hỡnh thành mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
Bảng 4.2.2. Kết quả nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả
năng hỡnh thành mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
Cụng thức NAA (mg/l) IAA (mg/l) Tổng số mẫu (mẫu) Tỷ lệ tạo mụ sẹo (%) Chất lượng mụ sẹo 1 1 1 30 20,12 Kộm 2 1 3 30 29,18 Trung bỡnh 3 1 5 30 35,24 Trung bỡnh 4 3 1 30 39,89 Tốt 5 5 1 30 42,87 Tốt 6 5 5 30 59,14 Tốt 7 3 3 30 45,56 Tốt 8 3 5 30 49,89 Trung bỡnh 9 5 3 30 51,01 Trung bỡnh LSD05 3,02 CV% 3,7
Ghi chỳ: Ở cỏc nồng độ khỏc nhau của NAA và IAA cho tỷ lệ tạo mụ sẹo khỏc nhau. Mụ sẹo hỡnh thành nhiều nhất và tốt nhất ở cụng thức 7 ( NAA 5mg/l và IAA 5mg/l). Ở cỏc nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn tỷ lệ mụ sẹo hỡnh thành đều khụng cao và chất lượng thấp. a,b,c,d,e,f,g,h thể hiện mức độ sai khỏc giữa cỏc cụng thức khỏc nhau ở mức ý nghĩa α <0,05.
Hỡnh 4.2.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng hỡnh thành mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro
Từ bảng 4.2.2 và hỡnh 4.2.2 cho thấy:
Với giỏ trị LSD05đạt 3,02 cỏc cụng thức khỏc nhau cú sự sai khỏc cú ý nghĩa ở
mức độ tin cậy 95%. Tỷ lệ tạo mụ sẹo cao nhất ở cụng thức 6 đạt 68,14%, kếđến là cụng thức 7 là 57,56%. Mụ sẹo tốt, màu vàng nhạt, chắc, to. Cụng thức 1(DC) khụng cú sự hỡnh thành mụ sẹo do khụng bổ sung chất kớch thớch sinh trưởng. Tỷ lệ mụ sẹo hỡnh thành thấp nhất ở cụng thức 2, với tỷ lệ hỡnh thành mụ sẹo là 35,12%.
Túm lại, ở cụng thức 5 khi bổ sung kết hợp 5mg/l NAA và 5mg/l IAA cho tỷ lệ
hỡnh thành mụ sẹo cao nhất (68,14%). Kết quả này của chỳng tụi trựng với kết quả
nghiờn cứu Tamil.CM.Sundram và cs (2011) [52] về tối ưu húa cỏc điều kiện nuụi cấy mụ sẹo từ chồi mầm để nuụi cấy dịch huyền phự tế bào của Mango Ginger (C. Mangga)
cũng cho tỷ lệ tạo mụ sẹo cao nhất ở nồng độ 5mg/l NAA và 5mg/l IAA.
Với những kết quả trờn thấy được rằng, khi thay đổi loại và nồng độ auxin cũng làm thay đổi tỷ lệ và hỡnh thỏi mụ sẹo tạo thành. Ở thớ nghiệm 3, khi bổ sung vào mụi trường 1mg/l 2,4 - D cho tỷ lệ hỡnh thành mụ sẹo cao nhất là 61,12%. Ở
nồng độ 6mg/l thỡ tỷ lệ tạo mụ sẹo giảm xuống cũn 25,12% và mụ sẹo húa nõu. Tuy nhiờn, ở nồng độ cao NAA và IAA (5mg/l và 5mg/l) thỡ lại cho tỷ lệ hỡnh thành mụ sẹo cao nhất. Điều này chứng tỏ rằng, so với IAA và NAA, 2,4 - D gõy phản ứng tạo mụ sẹo tốt hơn thậm chớ ở nồng độ thấp. Điều này đó được Pierik (1990) [53] lý giải là do auxin tổng hợp ổn định hơn - chịu được tỏc động của cỏc yếu tố vật lý và suy thoỏi enzyme tốt hơn so với auxin tự nhiờn.
