Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn cây mướp đắng momordica charantia l in vitro

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  NGUYỄN THỊ NHƯ THẢO NGHIÊN CỨU Ả NH HƯỞNG CỦ A MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN CÂY MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.) IN VITRO Đà Nẵng – Năm 2017 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG  NGUYỄN THỊ NHƯ THẢO NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ BAO PHẤN CÂY MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.) IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Ngành: Công nghệ sinh học Người hướng dẫn: TS Nguyễn Minh Lý Đà Nẵng – Năm 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Khóa luận Nguyễn Thị Như Thảo LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực Khóa luận tốt nghiệp Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng, học hỏi nhiều kiến thức lý thuyết thực hành thí nghiệm phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật, qua thân tơi trưởng thành tư duy, bố trí và tiế n hành các nghiên cứu khoa học Để hoàn thành đươ ̣c Khóa luâṇ tố t nghiê ̣p, ngoài sư ̣ nỗ lư ̣c của bản thân, tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc sư ̣ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ về măṭ khoa ho ̣c của TS Nguyễn Minh Lý Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Trần Quang Dần và Quý thầ y cô thuô ̣c bô ̣ môn Công nghê ̣ sinh ho ̣c truyề n daỵ cho nhiều việc làm quen phát triển kĩ thực hành thí nghiệm q trình tơi thực đề tài Khố luận, cũng năm ho ̣c đaị ho ̣c Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thành viên nhóm nghiên cứu, ln giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm thời gian thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn gia đình, bạn bè ln động viên, khích lệ tơi vật chất lẫn tinh thần để tơi đạt kết tốt Xin trân tro ̣ng cảm ơn Đà Nẵng, tháng năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Thị Như Thảo MỤC LỤC Mở đầu 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa ho ̣c và thư ̣c tiễn của đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung mướp đắng (Momordica charantia l.) 1.1.1 Nguồn gốc phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Điề u kiê ̣n sinh thái của mướp đắng 1.1.4 Thành phần dinh dưỡng công dụng dược liệu mướp đắng (Momordica charantia l.) 1.2 Vai trò đơn bội chọn tạo giống trồng 1.3 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn in vitro để tạo đơn bội 1.3.1 Giới thiệu chung 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu nuôi cấy bao phấn 1.3.3 Nghiên cứu kĩ thuật nuôi cấy bao phấn tạo đơn bội in vitro giới nước 13 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 18 2.2.2 Phương pháp tạo callus đơn bội mướp đắng 20 3.2.3 Bố trí thí nghiệm xử lí thống kê 22 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 23 3.1 Phương pháp xử lý mẫu 23 3.2 Ảnh hưởng kiể u gen mướp đắng đến khả phát sinh callus 24 3.3 Ảnh hưởng kích thước nụ hoa mướp đắng đến khả phát sinh callus 26 3.4 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) đến phát sinh callus đơn bội 29 3.5 Ảnh hưởng tiền xử lý lạnh (4 oC) đến khả phát sinh callus đơn bội 37 3.6 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy tối nhiệt độ 25±1 0C 32±1 0C đến khả tạo callus đơn bội 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Kết luận 42 Kiến nghị 44 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 