Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh bacillus sp ở quy mô phòng thí nghiệm

Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh bacillus sp ở quy mô phòng thí nghiệm xu ly ba da nanh boi che pham vi sinh bacillus sp o quy mo phong thi nghiem Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh bacillus sp ở quy mô phòng thí nghiệm xu ly ba da nanh boi che pham vi sinh bacillus sp o quy mo phong thi nghiem Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh bacillus sp ở quy mô phòng thí nghiệm xu ly ba da nanh boi che pham vi sinh bacillus sp o quy mo phong thi nghiem Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh bacillus sp ở quy mô phòng thí nghiệm xu ly ba da nanh boi che pham vi sinh bacillus sp o quy mo phong thi nghiem Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh bacillus sp ở quy mô phòng thí nghiệm xu ly ba da nanh boi che pham vi sinh bacillus sp o quy mo phong thi nghiem Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh bacillus sp ở quy mô phòng thí nghiệm xu ly ba da nanh boi che pham vi sinh bacillus sp o quy mo phong thi nghiem

MỤC LỤC

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

2.1 Tổng quan về bã đậu nành (okara) 2

2.1.1 Sơ lược về bã đậu nành 2

2.1.2 Quy trình sản xuất sữa đậu nành tại công ty Vinasoy 3

2.1.3 Thành phần hóa học của bã đậu nành 4

2.1.4 Ứng dụng của bã đậu nành 6

2.1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng bã đậu nành trong nước 8

2.1.6 Tình hình nghiên cứu ứng dụng bã đậu nành ở nước ngoài 9

2.2 Tổng quan về Bacillus sp 11

2.3 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis (B subtilis) 13

2.3.1 Lịch sử phát hiện 13

2.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa của B subtilis 13

2.3.3 Khả năng sinh enzyme của B subtilis 15

2.3.4 Giới thiệu về B subtilis DC5 18

2.4 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens (B amyloliquefaciens) 19

2.4.1 Lịch sử phát hiện 19

2.4.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa của B amyloliquefaciens 19

2.4.3 Khả năng sinh enzyme của B amyloliquefaciens 20

2.4.4 Giới thiệu về Bacillus amyloliquefacien N1 (B amyloliquefacien N1) 22

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Đối tượng nghiên cứu 24

3.2 Nội dung nghiên cứu 24

3.3 Phương pháp nghiên cứu 24

3.3.1 Phương pháp hóa sinh 24

3.3.2 Phương pháp vi sinh 31

3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 34

3.3.3 Phương pháp vật lý 37

3.3.4 Phương pháp toán học 37

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

4.1 Kết quả nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh Bacillus sp (B subtilis DC5 và B amyloliquefacien N1) 38

4.1.1 Khả năng sinh enzyme thủy phân 38

4.1.2 Mật độ tế bào sống trong chế phẩm 41

4.2 Nghiên cứu xử lý BĐN không tiệt trùng bởi chế phẩm vi sinh Bacillus sp. trong phòng thí nghiệm 42

4.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên khả năng thủy phân BĐN bởi chế phẩm vi sinh B subtilis DC5 43

4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên khả năng thủy phân BĐN bởi chế phẩm vi sinh B amyloliquefacien N1 47

4.3 Quy trình xử lý BĐN không tiệt trùng bởi chế phẩm vi sinh Bacillus sp (B subtilis DC5 và B amyloliquefacien N1) 54

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

(Statistical Package for the Social Sciences)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng trên 100 gam BĐN ướt 5Bảng 2.2 Thành phần tương đối, khoáng chất và vitamin trên cơ sở chất khô củaBĐN của 3 giống đậu nành khác nhau 5Bảng 4.1 Hoạt độ enzyme ngoại bào sinh ra trong bã đậu nành tiệt trùng của

chủng B subtilis DC5 qua các giờ khảo sát 39 Bảng 4.2 Hoạt độ enzyme sinh ra trong bã đậu nành tiệt trùng của chủng B amyloliquefacien N1 qua các giờ khảo sát 40 Bảng 4.3 Mật độ tế bào sống trong chế phẩm chứa B subtilis DC5 và B amyloliquefacien N1 41

