Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men saccharomyces cerevisiae phân lập từ các nguồn tự nhiên

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men saccharomyces cerevisiae phân lập từ các nguồn tự nhiên Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men saccharomyces cerevisiae phân lập từ các nguồn tự nhiên Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men saccharomyces cerevisiae phân lập từ các nguồn tự nhiên Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men saccharomyces cerevisiae phân lập từ các nguồn tự nhiên Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men saccharomyces cerevisiae phân lập từ các nguồn tự nhiên

MỤC LỤC

PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về nấm men 2

2.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo 2

2.1.2 Cấu tạo của tế bào nấm men 3

2.1.3 Sinh sản của nấm men 4

2.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của nấm men 5

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của nấm men 7

2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men 9

2.2 Tổng quan về amylase 10

2.2.1 Định nghĩa 10

2.2.2 Phân loại 10

2.2.3 Ứng dụng amylase 12

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan đến đề tài 13

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 14

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Đối tượng nghiên cứu 16

3.2 Nội dung nghiên cứu 16

3.2.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên (gạo, nước thải bã sắn, bã bia) 16

3.2.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng Saccharomyces cerevisiae 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Phương pháp phân lập 16

3.3.2 Phương pháp định tính xác định khả năng phân giải tinh bột của các

chủng nấm men phân lập được 17

3.3.3 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống 17

3.3.4 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái tế bào của chủng nấm men có khả năng phân giải tinh bột phân lập được 17

3.3.5 Phương pháp định danh 17

3.3.6 Phương pháp định lượng xác định hoạt tính amylase: phương pháp Bernfeld 18

3.3.7 Bố trí thí nghiệm 19

3.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 21

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng nấm men thuộc chi 22

Saccharomyces từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên 22

4.1.1 Kết quả phân lập và quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào của các chủng nấm men phân lập được 22

4.1.2 Kết quả định tính khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm men phân lập được 24

4.1.3 Kết quả định danh chủng nấm men B1 25

4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng Saccharomyces cerevisiae B1 27

4.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển của chủng Saccharomyces cerevisiae B1 27

4.2.2 Kết quả xác định hoạt độ amylase của chủng Saccharomyces cerevisiae B1 phân lập được 32

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO……….38

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Thủy phân tinh bột thì từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl,

H2SO4 Nhưng kết quả cho thấy, thủy phân bằng acid rất khó kiểm soát vàthường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn antoàn thực phẩm Do đó, người ta đã nghiên cứu và tìm ra phương pháp ứng dụng

vi sinh vật vào trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là các loài như nấm mốc,

vi khuẩn, nấm men, nó giúp cho quá trình sản xuất được thuận lợi và tạo nhiềusản phẩm có chất lượng và an toàn

Từ lâu con người ta đã biết đến nấm men và ứng dụng của chúng trongnhiều lĩnh vực đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm Tuy nhiên trong thực tế,chưa có nhiều nghiên cứu tập trung về nấm men phân giải tinh bột, nguyên nhân

có thể do trong tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật tỏ ra ưu thế hơn so với nấmmen về khả năng sinh amylase Chính vì vậy, việc khai thác nguồn vi sinh vật lànấm men để thu nhận amylase có hoạt tính cao và nấm men có khả năng phângiải tinh bột là vấn đề quan trọng để tạo ra các chế phẩm enzyme ứng dụngtrong công nghệ thực phẩm, giúp cho quá trình sản xuất được thuận lợi và tạonhiều sản phẩm có chất lượng và an toàn

Amylase là enzyme thủy phân tinh bột thông qua việc xúc tác phân giảiliên kết glucosid trong tinh bột Amylase cũng đã được nghiên cứu và khảo sátmột cách có hệ thống về các đặc điểm và cũng được phân lập và tách chiết từnhiều nguồn khác nhau Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase cókhả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase đượctách chiết từ vi sinh vật và được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm,đặc biệt là sản xuất rượu, bia, bánh mì,…Xuất phát từ những lý do trên, chúng

tôi chọn đề tài : ‘‘Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae phân lập từ các nguồn tự nhiên’’

- Mục tiêu của đề tài :

+ Tìm ra được các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng

sinh amylase từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên

+ Trên cơ sở kết quả thu được, có thể ứng dụng các chủng này vào trongquá trình sản xuất chế biến thực phẩm cũng như sản xuất các chế phẩm amylase,đặc biệt trong ngành sản xuất rượu, bia, bánh mì,…

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về nấm men

2.1.1 Đặc điểm hình thái và cấu tạo

Nấm men có cấu tạo đơn bào, hình thái thay đổi phụ thuộc vào từng loài,tuỳ điều kiện nuôi cấy và trao đổi giống Do đó nấm men có hình thái đa dạng

như: hình trứng, hình bầu dục (Saccharomyces cerevisiae,

Saccharomycesellipsoideus,…), hình tròn (Candida utilis), hình ống dài

(Pichia), hình quả dưa chuột (Saccharomyces pastorianus), hình một đầu nhọn (Brettanomyces), hình tam giác (Trigonopsis) và một số hình đặc biệt khác.