50 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây mướp đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) loại dây leo, hàng năm [28] Cây có nguồn gốc từ Ấn Độ, Nam Trung Quốc trồng rộng rãi vùng nhiệt đới khắp giới Philippin, Malaysia, Australia, nước Châu Phi, Tây Á Mỹ La Tinh [38], [61], [23], [22], [21] Tại Việt Nam, trồng hầu hết tỉnh từ đồng đến trung du [7] Theo Trung tâm Rau màu thế giới, trước là trung tâm Rau màu Châu Á (Asian Vegetable Research and Development - AVRDC) năm 2007, tổng diện tích trồng mướp đắng nước ta 12.000 ha, Philppines 12.000 ha, Thái Lan 3.000 ha, Indonesia 8.000 [8] Tại Pakistan mướp đắng sản xuất 9,92 tấn/ha, Trung Quốc 18,9 tấn/ha trung nước Châu Á 13,7 tấn/ha (FAOSTAT 2011) [44] Mướp đắng loại rau ăn giàu chất sắt, carbonhydrate, protein,vitamin C, B1, B2, PP, chất khoáng, protit, lipit, đường, chất xơ, canxi, photpho, caroten [58] Từ mướp đắng chế biến thành nhiều ăn khác bữa ăn bình dân đến bữa tiệc khách sạn sang trọng Nó ngũ vị người ưa thích (đắng-cay-chua-chát-ngọt) [5] Ngồi ra, mướp đắng cịn có tính hàn nên dân gian thường dùng để trị bệnh mụn nhọt, giải nhiệt, sáng mắt, cảm nắng, giảm ho Trong mướp đắng có chất Alkaloid có cơng dụng lợi tiểu, giúp lưu thơng máu tốt, chống viêm, hạ sốt tăng cướng sức khỏe thị lực Loại dầu có hạt mướp đắng giàu cis(c) 9, trasn(t) 11 axit linonic t13, Chanrantin, polypeptide-p, vicine…, hợp chất không làm giảm đường huyết mà cải thiện việc dung nạp glucose giảm cholesterol, triệt tiêu mầm bệnh gây ung thư tá tràng nhiều chứng bệnh nan y khác [2], [8], [10], [7] Mướp đắng vừa có giá trị thực phẩm vừa có giá trị dược liệu nên dần người nông dân trồng với diện tích lớn cho thu nhập cao Nhưng giống sử dụng chủ yếu giống địa phương có khả thích nghi cao, chống chịu sâu bệnh tốt, song suất lại thấp Ngoài ra, giống nhập từ cơng ty nước ngồi giống lai F1 có suất độ đồng cao, giá thành hạt giống cao nhiều giống chưa qua khảo nghiệm tính thích ứng ảnh hưởng đến hiệu sản xuất Một số giống lai nước nhập nội trồng liên tục qua nhiều năm làm suy giảm nguồn gen Vì vây,̣ việc tạo giống nước theo yêu cầu đăc̣ điể m sản xuất phù hợp với điề u kiê ̣n sinh thái vùng canh tác, có suất cao ngày trở nên cần thiết Bên cạnh đó, cơng tác cho ̣n giớ ng lai F1 đòi hỏi phải có các dòng thuần, mà viê ̣c taọ các dòng này phương pháp truyền thống thường tốn nhiều thời gian công sức Thông qua thụ phấn cưỡng chọn lọc liên tục 7-8 hệ nhận dòng để đánh giá khả kết hợp giống Tuy vây,̣ phương pháp nhiều trường hợp khơng cho dịng bố mẹ đồng hợp tử cặp allen Vì vậy, việc áp dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro tạo giống mướp đắng từ bao phấn rút ngắn thời gian tạo dòng tuyệt đối xuống cịn hệ, từ cho phép giảm chi phí, tăng hiệu trình tạo giống mướp đắng có suất cao, khả thích nghi chống chịu với điều kiện Việt Nam [31], [29] Trên giới, trình tạo mướp đắng đơn bội in vitro nghiên cứu từ năm 2008, có đạt số thành tựu dừng lại giai đoạn tạo callus mà chưa cho phép thu thực tế Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng (Momordica charantia L.) in vitro” Mục tiêu đề tài Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến phát sinh callus từ bao phấn Mướp đắng in vitro Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Đánh giá hiê ̣u quả của kỹ thuâṭ khử trùng nu ̣ hoa bằ ng các hóa chấ t khác Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng yế u tố nô ̣i sinh (kiể u gen, kích thước nu ̣ hoa) đến khả phát sinh callus từ bao phấ n Mướp đắng Nội dung 3: Xác đinh ̣ ảnh hưởng thành phần nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (KIN, NAA, 2,4-D, BAP) đến khả phát sinh callus từ bao phấ n Mướp đắ ng Nội dung 4: Xác đinh ̣ ảnh hưởng của điề u kiê ̣n nuôi cấ y (tiền xử lý lạnh, nhiê ̣t đô ̣, ánh sáng) đế n sư ̣ phát sinh callus Ý nghĩa khoa ho ̣c và thực tiễn của đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Kế t quả nghiên cứu sẽ góp phầ n bổ sung dẫn liệu khoa ho ̣c về Mướp đắ ng nố i chung, và sư ̣ ảnh hưởng của điề u kiê ̣n và môi trường nuôi cấ y in vitro đế n viê ̣c phát sinh callus từ bao phấ n nói riêng Kế t quả nghiên cứu là sở khoa ho ̣c cho những nghiên cứu tiế p theo hướng taọ Mướp đắ ng đơn bô ̣i Là nguồn tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy, học tập nghiên cứu khoa học, lĩnh vực công nghệ sinh học, ứng du ̣ng công nghê ̣ sinh ho ̣c cho ̣n giố ng thư ̣c vât.̣ 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Quy trình taọ callus từ bao phấ n Mướp đắ ng in vitro có thể đươ ̣c áp du ̣ng quy trình taọ đơn bô ̣i từ Mướp đắ ng Bao phấ n thu đươ ̣c đề tài sẽ là nguồ n nguyên liê ̣u phu ̣c vu ̣ cho quá trình phát sinh phôi, tái sinh đơn bô ̣i CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung mướp đắng (Momordica charantia l.) 1.1.1 Nguồn gốc phân loại Cây mướp đắng có tên khoa học Momordica charantia L có tên nước Bitter melon, bitter ground (Anh), bitter apple, wild cucumber, bitter cucumber, ampalaya (Philipines), balsam pear (Mỹ), karela (Ấn Độ)… [18]; tên việt nam là khổ qua, mướp đắng, lương qua, cẩm lệ chi… [18] Mướp đắng (momordica charantia L.) thuộc Giới (regnum): Plantae Ngành (divisio): Magnoliophyta Lớp (class): Magnoliopsida Bộ (ordo): Cucurbitales Họ (familia): Cucurbitaceae Chi (genus): Momordica [8] Chi mướp đắng Momordica thuộc họ Cucurbitaceae có khoảng 45 lồi biết, chủ yếu tập trung Châu Phi, số lồi Mỹ, Châu Á có khoảng 5-7 lồi Theo Phạm Hoàng Hộ (1991) Nguyễn Hữu Hiến (1994), chi Momordica L Việt Nam có lồi là: Momordica charantia L Momordica Cochinchinensis (Louor.) Speng L Momordica subangulata Blume L Trong tài liệu nghiên cứu qua tiêu thu thập ác địa phương nước Viện Dược Liệu, tác giả thống mướp đắng trồng Việt Nam thuộc loài Momordica charantia L., họ Cucurbitaceae [8] Loài mướp đằng (Momordica Caharantia L.) nhiễm sắc thể 2n=22, biết đến loại trồng hóa từ lâu Theo M.E.C Reyes, B.H Gildemach C.J Jansen, 1993 lồi tồn quần thể hoang dại trồng trọt Dạng trồng trọt trở nên phong phú, dạng có hoa đơn tính gốc (monoecious) hàng năm Nếu theo hình dạng bên ngồi người ta chia mướp đắng thành hai chủng loại: [16] - Momordica charantia L Var charantia L., to (đường kính > 5cm), màu xanh nhạt, gai tù, đắng - Momordica charantia L Var abbreviata Ser., nhỏ (đường kính < 5cm), màu xanh đậm, gai nhọn, vị đắng 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cũng giống họ bầu bí, rễ mướp đắng phát triển rộng ăn nông Ở giai đoạn nảy mầm hạt phát triển rễ (rễ cọc), rễ ăn sâu Bảng 3.9 Sự ảnh hưởng 2,4-D kết hợp với BA KIN đến phát sinh callus Tỷ lệ 2,4-D BA KIN (mg/l) (mg/l) (mg/l) phát Số Thời gian sinh callus/bình phát sinh callus (%) callus (tuần) - - Hình thái callus (%) 0.5 0.5 - Nhỏ gọn, kết 0.5 1 31.11 a 38.67 a khối, màu vàng xanh Nhỏ gọn, kết 0.5 1.5 22.22 a 14.67 b khối, màu vàng xanh 0.5 - - - - Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p