4.2.3. Kết quả nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến khả năng hỡnh thành mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
Đa số trường hợp khởi tạo và tăng sinh mụ sẹo ở cỏc loài cõy hai lỏ mầm
đều cần sự phối hợp auxin và cytokinine. Ở mức độ phõn tử, auxin kớch thớch sự
tổng hợp DNA và protein nờn tế bào sẽ tăng trưởng về kớch thước, chuẩn bị
những vật liệu cần thiết cho nguyờn phõn. Trong khi đú, tớn hiệu của cytokinine là cần thiết để tế bào chuyển pha: G2 sang M và G1 sang S, tức là cytokine sẽ tỏc
động thỳc đẩy tế bào mẹ trưởng thành, phõn chia thành hai tế bào con. Do đú, nếu trong mụi trường nuụi cấy chỉ cú auxin thỡ chỉ cú thể hỡnh thành những tế
bào khổng lồ mà khụng phõn chia được. Quỏ trỡnh nuụi cấy mụ sẹo cú thể khụng cần sử dụng cytokine trong thời gian đầu, nhưng để duy trỡ mụ sẹo này trong thời gian dài thỡ sự cú mặt của cytokine là rất cần thiết. Vỡ vậy mụi trường khởi tạo mụ sẹo khụng cú cytokine vẫn cú thể hỡnh thành mụ sẹo (điều này được chứng minh ở thớ nghiệm 3), nhưng hiệu suất thấp và dễ bị thoỏi húa [10].
Do đú, trong nghiờn cứu này chỳng tụi sử dụng mụi trường MS cú bổ sung tổ
hợp chất kớch thớch sinh trưởng BA và 2,4 - D với nồng độ khỏc nhau. Kết quả nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến khả năng tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ được thể hiện trong bảng 4.2.3.
Bảng 4.2.3. Kết quả nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA
đến khả năng hỡnh thành mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
Chất điều hũa
Sinh trưởng (mg/l) Số mẫu (mẫu) Tỷ lệ mụ sẹo tạo thành (%) Chất lượng mụ sẹo 2,4 – D BA 0 0 30 0 Mụ sẹo khụng hỡnh thành, mẫu hỡnh thành chồi hoặc rễ 1 0 30 63,68c Trung bỡnh 0 1 30 0 Mụ sẹo khụng hỡnh thành 1 0,5 30 79,89 a Tốt 0.5 1 30 76,15b Tốt 1 1 30 45,23d Trung bỡnh 5 5 30 12,5e Kộm LSD05 2,9 CV% 4,0
Ghi chỳ: a, b, c, d, e là mức độ sai khỏc cú ý nghĩa giữa cỏc cụng thức khỏc nhau trong Duncan. Ảnh hưởng của việc kết hợp 2,4 – D và BA ở cỏc nồng độ khỏc nhau thỡ khỏc nhau. Trong mụi trường khụng bổ sung chất kớch thớch sinh trưởng, khụng cú sự hỡnh thành mụ sẹo. Ở cỏc nồng độ 2,4 – D 0,5mg/l và BA 1mg/ l cho tỷ lệ tạo mụ sẹo cao nhất và chất lượng mụ sẹo tốt. Ở nồng độ cỏc cụng thức khỏc cú bổ sung kớch thớch sinh trưởng cũng cú sự hỡnh thành mụ sẹo nhưng với tỷ lệ thấp hơn.
0 63,68 0 79,89 76,15 45,23 12,5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 TLMS (%) Cụng thức TLMS Hỡnh 4.2.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến khả
năng tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
Sau 5 ngày nuụi cấy, mẫu bắt đầu phỡnh ra và sau 2 tuần bắt đầu hỡnh thành mụ sẹo ở mặt cắt hai đầu và phần tiếp xỳc với mụi trường, sau đú phỏt triển rộng ra tạo thành một khối màu vàng nhạt, mềm, dạng rời.
Qua bảng 4.2.3 và hỡnh 4.2.3, thấy rằng với giỏ trị LSD05 cỏc cụng thức khỏc nhau đều cú sự sai khỏc cú ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Ở cỏc nồng độ khỏc nhau của BA với 2,4 – D đều cú ảnh hưởng khỏc nhau đến tỷ lệ hỡnh thành mụ sẹo và chất lượng mụ sẹo. Trờn mụi trường khụng bổ sung chất kớch thớch sinh trưởng khụng cú mụ sẹo hỡnh thành. Khi tăng nồng độ 2,4 - D tỷ lệ tạo mụ sẹo tăng, tuy nhiờn giảm tỷ
lệ hỡnh thành rễ và chồi. Mụ sẹo hỡnh thành tốt nhất và nhiều nhất trong mụi trường MS cú bổ sung 0,5 mg 2,4 - D/l và 1mg BA/l với tỷ lệ hỡnh thành mụ sẹo là 79,89%. Mụ sẹo hỡnh thành chắc, cú màu vàng. Nagauda và cs (1980) [45] mụ sẹo cõy gừng
(Zingiber officinale Rosc.) hỡnh thành từ mầm chồi trong mụi trường MS cú chứa 2,4 - D, 0,1mg/l kinetine, 2mg/l BA và 10% nước dừa. Theo Jousue Jack F. Maramug và cs (1991) [36], mầm chồi cõy gừng khi nuụi cấy trong mụi trường MS cú bổ sung 2,4 – D 0,5mg/l + BA 1 mg/l cho tỷ lệ hỡnh thành mụ sẹo 100%.
Khi bổ sung riờng lẻ BA vào mụi trường khụng cú sự hỡnh thành mụ sẹo mà hỡnh thành chồi. Sự cú mặt riờng lẻ của 2,4 - D hoặc kết hợp với BA đều dẫn đến hỡnh thành mụ sẹo nhưng với nồng độ khỏc nhau thỡ tạo mụ sẹo với tỷ lệ và hỡnh thỏi khỏc nhau. Ở nồng độ 2,4 - D và BA bằng nhau làm tăng sự hỡnh thành mụ sẹo đỏng kể.
Hiệu quả phối hợp giữa 2,4 - D và BA trong sự cảm ứng tạo mụ sẹo đó được nghiờn cứu trờn nhiều loài như mụ lỏ non của cõy Dianthus caryophyllus L. cảm ứng
tạo mụ sẹo trờn mụi trường MS bổ sung 2 mg/l 2,4 - D và 0,2 mg/l BA (Karami, 2008). Chồi cõy Monordica charantia L. phỏt sinh mụ sẹo tối ưu trờn mụi trường MS bổ sung 2 mg/l BA kết hợp với 0,5 mg/l 2,4 - D và 3% sucrose (Yi và cs., 2009).
Từđú kết luận được rằng, mụi trường MS cú bổ sung 0,5 mg/l 2,4 - D kết hợp với 1mg/l BA cho hiệu quả hỡnh thành mụ sẹo cao nhất với tỷ lệ là 79,89%. Mụ sẹo màu vàng nhạt, cứng, cú dạng rời.
4.3. Kết quả nghiờn cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả
năng hỡnh thành mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
Trong nuụi cấy mụ tế bào thực vật, đường saccharose là polysaccharide phổ
biến nhất vỡ sự khuếch đại của phõn tử polysaccharide này như một phõn tử vận chuyển và nú cú độ hũa tan cao trong nước. Tuy nhiờn, hiệu quả tạo mụ sẹo khụng luụn tỷ lệ
thuận với nồng độ saccharose trong mụi trường nuụi cấy. Một vài nghiờn cứu in vitro
đó chứng minh rằng đường hỗ trợ sự tăng trưởng tối ưu và cũng đúng vai trũ quan trọng trong việc cung cấp nguồn cacbon và nguồn năng lượng thỳc đẩy tăng trưởng tế
bào và phõn chia. Đồng thời nú cũn là một thành phần tạo ra ỏp suất thẩm thấu đỏng kể
trong mụi trường. Do vậy, chỳng tụi tiến hành nuụi cấy mầm chồi gừng Nỳi đỏ trong mụi trường MS cú bổ sung cỏc nồng độ đường khỏc nhau từ 2 - 6% để khảo sỏt ảnh hưởng của chỳng đến sự hỡnh thành mụ sẹo. Kết quảđược thể hiện ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả nghiờn cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng hỡnh thành mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
Cụng Thức Nồng độ đường (%) Tổng số mẫu (mẫu) Tỷ lệ mụ sẹo hỡnh thành (%) Chất lượng mụ sẹo 1 2 30 45,32b Trung bỡnh 2 3 30 50,27a Tốt 3 4 30 32,12c Kộm 4 6 30 23,45d Kộm LSD05 3,35 CV% 4,7
Ghi chỳ: Ở cỏc hàm lượng đường khỏc nhau cú ảnh hưởng khỏc nhau đến sự hỡnh thành mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ. Hàm lượng đường quỏ thấp hoặc quỏ cao cho tỷ lệ mụ sẹo hỡnh thành khụng cao. Sử dụng đường saccharose ở hàm lượng 6% gõy ức chế quỏ trỡnh phỏt sinh mụ sẹo, mụ sẹo màu trắng, nhầy. Tỷ lệ mụ sẹo hỡnh thành cao nhất (50,27%) ở cụng thức 3 với hàm lượng đường là 30%. a,b,c,d là mức độ sai khỏc cú ý nghĩa của cỏc cụng thức khỏc nhau với mức ý nghĩa α < 0,05.
45,32 50,27 32,12 23,45 0 10 20 30 40 50 60 2,0 3,0 4,0 5,0 TLMS (%) Hàm lượng (%) tỷ lệ tạo mụ sẹo (%)
Hỡnh 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả
năng tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro
Từ bảng 4.3 và hỡnh 4.3 cho thấy, với giỏ trị LSD05 đạt 4,7 cỏc cụng thức khỏc nhau đều cú sự sai khỏc cú ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%. Điều đú cho thấy
ở cỏc nồng độ đường saccharose khỏc nhau cú ảnh hưởng khỏc nhau đến hiệu quả tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro. Ở nồng độ đường 2 - 3% cho thấy khi nồng độđường tăng thỡ tỷ lệ mụ sẹo tăng (từ 45,32% - 50,27%) chất lượng mụ sẹo tốt (mụ sẹo màu trắng vàng hoặc xanh, chắc). Do lượng
đường bổ sung cung cấp nguồn cacbon và năng lượng cho sự hỡnh thành mụ sẹo. Tuy nhiờn, khi tăng hàm lượng đường lờn 4 - 5 % cho thấy tỷ lệ mụ sẹo hỡnh thành bắt đầu giảm (từ 50,27% ở cụng thức 2 giảm cũn 23,45% ở cụng thức 4) và mụ sẹo húa nõu và nhầy. Điều này được lý giải là do khi nồng độ saccharose trong khoảng từ 4 - 5% trong mụi trường cú nồng độ muối cao như mụi trường MS thỡ bắt đầu là tỏc nhõn ức chế sự phỏt triển của tế bào [39]. Ngoài ra, hàm lượng đường quỏ cao cũng ảnh hưởng đến ỏp suất thẩm thấu của mẫu cấy, gõy stress thẩm thấu, ảnh hưởng khụng tốt đến quỏ trỡnh sinh trưởng, phỏt triển, biệt húa của mẫu.
Vỡ vậy, hàm lượng đường saccharose thớch hợp cho sự hỡnh thành mụ sẹo của mầm chồi gừng Nỳi đỏ là 3%.
Phần 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. Kết luận
Sau một thời gian nghiờn cứu ảnh hưởng của một số yếu tốđến khả năng tạo mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro chỳng tụi rỳt ra một số kết luận sau:
- Thời gian khử trựng:
+ Phương phỏp khử trựng thớch hợp nhất với gừng Nỳi đỏ là khử trựng kộp bằng HgCl2 0,1% ở 12 phỳt kết hợp Ca(OCl)2 15% ở 20 phỳt với tỷ lệ mẫu sống khụng nhiễm là 81,33%.
- Ảnh hưởng của chất kớch thớch sinh trưởng:
+ Mụi trường thớch hợp cho sự hỡnh thành mụ sẹo khi bổ sung 2,4 - D là: MS + 2,4 – D 1mg/l + 30g đường + 7g agar + 100 ml/l nước dừa cho tỷ lệ tạo mụ sẹo là 61,12%.
+ Mụi trường thớch hợp cho sự hỡnh thành mụ sẹo khi bổ sung NAA và IAA là: MS + 5mg/l NAA + 5mg/l IAA + 30g/ l đường + 7g agar + 100ml/l nước dừa cho tỷ lệ tạo mụ sẹo là 68,14%.
+ Mụi trường thớch hợp cho sự hỡnh thành mụ sẹo khi bổ sung 2,4 - D kết hợp với BA là: MS + 2,4 – D 0,5mg/l + BA 1 mg/l+ 30g đường + 7g agar + 100 ml/l nước dừa với tỷ lệ tạo mụ sẹo là 79,89%.
- Nồng độ đường saccharose thớch hợp trong nuụi cấy mụ sẹo là 3% với tỷ lệ
mẫu hỡnh thành mụ sẹo là 50,27%, mụ sẹo cú dạng chắc, màu vàng nhạt, đồng đều, to.
5.2. Kiến nghị
Do thời gian cú hạn nờn nghiờn cứu của chỳng tụi chỉ dừng lại ở việc nghiờn cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng hỡnh thành mụ sẹo. Một số kiến nghị về nghiờn cứu cõy gừng Nỳi đỏ:
- Nghiờn cứu ảnh hưởng của điều kiện nuụi cấy và một số chất thiết yếu đến sự hỡnh thành mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
- Nghiờn cứu ảnh hưởng của điều kiện nuụi cấy và một số chất thiết yếu đến sự phỏt sinh hỡnh thỏi mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
- Nghiờn cứu ảnh hưởng của điều kiện nuụi cấy và một số chất thiết yếu đến sự tớch lũy cỏc hợp chất thứ cấp của mụ sẹo gừng Nỳi đỏ trong điều kiện in vitro.
- Nghiờn cứu quy trỡnh tỏi sinh cõy gừng Nỳi đỏ từ mụ sẹo cõy gừng Nỳi đỏ trong điều in vitro.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu Tiếng Việt
1. Trần Bỡnh, Hồ Hữu Nhi, Lờ Thị Muội (1997), Cụng nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cõy trồng, NXB Nụng nghiệp.
2. Nguyễn Ngọc Bỡnh và Phạm Đức Tuấn (2001), Trồng cõy nụng nghiệp, dược liệu và đặc sản dưới tỏn rừng, NXB Nụng nghiệp Hà Nội.
3. Ngụ Xuõn Bỡnh, Bựi Bảo Hoàn, Nguyễn Thị Thỳy Hà (2003), Giỏo trỡnh Cụng
nghệ sinh học, NXB Nụng nghiệp, Hà Nội.
4. Lờ Trần Đức (1997), Cõy thuốc Việt Nam, NXB Nụng nghiệp, Hà Nội.
5. Nguyễn Như Hiền (2009), Cụng nghệ sinh học – Tập 1 – Sinh học phõn tử và tế bào – cơ sở khoa học của Cụng nghệ sinh học, NXB Giỏo dục.
6. Văn Ngọc Hướng, Đỗ Thị Thanh Thỳy (2004), “Gừng giú (Zingiber zerumbet Sm.)
vựng Tam Đảo, một nguyờn liệu quý cho điều chế zerumbon”, Tạp chớ Khoa học và Cụng nghệ, tập 44, số 3, 65- 69.
7. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cõy thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. 8. Trần Văn Minh (2003), Cụng nghệ tế bào thực vật. Giỏo trỡnh cao học –
nghiờn cứu sinh. Viện Sinh học Nhiệt đới. Trung tõm Khoa học tự nhiờn và Cụng nghệ Quốc gia.
9. Ló Đỡnh Mỡi, Phương Đức Huyờn, Nguyễn Tiến Bõn (2002), Cõy gừng – Tài