Một số nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành những dạng sợi

gọi là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium) Ở khuẩn ty giả,

các tế bào không nối liền nhau một cách chặt chẽ như ở khuẩn ty Khuẩn ty và

khuẩn ty giả thường quan sát thấy ở các giống Endomycopsis, Candida,

Trichosporon…, nhiều loài nấm chỉ sinh khuẩn ty giả khi không được cung cấp

đủ oxy [40]

Kích thước nấm tương đối lớn, gấp 5- 10 lần so với tế bào vi khuẩn Kíchthước nấm men thay đổi rất nhiều tuỳ thuộc vào từng giống, từng loài, nói chungkích thước trung bình khoảng từ 3 – 5 x 5 – 10 µm [16]

Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp gần giống như tế bào thực vật

Có đầy đủ cấu tạo thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, ty thể, riboxom,nhân, không bào và các hạt dự trữ

2.1.2.1 Vách tế bào

Khi còn non, vách tế bào nấm men tương đối mỏng, tuỳ theo thời giannuôi dưỡng mà vách tế bào dày lên Thành phần hoá học của vách tế bào đượccấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90% là glucan và manan Phần còn lại làprotein, một ít lipit, đôi khi còn có poliphotphat, enzyme, sắc tố và một ít ion vô

cơ, đặc biệt vách tế bào còn có chứa chất kitin

Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đó các chất dinh dưỡng được hấp thu

và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được thải ra

2.1.2.2 Màng nguyên sinh chất

Màng nguyên sinh chất có chiều dày khoảng 7 – 8µm cấu tạo chủ yếu làprotein, chiếm 50% khối lương khô, còn lại là lipit 40% và một ít polysaccarit.Chức năng của màng cũng giống như màng nguyên sinh chất vi khuẩn, giúp vậnchuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào và đào thải các chất không cầnthiết ra ngoài tế bào Ngoài ra, nó còn có chức năng là giữ cho áp suất thẩm thấutrong và ngoài tế bào ổn định, là nơi sinh tổng hợp của lớp vỏ nhầy, là nơi dự trữcác chất dinh dưỡng của tế bào [16]

2.1.2.3 Ty thể

Ty thể có dạng hạt nhỏ, dạng que hoặc dạng sợi mảnh phân bố trong tếbào chất ở khoảng giữa vỏ tế bào Có thể thấy chúng ở tất cả các giai đoạn sinhtrưởng của tế bào nấm men: thời kỳ yên tĩnh, nảy chồi, sinh bào tử,… chiều dàicủa sợi ti thể là 0,2 – 0,75µm Hình dáng của nó có thể thay đổi trong quá trìnhnuôi cấy, có thể là từ các hạt hoặc que hay sợi đơn đến kết thành chuỗi

Bình thường số lượng ty thể trong tế bào nấm men dao động rất lớn: từ 1đến 50 Nếu trong tế bào chỉ có một ty thể thì thể tích của nó chiếm không nhỏ

hơn 20% thể tích tế bào, ở S.cerevisiae có 1 ty thể chiếm tới 88% thể tích tế bào.

Trong môi trường có nồng độ glucose thấp tế bào nấm men có tới 100 – 200 tythể, nhưng ở nồng độ cao chỉ thấy 30 – 40 [14]

2.1.2.4 Riboxom

Số lượng riboxom thay đổi phụ thuộc vào từng loài, từng giai đoạn phát triển

và từng điều kiện nuôi cấy Có 2 loại riboxom: loại riboxom 70S và loại 80S

2.1.2.5 Các vật thể ẩn nhập khác

Không bào có chứa các enzyme thuỷ phân, polyphotphat, lipoit, ion kimloại, các sản phẩm trao đổi chất và điều hoà các quá trình sinh trưởng và pháttriển của tế bào nấm men

Ngoài ra còn chứa một số hạt dự trữ khác như: hạt lipit dưới dạng các hạtnhỏ, các hạt glucogen, một ít hạt tinh bột [16]

2.1.2.6 Nhân

Nhân của tế bào nấm men có màng vỏ, hạch nhân (thể nhiễm sắc –karyokon) và chất nhân (karyoplasma) Vỏ nhân tham gia vào điều hòa các quitrình trong nhân bằng cách thay đổi tính thấm và thông báo trực tiếp giữa nhânvới môi trường bên ngoài tế bào, cũng như giữa nhân và tế bào chất

Đường kính của nhân tế bào nấm men vào khoảng 2 µm Phần lớn nhân

có dạng hình cầu hoặc hình elip Sự phân bố của chúng trong nội bào có thểthay đổi trong suốt quá trình sống của tế bào Kích thước nhân tế bào nấmmen không đồng nhất không những ở các tế bào khác giống, mà ở tế bào cùngmột giống trong các trạng thái sinh lý khác nhau Nhân to ở các giống

Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Saccharomycodes và dễ dàng nhìn thấy

dưới kính hiển vi [14]

2.1.3 Sinh sản của nấm men

Ở nấm men có 3 hình thức sinh sản

- Sinh sản sinh dưỡng

Là hình thức sinh sản đơn giản nhất của nấm men Có hai hình thức sinhsản sinh dưỡng: nảy chồi và hình thức ngang phân đôi tế bào như vi khuẩn

Nảy chồi là hình thức sinh sản vô tính phổ biến nhất gặp ở hầu hết nấmmen Ở điều kiện thuận lợi nấm men sinh sôi nảy nở rất nhanh Khi một chồixuất hiện các enzym thủy phân sẽ làm phân giải phần polysaccharide của thành

tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ Vật chất mới được tổng hợp sẽ đượchuy động đến chồi và làm chồi phềnh to dần lên Khi đó sẽ xuất hiện vách ngăngiữa chồi và tế bào mẹ Sau đó, chồi tách khỏi tế bào mẹ [13]

Hình thức nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất ở nấm men, thường

gặp ở giống Saccharomyces, Candida, Torulopsis [40].

Lối phân cắt ở tế các bào nấm men cũng tương tự như ở vi khuẩn Tế bàodài ra, ở giữa mọc ra vách ngăn chia tế bào ra thành hai phần tương đương nhaumỗi tế bào con có một nhân Hình thức sinh sản này thường gặp ở nấm men

Sinh sản hữu tính do hai tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành hợp

tử Hợp tử phân chia thành các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tử phát tán

ra ngoài Nếu hai tế bào nấm men có hình thái kích thước giống nhau tiếp hợpvới nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao Nếu hai tế bào nấm men khác nhauthì gọi là tiếp hợp dị giao [5]

2.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của nấm men

2.1.4.1 Dinh dưỡng của nấm men

Chất dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy được thấm qua màng vào tế bào.Khi môi trường nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nộibào như glycogen, trehalose, lipit, các hợp chất chứa nitơ sẽ được sử dụng vàđược gọi là dinh dưỡng nội bào

Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng hoặc là đi vào thành phần tế bào

để phục vụ cho sinh trưởng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sốngcủa tế bào [14]

2.1.4.2 Dinh dưỡng Cacbon

Nguồn cacbon cung cấp cho nấm men là các loại đường khác nhau:saccarose, lactose, glucose,… và dẫn xuất, các rượu, axit hữu cơ, axit amin, Hầu hết các loài nấm men đều sử dụng được đường glucose

Các loài nấm men dùng sản xuất men gia súc thuộc giống Candida,

Torulopsis có thể đồng hóa được đường peptone Vì vậy, các men này có thể

nuôi cấy ở dịch thủy phân từ gỗ hoặc các nguồn giàu hemicellulose Nhữngdisacarit (maltose và saccarose) trước khi được nấm men sử dụng phải qua thủyphân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men [40].

Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose được sử dụng trước, kế tiếp làaxit béo tùy thuộc vào thành phần của axit này Trong đó axit acetic và glucose được

sử dụng đồng thời Nấm men sẽ sử dụng nguồn dinh dưỡng có lợi trước

Ngày nay người ta đang nghiên cứu vai trò của CO2 trong trao đổi chấtcủa nấm men, vì CO2 là chất hoạt động sinh học Những dạng liên kết với CO2

đều cần thiết cho nấm men, như axit pyruvic, axit cacbonic, và hàng loạt axithữu cơ khác [14]

2.1.4.3 Dinh dưỡng Nitơ

Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid, nên không thểphân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hoà tan, có thể

là đạm hữu cơ hoặc vô cơ

Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của axit

vô cơ cũng như hữu cơ Đó là amoni sunphat, phosphat rồi đến các muối axetat,lactat, malat và sucxinat

Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các axit amin, các peptit, cácnucleotic, Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủyphân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc, ) làm nguồn nitơ hữu cơ

Nấm men tiêu hóa rất tốt các axit amin, còn pepton kém hơn và hoàn toànkhông sử dụng được protein Nấm men chỉ sử dụng được các axit amin ở dạng

tự nhiên (L - axit amin) Trong quá trình nuôi cấy nấm men các axit amin vừa lànguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh dưỡng [14], [15]

2.1.4.4 Dinh dưỡng của các nguyên tố vô cơ

Các nguyên tố vô cơ là rất quan trọng Trong đó nhu cầu photpho là đượcquan tâm trước hết, sau đó là kali, magie, lưu huỳnh,…

Phospho chứa nhiều hợp chất quan trọng của tế bào Nấm men sử dụng tốtnguồn photpho vô cơ là ortophosphat Thiếu phospho trong môi trường dẫn đến

sự thay đổi đáng kể sự trao đổi chất, phá hỏng nhu cầu và sự hấp thu cacbon,nitơ [37]

Lưu huỳnh có trong protein và coenzyme A, nếu thiếu lưu huỳnh sẽ pháhỏng sự trao đổi chất và tổng hợp protein, enzyme Trong điều kiện kỵ khí, S bịkhử thành H2S

Nguyên tố vi lượng cũng cần thiết cho quá trình sinh lý tế bào như:mangan, đồng, sắt, kẽm,…[14]

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của nấm men

Khi cấy nấm men hay vi sinh vật nói chung vào môi trường dinh dưỡng,chúng sẽ sinh sản cho đến khi cơ chất dinh dưỡng cần thiết trong môi trườnggiảm tới mức thấp nhất Khi đó, sinh trưởng phát triển của chúng chậm dần vàngừng hẳn, cũng có thể tế bào còn vài lần phân chia tiếp, nhưng sự phân chialàm tăng sinh khối không đáng kể Nếu trong cả quá trình nuôi cấy này ta không

bổ sung và loại bỏ các sản phẩm trao đổi chất thì ta có quần thể tế bào trongkhông gian sống có giới hạn Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vậtnói chung, trong đó có nấm men được chia làm 4 pha [14]

2.1.5.1 Pha tiềm phát

Vi sinh vật mới được cấy vào môi trường nên chưa tăng về mặt số lượng.Đây là giai đoạn nấm men mới được cấy vào môi trường và chưa thực hiện quátrình sinh sản Vận tốc sinh trưởng xem như bằng không Nguyên nhân chủ yếubao gồm hai loại:

- Nguyên nhân bên trong là điều kiện của bản thân loại vi sinh vật đượccấy vào trong môi trường Nếu giống ở dạng bào tử thì bào tử cần một thời gianthấm nước trương lên, các hệ enzyme chuyển từ trạng thái không hoạt động sanghoạt động, bào tử nảy mầm, sinh trưởng Nếu giống còn non thì sẽ tiếp tục sinhtrưởng đến khi đạt kích thước tối đa và đến tuổi sinh lý trưởng thành Còn tế bàotrưởng thành cũng không thể sinh sản ngay được mà còn phải có thời gian làmquen với môi trường, đồng thời tiến hành tích luỹ năng lượng chuẩn bị cho giaiđoạn sinh sản

- Nguyên nhân bên ngoài là điều kiện môi trường gồm có chất dinh dưỡng, độ

pH môi truờng, độ ẩm, nhiệt độ,… Trong môi trường càng đầy đủ dinh dưỡng, giốngnấm men cấy vào càng non, khỏe thì pha tiềm phát càng ngắn [7]

Hình 2.2 Các pha sinh trưởng của vi sinh vật theo thời gian [2].

2.1.5.2 Pha logarit

- Trong pha này nấm men sẽ phát triển số lượng tế bào theo cấp số nhânvới tốc độ sinh trưởng là cực đại Trong pha này, nấm men có hoạt tính sinh lýsinh hóa rất đặc trưng và chúng rất nhạy cảm với các nhân tố không thuận lợihơn các tế bào đã trưởng thành và ở trạng thái ổn định

- Trong pha logarit tế bào phát triển ồ ạt, trong khi đó các chất dinh dưỡngtrong môi trường không phải là vô tận mà ngược lại ngày một giảm đi, hơn nữatrong môi trường xuất hiện và tích tụ những sản phẩm trao đổi chất không cầnthiết đối với giống nuôi cấy Như vậy trong quá trình chất dinh dưỡng cạn dần,các sản phẩm sinh ra làm cho các điều kiện mất đi sự thuận lợi cho sinh trưởng

và quá trình chuyển sang pha ổn định [14]

2.1.5.3 Pha cân bằng

Trong pha này tổng số tế bào gần như không thay đổi nghĩa là trong mộtđơn vị thời gian số tế bào sinh ra bằng số tế bào chết đi gọi là trạng thái cânbằng động Ở pha này chất dinh dưỡng trong môi trường giảm nhiều nên tế bàosinh sản giảm, tế bào chết ngày càng tăng, đối với quá trình lên men rượu ở phanày nấm men tích tụ nhiều sản phẩm trong môi trường nuôi cấy Đây cũng làgiai đoạn kết thúc việc lên men [7]

2.1.5.4 Pha suy vong

Trong pha này tế bào sống giảm dần và tế bào chết tăng dần, một số tếbào chất bị tự phân do các enzyme proteaza nội bào Các tế bào sống trở nên già

đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiện dạng hạt Tế bào chất

bị tự phân trở nên trống rỗng và bên trong còn các hạt chất béo nhỏ [14]

2.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men 2.1.6.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồnhydratcacbon, nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg,

Ca và vitamin

Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trường mà

nguồn cacbon duy nhất là tinh bột, phát triển dễ hơn trên môi trường đường vớinguồn nguyên liệu được nấu chín thì tốt hơn [40]

2.1.6.2 Nhiệt độ

Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát

triển của chúng Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ưu là 28 – 30oC,trên 43oC và dưới 28oC thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn

Ở 30oC nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S cerevisiae 2 – 3 lần, ở

35 – 38oC chúng phát triển nhanh hơn 6 – 8 lần

Ở nhiệt độ cao hoạt tính của nấm men giảm nhanh; còn ở nhiệt độ thấpkhoảng 20 – 23oC, hạn chế được mức độ tạp nhiềm và khả năng lên men cao,kéo dài hơn [40]

2.1.6.3 pH của môi trường

pH của môi trường nuôi vi sinh vật nói chung có ảnh hưởng tới đời sống

vi sinh vật rất lớn Mỗi chủng vi sinh vật hay mỗi nhóm vi sinh vật có khoảng

pH thích ứng hay tối thích cho sinh trưởng và phát triển

Ở nhóm nấm men, với các giống men rượu Saccharomyces cũng có những

pH tối thích khác nhau pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6 Ở pH = 4, tốc

độ tích lũy sinh khối giảm, pH = 3 – 3,5 thì sinh sản của nấm men ngừng lại

Đối với men rượu và men bia thuộc giống Saccharomyces pH ban đầu thích hợp

cho lên men là khoảng 5,5 Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạtđộng của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hưởng bởi pHnên chất lượng của nấm men giảm đi [14], [40]

trường với các chủng nấm men có hoạt lực lên men mạnh kích thước tế bào sẽtăng lên, ngược lại với các chủng có hoạt lực lên men yếu sẽ nhỏ hơn [14].

2.2 Tổng quan về amylase

2.2.1 Định nghĩa

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Cácenzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phântrong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước

ra các oligosaccheride với các mức độ trùng hợp khác nhau

2.2.2.1 α- amylase

- α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase) đóng một vai trò trungtâm trong quá trình thủy phân tinh bột cả trong tự nhiên và trong công nghiệp.Một lượng lớn enzyme trong nhóm này được thu nhận từ động vật, thực vật và

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của α-amylase [42]

2.2.2.2 β-amylase

β-amylase (α-1,4-glucan maltosehydrolase) được phát hiện sau α-amylase

và chỉ có mặt trong các loài thực vật Cơ chế tác dụng của β-amylase: β-amylasexúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucan trong tinh bột, glycogen,polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu khôngkhử của mạch Theo đặc tính tác dụng lên tinh bột, β-amylase hầu như không thủyphân lên hạt tinh bột nguyên mà lại thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột β-amylasephân giải 100% amylose thành maltose và 54-58% amylopectin thành maltose

β-amylase có ái lực với liên kết α-1,4-glucoside cách đầu không khử củamạch một liên kết α-1,4 Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tínhkhi không có canxi β-amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, β-amylase

bị vô hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ 70oC, nhiệt độ tối thích trong dịch tinh bột thuầnkhiết là 40 - 50oC song trong dịch nấu nhiệt độ tối thích là 60 - 65oC Đa số β-amylase hoạt động mạnh hơn trong môi trường pH = 4,5-5 β-amylase chỉ phổ biếntrong thế giới thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm [17], [38]

2.2.2.3 Glucoamylase

Glucoamylase (α-1,4-glucan glucohydrolase) hay còn gọi là γ-amylasehoặc amyloglucosidase được phát hiện ra vào năm 1950 khi các nhà nghiên cứuNhật Bản khảo sát về amylase của nấm Amylase mới này được sử dụng để sảnxuất glucose từ tinh bột như là sản phẩm duy nhất

Ở nồng độ tinh bột cao (40%), enzyme này xúc tác phản ứng ngưng tụ đểsản xuất maltose và isomaltose Phản ứng này bảo vệ được 100% năng suất củaglucose ở giai đoạn đường hóa tinh bột trong công nghiệp.

Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid thể hiện hoạt lực tối đa ởvùng pH = 3,5-5,5 Nhiệt độ hoạt động tối thích của glucoamylase là 50-60oC.Hầu hết glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 70oC So với α-amylase, glucoamylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng củaetylic, axeton [17], [38]

2.2.3 Ứng dụng amylase

2.2.3.1 Ứng dụng amylase trong việc sản xuất các sản phẩm thủy phân từ tinh bột.

Trong những năm gần đây, amylase đã được sử dụng trong quá trình sảnxuất maltodextrin, xiro glucose và fructose

Trong quá trình sản xuất công nghiệp, người ta thường sử dụng α-amylasechịu nhiệt làm tác nhân thủy phân để phân cắt một phần tinh bột, làm giảm độ nhớt

So với phương pháp thủy phân bằng acid (HCl hoặc axalic acid) thì việcthủy phân bằng α-amylase chịu nhiệt làm giảm các sản phẩm phụ tạo thành vàchi phí cho quá trình tinh chế và phục hồi thấp hơn

Sự thủy phân nửa vời là bước đầu tiên và quan trọng nhất trong chế biếntinh bột Mục đích là để làm giảm độ nhớt giúp phù hợp với quá trình chế biến.Nếu quá trình thủy phân nửa vời không tốt quá trình lọc sẽ khó khăn [17]

2.2.3.2 Ứng dụng của amylase trong sản xuất bia

Trong công nghiệp sản xuất bia truyền thống, các nước phương tây chủyếu sử dụng enzyme amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó

đến giai đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharosemyces sp Cơ sở của việc sử

dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạngthái nảy mầm, amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy phântinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành nảy mầm.Như vậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ enzyme của chính nó Khi đó hạtchỉ tổng hợp ra lượng amylase vừa đủ để thủy phân tinh bột có trong hạt Nhưthế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở quy mô lớn, dẫn đến chi phícao cho sản xuất và sản phẩm

Để khắc phục điều này thì hiện nay ở nhiều nước trên thế giới người tathay thế từ 25-50% malt bằng các nguyên liệu phi malt, nghĩa là bằng các hạt

đại mạch chưa nảy mầm như đại mạch loại hai, loại ba, ngô đã lấy hết chất béo,

…[39]

2.2.3.3 Ứng dụng amylase trong sản xuất cồn

Để sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu tinh bột, mỗi nước sử dụng các loạinguyên liệu khác nhau Ví dụ, ở Mỹ người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sảnxuất, ở Brazin lại sử dụng khoai mỳ, các nước khác sử dụng gạo hoặc tấm từ gạo

Người Nhật đã biết sử dụng enzyme của nấm mốc trong quá trình đườnghóa để sản xuất rượu sake từ cách đây hơn 1700 năm

Người trung quốc thì đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hóa rượucách đây hơn 4000 năm Còn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu gạo từ cáchđây hàng ngàn năm

Quá trình sản xuất cồn trải qua hai gai đoạn: giai đoạn đường hóa và giaiđoạn rượu hóa

Thông thường, ở giai đoạn đầu (giai đoạn đường hóa) người ta thường sửdụng enzyme amylase để thủy phân tinh bột Sau đó đến giai đoạn rượu hóangười ta lại sử dụng nấm men để lên men tạo rượu Chế phẩm amylase thườngdùng ở dạng thô không phải qua tinh chế [43], [39]

2.2.3.4 Ứng dụng của amylase trong chế biến thức ăn gia súc

Amylase có chức năng phân giải tinh bột thành đường Do đó, chúng cóvai trò quan trọng trong việc hấp thụ chất dinh dưỡng từ thức ăn đối với độngvật Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượngrất lớn Trong đối tượng này, thành phần tinh bột rất cao Để tăng hiệu suất sửdụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm amylase vào.Amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột thành đường, giúp cho quá trình tiêu hóatinh bột diễn ra tốt hơn, giúp cho gia súc dễ tiêu hóa, dễ hấp thụ thức ăn, đặc biệtcho gia súc con Nhằm làm cho gia súc tăng trọng nhanh, tăng khả năng sinhsản, giảm lượng thức ăn, nâng cao hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi [39]

2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới liên quan đến đề tài

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu quan trọng tìm ra các chủng nấmmen có khả năng phân giải tinh bột góp phần quan trọng trong một số ngànhcông nghiệp thực phẩm Nấm men tiết amylase phân giải tinh bột ở nhiều mức

độ, mạnh mẽ khác nhau (De Mot và cộng sự, 1984a, 1984b) Theo nghiên cứu

của McCann và Barnet (1984), chủng Filobasidiuim capsuligenum là có khả

năng thủy phân tinh bột rất mạnh [33], [34]

Năm 1988, Laluce nghiên cứu chủng nấm men có khả năng lên men tinhbột và dextrin thành ethanol đã được phân lập từ các mẫu thu thập được từ nhàmáy tinh bột sắn của Brazil Kết quả cho thấy rằng họ đã phân lập được cácchủng nấm men có khả năng phân giải tinh bột Đặc điểm hình thái và đặc tínhsinh lý đã được mô tả và DNA - DNA tương đồng cho thấy chủng này được gọi

là Saccharomyces cerevisiae [25].

Năm 2013, trong nghiên cứu về phân lập và sản xuất amylase từ nấm men,

H Tansel đã phân lập được 25 chủng nấm men từ năm nguồn khác Sau khi ủtrong môi trường có chứa tinh bột để sàng lọc sản xuất amylase, rằng đã tìmthấy có 12 chủng nấm men sản xuất amylase và trong số đó có 3 chủng cho thấyhoạt động amylase cao nhất Các chủng có hoạt động cao nhất được xác định là

S fibuligera Các chủng cho thấy việc sản xuất amylase cao nhất ở 30oC và pH5,5 Nghiên cứu cho thấy rằng các điều kiện lên men thuận lợi và lựa chọn cácthông số thích hợp cho tăng trưởng đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuấtamylase [31]

Gần đây nhất, Tofighi và cộng sự (2014) đã nghiên cứu phân lập nấm men

từ nước thải của một nhà máy sản xuất tinh bột Việc phân lập được xác định bởiđặc tính phân tử Đặc điểm của các chủng phân lập được xác định ở mức 30, 35,

40 và 45oC trong 48h Kết quả phân lập được 50 chủng nấm men có khả năngphát triển tốt trong đĩa thạch trong một khoảng nhiệt độ từ 30 – 45oC Nấm menđược chọn, chỉ định là AT-3, chủng cho thấy khả năng keo tụ với hiệu quả sảnxuất athanol cao hơn và lớn nhanh hơn so với phần còn lại Các men được chọn

đã xác định là một chủng mới của nấm men Saccharomyces cerevisiae [22].

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước.

Amylase là một enzyme có khả năng thủy phân mối liên kết glucosid củaphân tử tinh bột Amylase có thể được tìm thấy trong nhiều nguồn khác nhau.Đặc biệt, nó được tìm thấy trong một loạt sinh vật sống, từ vi sinh vật bao gồmnấm men, nấm mốc, vi khuẩn đến thực vật và cả con người

Năm 1996, Nguyễn Khắc Tuấn đã nghiên cứu và tuyển chọn được một sốchủng nấm men từ bánh men cổ truyền để sản xuất một số chế phẩm sinh học sửdụng trong chăn nuôi lợn Đã tiến hành trên 31 mẫu bánh men rượu nổi tiếng vàtrên 31 mẫu đó đã phân lập được 105 chủng nấm men Kết quả cho thấy cácchủng nấm men phân lập được chỉ thuộc về 10 giống trong tổng số 39 giống

thuộc khóa phân loại của Lodder J (1971) Trong đó giống có mẫu phân lập

được lớn nhất là Saccharomyces tiếp theo là các giống Candida, Torulopsis và

Endomycopsis [20].

Năm 2006, nấm men và giả nấm men thuộc giống

Candida,Saccharomyces cũng tạo amylase Đặc biệt người ta đã tuyển chọn

được chủng Endomycopsis species có khả năng tổng hợp mạnh mẽ

glucoamylase, α-amylase, glucoziltransferase và invertase [14]

Năm 2007, đã có một số nghiên cứu khảo sát sự sinh trưởng của

Sacchromyces sp trên môi trường cám gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh

hưởng đến sức sống của chúng trong chế phẩm Kết quả cho thấy, 4 chủng nấmmen phân lập được từ 4 nguồn mẫu khác nhau nuôi trong môi trường cám gạo

và rỉ đường Số lượng tế bào Saccharomyces cerevisiae cao hơn trong môi trường rỉ đường và về thời gian thu hoạch số lượng tế bào Sacchromyces

cerevisiaeở thời điểm 48 giờ cao hơn 60 và 36 giờ [40].

Năm 2012, Nguyễn Hữu Thanh cùng một số tác giả khác nghiên cứu khảosát một số đặc tính sinh học và định danh nấm men được phân lập từ bánh menrượu ở Đồng Bằng sông Cửu Long Kết quả cho thấy rằng, 128 chủng nấm menđược phân lập đều có khả năng chịu nhiệt ở 30oC và 40oC do nhiệt độ môitrường ở vùng này phổ biến ở 30 – 32oC Trong đó phát hiện được 30 chủngchịu nhiệt ở 50oC đồng thời chịu cồn 17ml/L, sinh bào tử và lắng tốt, 10 chủngtrong đó không sinh H2S Giải trình tự 10 chủng, 7 chủng xác định là

Saccharomyces cerevisiae, 3 chủng là Clavispora lusitaniae Nếu so với kết quả

nghiên cứu của Guimaraes và cộng sự (2006) phân lập nấm men Saccharomyces

cerevisiae tại các vùng sản xuất rượu nho ở Brasil chỉ có 2 chủng nấm men chịu

nhiệt ở 45oC trong 15 dòng thử nghiệm, thì nấm men trong bánh men rượu ởvùng Đồng Bằng sông Cửu Long có khả năng chịu nhiệt cao hơn ở Brasil [19]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu.

- Các chủng nấm men được phân lập từ các nguồn nguyên liệu như: gạo,

bã bia, nước thải bã sắn

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces

từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên (gạo, nước thải bã sắn, bã bia).

- Phân lập và xác định một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tếbào của chủng nấm men phân lập được

- Xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm men phân lập được

- Định danh chủng nấm men

3.2.2 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng, phát triển

và hoạt tính amylase của chủng Saccharomyces cerevisiae.

- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt

tính maylase của chủng Saccharomyces cerevisiae.

- Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt

tính maylase của chủng Saccharomyces cerevisiae.

- Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, phát tiển và hoạt tính

maylase của chủng Saccharomyces cerevisiae.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Các thao tác pha mẫu, đổ môi trường được thực hiện trong buông cấy vôtrùng, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn Tìm trên các đĩa peptri những khuẩn lạc cócác đặc điểm hình thái khác nhau Mỗi khuẩn lạc được phân lập trên hai đĩapeptri chứa môi trường Hansen đặc Việc phân lập được lập lại 3-4 lần cho đếnkhi thu được khuẩn lạc đồng nhất thì tiến hành giữ giống [20], [4], [10], [9]

3.3.2 Phương pháp định tính xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm men phân lập được

Để lựa chọn chủng nấm men có khả năng phân giải tinh bột thì chúng tôitiến hành phương pháp định tính bằng cách nuôi cấy theo phương pháp chấmđiểm trên môi trường Hansen đã được thay glucose bằng tinh bột, nuôi cấy ởnhiệt độ 30oC Tiến hành nuôi trong 3-5 ngày Sau đó, nhuộm màu bằng dungdịch thuốc nhuộm Lugol Quan sát đường kính vòng thủy phân tinh bột xungquanh khuẩn lạc nấm men Nếu thuốc thử Lugol không bắt màu quanh vết cấythì chứng tỏ nấm men đó có khả năng phân giải tinh bột [18], [6]

3.3.3 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống

Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng chứa môi trườngHansen đặc vào ống nghiệm chứa Hansen lỏng Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ

35oC ± 2oC Sau 24 giờ dùng que cấy đã được vô trùng nhúng vào dịch nuôi rồicấy lên đĩa thạch chưa môi trường Hansen Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oCtrong vòng 48 giờ cho khuẩn lạc phát triển Chọn những khuẩn lạc riêng lẽ cấyria vào ống thạch nghiêng, Giống được bảo quản trong ống thạch nghiêng ở 3 -

4oC trong vòng 1 tháng [4], [10], [9], [18]

3.3.4 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái tế bào của chủng nấm men

có khả năng phân giải tinh bột phân lập được

Bằng cách soi tiêu bản sống: dùng que cấy vô trùng lấy tế bào vi sinh vật

từ ống giống, dàn đếu trên giọt nước vô trùng đã nhỏ sẵn trên phiến kính, hơ trênngọn lửa đèn cồn cho khô bề mặt kính Nhỏ vài giọt xanh metylen lên phiếnkính và tiếp tục hơ trên đèn cồn đến khô và đậy lamel Quan sát tiêu bản dướikính hiển vi điện tử [4], [11]

3.3.5 Phương pháp định danh

Các chủng nấm mốc nghi ngờ được tiến hành định danh bằng phươngpháp giải trình tự gen 28S rRNA trên hệ thống ABI 3130XL, CEQ 8000 và tracứu trên BLAST SEARCH

Nguyên tắc: để giải trình tự rRNA 16S, người ta dùng phương pháp điện

di trên gel agarose sản phẩm PCR của DNA Với phương pháp đánh dấu mồi thìsau khi điện di, người ta phát hiện các vạch điện di và từ các vạch này giải đượctrình tự của đoạn RNA Sau đó đối chiếu với ngân hàng gen để định danh chủng

3.3.6 Phương pháp định lượng xác định hoạt tính amylase: phương pháp Bernfeld

3.3.6.1 Nguyên tắc

Dùng dung dịch tinh bột làm cơ chất để xác định hoạt độ thủy phân củaamylase trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốcthử tạo màu Dinitrosalisylic

Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch tạo màu thu được đo trên máy somàu ở bước sóng 540nm

3.3.6.2 Cách tiến hành

Hỗn hợp phản ứng 0,1ml dung dịch tinh bột 1% (hòa tan 1g tinh bột và0,035g NaCl trong dịch đệm photphat, pH 7,0 đun sôi cho đến tan, để nguội và

Tiếp tục cho vào hỗn hợp trên 0,2ml dung dịch Dinitrosalisylic 1% và ủ ở 100oCtrong 10 phút Sau đó ủ hỗn hợp này trong nước đá 10 phút Bổ sung vào hỗnhợp 2ml nước cất trước khi đưa đi so màu ở bước sóng 540nm

