió - Zingiber zerumbet từ thân rễ Môi trường thích hợp nhân nhanh chồi

gừng Gió là môi trường MS bổ sung kết hợp BAP 3,0 mg/l và IAA 0,5 mg/l cho số lượng chồi trung bình cao nhất (5,6 chồi) cho mỗi mẫu cấy so với các nồng độ khác Các chồi tốt nhất chiều dài (9,44 cm) thu được trên môi trường có chứa BAP 1,0mg/l

và IAA 2,0 mg/l Như vậy, tác động tổng hợp của BAP và IAA cải thiện đáng kể sự phát triển chồi Môi trường thích hợp ra rễ là môi trường MS bổ sung kết hợp với BAP 5,0mg/l và IAA 2,0mg/l cho số lượng rễ cao nhất (17 rễ) Tuy nhiên, rễ dài nhất mỗi mẫu cấy thu được trong môi trường MS bổ sung BAP 1,0mg/l riêng rẽ Các chồi nở rộ

là màu xanh lá cây và trông khỏe Cuối cùng, cây khỏe mạnh và hoàn chỉnh với rễ phát triển tốt, cứng và được ra cây thành công với tỷ lệ sống sót là 80%

Tamil.C.M.Sundram và cs (2012) [52] đã nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy cảm ứng tạo mô sẹo từ mầm chồi phục vụ cho thiết lập hệ thống nuôi

cấy dịch huyền phù tế bào của Mango Ginger (Curcuma Mangga) Các phản ứng

khác nhau thu được từ chồi mầm nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4 - D, NAA, IAA riêng lẻ hoặc kết hợp với nồng độ khác nhau Nồng độ succrose cũng được thử nghiệm Mô sẹo xốp sinh trưởng nhanh từ chồi mầm nuôi cấy trên

môi trường MS với 1mg/l 2,4 - D + 30 g/l succrose + 2 g/l gelite được chọn lọc để bắt đầu nuôi cấy huyền phù tế bào Với những môi trường nuôi cấy khác nhau, nuôi cấy dịch huyền phù được thành lập từ môi trường MS lỏng bổ sung 0,3 mg/l 2,4 - D + 0,1mg/l NAA + 30 g/l succrose + 0,1 g/l chiết xuất của malt + 0,5 mg/l biotin +

100 mg /l glutamine + 5mg/l acid ascorbic và acid citric tương ứng Các hợp chất phenolic sản xuất ra được kiểm soát một cách chặt chẽ bởi sự kết hợp của ascorbic

và acid citric là chất chống oxy hóa

2.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Đặng Ngọc Phúc và cs (2011) [11], đã nghiên cứu nhân giống in vitro cây sa

nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc họ gừng (Zingiberacae) từ đỉnh sinh

trưởng và đoạn thân mang chồi nách từ thân rễ của cây tự nhiên Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% là 12 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất, đạt 91,11% đối với đỉnh sinh trưởng và 86,67% đối với đoạn thân Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung riêng lẻ chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetine Sau 8 tuần nuôi cấy, khả năng tái sinh chồi tốt nhất đạt được trên môi trường bổ sung BAP 1,0 mg/l (1,36 chồi/đỉnh sinh trưởng, 1,40 chồi/đỉnh sinh trưởng bổ đôi, 1,04 chồi/đoạn thân)

Đoạn thân in vitro được cấy lên môi trường nhân nhanh bổ sung riêng lẻ hay kết hợp các

chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetine và NAA Sau 10 tuần nuôi cấy, môi trường bổ sung BAP 1,5mg/l kết hợp NAA 0,25mg/l cho số chồi lớn nhất đạt 7,40 chồi/mẫu Chồi

in vitro được cảm ứng rễ trên môi trường MS có bổ sung riêng rẽ NAA và IBA Rễ được

cảm ứng tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l NAA (18,42 rễ/chồi) Cây con

in vitro được huấn luyện thích nghi và trồng ở vườn ươm với tỷ lệ sống sót 93,14%

Võ Châu Tuấn (2014) [17], đã trình bày phương thức nuôi cấy mô sẹo và tế bào

huyền phù của cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) Môi trường MS bổ sung 2%

sucrose; 1,0 mg/l 2,4 - D và 1,0 mg/l BA thích hợp cho nuôi cấy mô sẹo từ bẹ lá của cây

nghệ đen in vitro Trong quá trình nuôi cấy, các mô sẹo thứ cấp được tạo thành từ mô sẹo

sơ cấp trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 - D và 0,5 mg/l BA Các mô sẹo này

có màu vàng, rắn và rời rạc Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập với 3 g sinh khối

mô sẹo tươi nuôi trong bình tam giác thể tích 250 ml, chứa 50 ml môi trường MS có bổ sung 3% sucrose; 1,5 mg/l 2,4 - D và 0,5 mg/l BA với tốc độ lắc 120 vòng/phút Sinh khối cao nhất đạt 10,44 g trọng lượng tươi (0,66 g trọng lượng khô) sau 14 ngày nuôi cấy Các kết quả này là cơ sở cho những nghiên cứu sâu hơn về cây nghệ đen nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp ở qui mô lớn

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Củ gừng Núi đá lấy từ vườn mẫu của Trung tâm UDTB Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu và tạo mô sẹo cây gừng Núi đá

trong điều kiện in vitro

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Phòng Kỹ thuật của Trung tâm UDTB Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn

3.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 12/2013 đến tháng 6/2014

3.3 Điều kiện nuôi cấy

Phòng thí nghiệm nuôi cấy được duy trì trong điều kiện:

- Nhiệt độ phòng: 25±20C

- Ẩm độ: 60 - 65%

- Quang chu kỳ: tối hoàn toàn

3.4 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

- Hóa chất: Môi trường MS (Murashige & Skoog’s, 1962) [42], các chất

kích thích sinh trưởng (NAA, IAA, BAP, 2,4 - D), cồn, HgCl2, Ca(OCl)2, đường, agar, nước dừa

- Thiết bị: Cân điện tử, nồi hấp khử trùng ALP, tủ sấy, tủ cấy vô trùng cấp

II, máy chuẩn pH, lò vi sóng Sanyo tủ lạnh Sanyo (Nhật bản), micropipette, bình

nuôi cấy, pank, dao, kéo, đĩa cấy, máy chụp ảnh, và một số thiết bị khác

3.5 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến hiệu quả

tạo vật liệu sạch phục vụ cho tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro

- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng tới khả

năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro

- Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến

khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro

3.6 Phương pháp nghiên cứu

3.6.1.Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu

Mẫu chồi mầm cây gừng Núi đá còn non khỏe mạnh, sạch bệnh được sử dụng

làm mẫu Nên lấy mẫu vào ngày khô ráo, lúc khô sương để hạn chế nguồn lây nhiễm

Mẫu khoảng 3 - 4 cm được thu hoạch, đem rửa sạch khoảng 15 phút dưới vòi nước chảy mạnh để loại bỏ đất cát, tách bỏ lớp vỏ già, dập nát bên ngoài Sau đó, đem rửa sạch bằng xà phòng rồi rửa lại dưới vòi nước chảy khoảng 10 phút Rồi đưa vào tủ cấy vô trùng để khử trùng

Trước tiên, mầm chồi gừng Núi đá được ngâm trong cồn 700 khoảng 1 phút rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng khoảng 3 - 4 lần Sau đó, tiến hành khử trùng mẫu theo các thí nghiệm 1, 2 để tìm ra phương pháp khử trùng mẫu thích hợp

3.6.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Sử dụng môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) [42], bổ sung agar 7g/l +

đường 30g/l + nước dừa 100ml/l

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng khác nhau tùy từng thí nghiệm

- Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là: 5,8 - 6,0

- Thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi bình nuôi cấy là 50 - 70 ml/bình

- Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,1 atm trong

15 - 20 phút

3.6.3 Nuôi cấy mô sẹo

Mầm chồi gừng Núi đá sau khi khử trùng thì cắt lát mỏng 1 - 2mm rồi cấy vào môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng với loại và nồng độ khác nhau Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp và theo dõi kết quả hình thành mô sẹo sau

8 tuần nuôi cấy

3.6.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.6.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến hiệu quả tạo vật liệu sạch phục vụ cho tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro

- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng

HgCl 2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều kiện

in vitro

+ Công thức thí nghiệm

• CT1: 7 phút

• CT2: 10 phút

• CT3: 12 phút

• CT4: 15 phút

+ Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần cấy 10 mẫu, mỗi bình 1 mẫu

Bề mặt mẫu cấy thường chứa một lượng lớn các vi sinh vật gây nhiễm Vì vậy, mẫu thường được khử trùng triệt để bề mặt trước khi cấy vào môi trường để tránh nhiễm Chồi mầm gừng Núi đá mới nảy mầm khoảng 3 - 4 cm được cắt từ củ gừng, khử trùng theo các bước như trên và ngâm trong HgCl2 0,1% với thời gian tương ứng với các công thức trên Cấy vào môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp Cấy vào môi trường MS + 7g agar + 30g đường + 100ml/l nước dừa trong điều kiện 25±2 0C và theo dõi các chỉ tiêu sau 4 tuần nuôi cấy

Chú ý: Mẫu phải ngập trong dung dịch khử trùng

+ Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ

Sau đó, khử trùng bằng HgCl2 0,1% ở khoảng thời gian thích hợp vừa nghiên cứu ở thí nghiệm 1 Tiếp theo, mẫu được rửa sạch khoảng 2 – 3 lần nước cất vô trùng

Đem tách bỏ lớp vỏ ngoài của mẫu khoảng 2 - 3 lớp, rồi khử trùng bằng Ca(OCl)2

15% ở thời gian tương ứng với các công thức trên Rửa sạch 2 – 3 lần nước cất vô trùng Mẫu sau khi khử trùng được tách bỏ lớp vỏ ngoài và thái lát khoảng 2 – 3 mm, cấy vào môi trường nuôi cấy thích hợp và theo dõi kết quả sau 4 tuần nuôi cấy

+ Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ

mẫu chết

3.6.2.4 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro

Mầm chồi gừng sạch sau khi khử trùng sẽ thái mỏng thành từng lát khoảng 1 -

2 mm Cấy vào môi trường MS + 7g agar + 100ml nước dừa/l với nồng độ các chất kích thích sinh trưởng được bổ sung tương ứng với các công thức của từng thí nghiệm Môi trường được điều chỉnh ở pH = 5,8 - 6,0 Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ

25 ±20C, trong tối Quan sát và theo dõi chỉ tiêu sau 8 tuần nuôi cấy

- Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá

+ Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ tạo mô sẹo, chất lượng mô sẹo

-Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến

khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro

+ Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mô sẹo tạo thành, chất lượng mô sẹo

- Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với 2,4 - D đến khả

năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro