3.6.4.1. Nội dung 1: Nghiờn cứu ảnh hưởng của phương phỏp khử trựng đến hiệu quả tạo vật liệu sạch phục vụ cho tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
- Thớ nghiệm 1: Nghiờn cứu ảnh hưởng của thời gian khử trựng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trựng mẫu cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện
in vitro.
+ Cụng thức thớ nghiệm
• CT2: 10 phỳt • CT3: 12 phỳt • CT4: 15 phỳt.
+ Phương phỏp nghiờn cứu
Thớ nghiệm được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 4 cụng thức, mỗi cụng thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần cấy 10 mẫu, mỗi bỡnh 1 mẫu.
Bề mặt mẫu cấy thường chứa một lượng lớn cỏc vi sinh vật gõy nhiễm. Vỡ vậy, mẫu thường được khử trựng triệt để bề mặt trước khi cấy vào mụi trường để trỏnh nhiễm. Chồi mầm gừng Nỳi đỏ mới nảy mầm khoảng 3 - 4 cm được cắt từ củ gừng, khử trựng theo cỏc bước như trờn và ngõm trong HgCl2 0,1% với thời gian tương ứng với cỏc cụng thức trờn. Cấy vào mụi trường nuụi cấy và điều kiện nuụi cấy thớch hợp. Cấy vào mụi trường MS + 7g agar + 30g đường + 100ml/l nước dừa trong điều kiện 25±2 0C và theo dừi cỏc chỉ tiờu sau 4 tuần nuụi cấy.
Chỳ ý: Mẫu phải ngập trong dung dịch khử trựng.
+ Chỉ tiờu theo dừi: Tỷ lệ mẫu sống khụng nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ
mẫu chết.
- Thớ nghiệm 2: Nghiờn cứu ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% với Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trựng mẫu cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
+ Cụng thức thớ nghiệm Cụng thức Thời gian khử trựng (phỳt) Ca(OCl)2 15% HgCl2 0,1% 1 5 X 2 10 3 20 4 30 5 40
Chỳ ý: x là thời gian khử trựng bằng HgCl2 0,1% thớch hợp được nghiờn cứu ở thớ nghiệm 1. + Phương phỏp thớ nghiệm:
Thớ nghiệm được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn với 5 cụng thức, mỗi cụng thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần cấy 10 mẫu, mỗi bỡnh 1 mẫu.
Sau khi xử lý sơ bộ bằng xà phũng. Mẫu được đưa vào tủ cấy vụ trựng ngõm trong cồn 700 khoảng 1 phỳt, rồi rửa khoảng 3 – 4 lần bằng nước cất vụ trựng.
Sau đú, khử trựng bằng HgCl2 0,1% ở khoảng thời gian thớch hợp vừa nghiờn cứu ở thớ nghiệm 1. Tiếp theo, mẫu được rửa sạch khoảng 2 – 3 lần nước cất vụ trựng.
Đem tỏch bỏ lớp vỏ ngoài của mẫu khoảng 2 - 3 lớp, rồi khử trựng bằng Ca(OCl)2 15% ở thời gian tương ứng với cỏc cụng thức trờn. Rửa sạch 2 – 3 lần nước cất vụ trựng. Mẫu sau khi khử trựng được tỏch bỏ lớp vỏ ngoài và thỏi lỏt khoảng 2 – 3 mm, cấy vào mụi trường nuụi cấy thớch hợp và theo dừi kết quả sau 4 tuần nuụi cấy.
+ Chỉ tiờu theo dừi: Tỷ lệ mẫu sống khụng nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ
mẫu chết.
3.6.2.4. Nội dung 2: Nghiờn cứu ảnh hưởng của chất kớch thớch sinh trưởng đến khả năng tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
Mầm chồi gừng sạch sau khi khử trựng sẽ thỏi mỏng thành từng lỏt khoảng 1 - 2 mm. Cấy vào mụi trường MS + 7g agar + 100ml nước dừa/l với nồng độ cỏc chất kớch thớch sinh trưởng được bổ sung tương ứng với cỏc cụng thức của từng thớ nghiệm. Mụi trường được điều chỉnh ở pH = 5,8 - 6,0. Nuụi cấy ở điều kiện nhiệt độ
25 ±20C, trong tối. Quan sỏt và theo dừi chỉ tiờu sau 8 tuần nuụi cấy.
- Thớ nghiệm 3: Nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D đến khả năng tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ. + Cụng thức thớ nghiệm Cụng thức Nồng độ 2,4 - D (mg/l) 1 0 (DC) 2 0,5 3 1 4 2 5 3 6 6 + Phương phỏp thớ nghiệm
Thớ nghiệm được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn gồm 6 cụng thức, mỗi cụng thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần cấy 10 mẫu, mỗi bỡnh cấy 1 mẫu.
+ Chỉ tiờu theo dừi: Tỷ lệ tạo mụ sẹo, chất lượng mụ sẹo.
-Thớ nghiệm 4: Nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
+ Cụng thức thớ nghiệm: Cụng thức Nồng độ (mg/l) NAA IAA 1 1 1 2 1 3 3 1 5 4 3 1 5 5 1 6 5 5 7 3 3 8 3 5 9 5 3 + Phương phỏp thớ nghiệm
Thớ nghiệm gồm 9 cụng thức được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn. Mỗi cụng thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần cấy 10 mẫu, mỗi bỡnh cấy 1 mẫu.
+ Chỉ tiờu theo dừi: Tỷ lệ mụ sẹo tạo thành, chất lượng mụ sẹo.
- Thớ nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với 2,4 - D đến khả
năng tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro. + Cụng thức thớ nghiệm Cụng thức Nồng độ (mg/l) 2,4 – D BA 1 0 0 2 1 0 3 0 1 4 1 0,5 5 0,5 1 6 1 1 7 5 5 + Phương phỏp thớ nghiệm
Thớ nghiệm được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn gồm 7 cụng thức, mỗi cụng thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần cấy 10 mẫu, mỗi bỡnh cấy 1 mẫu.
3.6.2.3. Nội dung 3: Nghiờn cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
- Thớ nghiệm 6: Nghiờn cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose
đến khả năng tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
+ Cụng thức thớ nghiệm: Cụng thức Hàm lượng saccharose (%) 1 2 2 3 3 4 4 5 + Phương phỏp thớ nghiệm
Thớ nghiệm gồm 4 cụng thức được bố trớ theo kiểu ngẫu nhiờn hoàn toàn, mỗi cụng thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần cấy 10 mẫu, mỗi bỡnh cấy 1 mẫu.
Mầm chồi gừng Nỳi đỏ đó vụ trựng được cấy vào mụi trường nền với loại và nồng độ chất kớch thớch sinh trưởng thớch hợp đó nghiờn cứu ở cỏc thớ nghiệm 3, 4, 5, bổ sung hàm lượng đường Saccharose tương ứng với cỏc cụng thức trờn. Nuụi cấy trong điều kiện thớch hợp và theo dừi kết quả sau 8 tuần nuụi cấy.
+ Chỉ tiờu theo dừi: Tỷ lệ mụ sẹo tạo thành, chất lượng mụ sẹo.