Tiến hành làm mẫu trắng song song với mẫu chuẩn bằng cách vô hoạtenzym bởi nhiệt (đun trong nước sôi 10 phút) và acid Dinitrosalisylic 1% trướckhi tiến hành các bước tiếp theo như trên [20]

3.3.6.3 Cách lập đường chuẩn để xác định hoạt độ amylase

- Hóa chất

+ Dung dịch maltose chuẩn nồng độ 0,01M

+ Thuốc thử tạo màu

+ Nước cất

- Cách tiến hành

Cách tiến hành lập đường chuẩn để xác định hoạt độ amylase được trìnhbày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Cách tiến hành lập đường chuẩn để xác định hoạt độ amylase

Lắc nhẹ, đặt trong nước sôi 10 phút, làm nguội trong chậu nước đá

Trộn đều, đọc mật độ quang ở bước sóng 540nm

Vẽ đường chuẩn maltose với trục tung là mật độ quang, trục hoành lànồng độ maltose

00.10.20.30.40.5

0.6

f(x) = 0.05 x + 0.01R² = 1

Nồng độ maltose (µmol/ml) OD540nm

Hình 3.1 Đường chuẩn maltose

3.3.7.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces

từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.

Nguồn nguyên liệu(gạo, bã bia, nước thải bã sắn

Cấy trên môi trường Hansen

Ủ (30oC, 48h)

Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Nhuộm (thuốc thử Lugol)

Soi tế bào bằng kính hiển vi

Định danh

Pha loãng(nồng độ từ 10-1 đến 10-5)

Từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên (gạo, bã bia, nước thải bã sắn), chúngtôi tiến hành phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men thuộc chi

Saccharomyces trên môi trường Hansen Quá trình phân lập được thực hiện theo

Sau khi định danh được chủng nấm men B1 là Saccharomyces cerevisiae

,chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinhtrưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng này theo sơ đồ như sau:

Ủ (100oC, 10 phút)

Ủ nước đá 10 phútCho vào 2ml nước cất

Saccharomyces cerevisiae B1

Môi trường Hansen có bổ sung tinh bột (2%)

Nuôi cấy lắc(160 vòng/phút)( nhiệt độ, thời gian, pH )

Thời gian12h, 24h, 36h và 48h

pH5; 5,5; 6; 6,5; 7 và 7,5

Nhiệt độ

25, 30, 35 và 40oC

Đo mật độ tế bào(bước sóng 620nm)

Hình 3.3 Sơ đồ tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng

sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae B1

3.3.8 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) để xác định sự sai khác giữa các trung bình bằng phần mềm SAS 9.1

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces

từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.

4.1.1 Kết quả phân lập và quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào của các chủng nấm men phân lập được

Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành phân lập các chủng trên môitrường Hansen từ các nguồn nguyên liệu là gạo, nước thải bã sắn, bã bia Quátrình phân lập được tiến hành nhiều lần cho đến khi khuẩn lạc xuất hiện đồngnhất trên bề mặt thạch đĩa Dựa vào đặc điểm hình thái, môi trường phân lập đặcchủng thì chúng tôi chọn ra được 7 chủng có hình thái khuẩn lạc khác nhau.Chúng tôi ký hiệu các chủng này như là: G1, G2, G3, T1, T2, T3, B1

Từ các khuẩn lạc phân lập được chúng tôi tiến hành quan sát đặc điểmhình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng nấm men phân lập được.Kết quả được trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.1

Nước thải

bã sắn

B1 G2

Hình 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thài tế bào của một số chủng

nấm men phân lập được

Qua bảng 4.1, chúng tôi nhận thấy hầu hết các chủng nghi ngờ là nấm men

có màu sắc khuẩn lạc chủ yếu là trắng sữa, viền nhẵn bóng (G1, T2, T3, B1)hoặc trắng ngà, viền nhẵn bóng (T1) hoặc trắng sữa, viền răng cưa (G2, G3)

Sau khi soi tế bào dưới kính hiển vi chúng tôi nhận thấy rằng hầu hết cácchủng nấm men có tế bào hình bầu dục, hình cầu, có kích thước lớn (hình 4.1).Điều này phù hợp với các nghiên cứu về cấu trúc kích thước tế bào của nấm

men [5], [14] Do đó, chúng tôi nhận định rằng các chủng này có thể là nấmmen

Để lựa chọn những chủng có khả năng phân giải tinh bột, chúng tôi tiếnhành phương pháp định tính xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủngtrên, giữ lại các chủng có khả năng phân giải tinh bột phục vụ cho mục đíchnghiên cứu

4.1.2 Kết quả định tính khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm men phân lập được

Từ các chủng vi sinh vật phân lập được, chúng tôi tiến hành xác định khảnăng phân giải tinh bột của chúng bằng phương pháp cấy điểm ở tâm hộp peptrichứa môi trường Hansen được thay đường bằng tinh bột (2%) Sau 3 ngày, dùngthuốc thử Lugol nhỏ vào hộp để xác định đường kính vòng thủy phân Đườngkính vòng thủy phân càng lớn chứng tỏ chủng vi sinh vật có khả năng phân giảitinh bột càng tốt Kết quả được trình bày ở bảng 4.2 và hình 4.2

Bảng 4.2 Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm men phân lập được