Bảng 4.4 Hoạt độ enzyme ngoại bào còn lại trong bã đậu nành khi bổ sung 5%

chế phẩm vi sinh B subtilis DC5 sau 4 giờ ủ 43

Bảng 4.5 Hoạt độ enzyme ngoại bào còn lại trong bã đậu nành khi bổ sung

10% chế phẩm vi sinh B subtilis DC5 sau 4 giờ ủ 44

Bảng 4.6 Hoạt độ enzyme ngoại bào còn lại trong bã đậu nành khi bổ sung 5%

chế phẩm vi sinh B amyloliquefacien N1 sau 4 giờ ủ 48

Bảng 4.7 Hoạt độ enzyme ngoại bào còn lại trong bã đậu nành khi bổ sung 10%

chế phẩm vi sinh B amyloliquefacien N1 sau 4 giờ ủ 48

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Bã đậu nành được công ty Vinasoy (Quảng Ngãi) cung cấp 2

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình sản xuất sữa đậu nành ở công ty Vinasoy (Quảng Ngãi) 3

Hình 2.3 Hình ảnh tế bào vi khuẩn B subtilis (hình a), vi khuẩn B coagulans (hình b) 11

Hình 2.4 Hình thái vi khuẩn B.subtillis (độ phóng đại 1000) 14

Hình 2.5 Khuẩn lạc B subtilis DC5 sau 24 giờ nuôi trên thạch cơ bản 18

Hình 2.6 Khuẩn lạc B subtilis DC5 sau 48 giờ nuôi trên thạch cơ bản 18

Hình 2.7 Hình ảnh khuẩn lạc B amyloliquefacien N1 20

Hình 2.8 Hình ảnh khuẩn lạc B amyloliquefacien N1sau 24 giờ nuôi cấy trên thạch cơ bản 23

Hình 2.9 Hình ảnh khuẩn lạc B amyloliquefacien N1 sau 48 giờ nuôi cấy trên thạch cơ bản 23

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thu dịch xác định hoạt độ enzyme amylase và protease .25

Hình 3.2 Sơ đồ thu nhận dịch để định lượng hàm lượng đường khử và nitơ formol28 Hình 3.3 Sơ đồ quá trình nuôi cấy và thu nhận sinh khối vi khuẩn B subtilis DC5 và B amyloliquefacien N1 32

Hình 3.4 Sơ đồ quá trình xác định mật độ tế bào vi khuẩn 32

Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc sau khi trang ra đĩa 24 giờ của chủng B amyloliquefacien N1 34

Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc sau khi trang đĩa 24 giờ của chủng B subtilis DC5 34

Hình 3.7 Sơ đồ quy trình khảo sát thu nhận chế phẩm Bacillus trong môi trường bã đậu nành tiệt trùng 35

Hình 3.8 Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng xử lý bã đậu nành không tiệt trùng của chế phẩm vi sinh Bacillus theo tỉ lệ 5% và 10% 36

Hình 4.1 Phản ứng màu xác định hoạt độ enzyme amylase (hình a) và enzyme protease (hình b) sinh ra bởi B subitlis DC5 ở 20 giờ 38

Hình 4.2 Phản ứng xác định hoạt độ của enzyme amylase (hình b) và enzyme

protease (hình b) sinh ra bởi B amyloliquefacien N1 ở 24 giờ 40

Hình 4.3 Hàm lượng đường khử sinh ra sau khi xử lý BĐN bởi chế phẩm vi

sinh B subtilis DC5 qua các nhiệt độ ủ 45

Hình 4.4 Hàm lượng nitơ formol sinh ra sau khi xử lý BĐN bởi chế phẩm vi

sinh B subtilis DC5 qua các nhiệt độ ủ 46

Hình 4.5 Hàm lượng đường khử và nitơ fomol sinh ra trong BĐN khi được xử

lý bởi chế phẩm vi sinh B subtilis DC5 ở nhiệt độ ủ là 40oC 47Hình 4.6 Hàm lượng đường khử sinh ra sau khi xử lý BĐN bởi chế phẩm vi

sinh B amyloliquefacien N1 qua các nhiệt độ ủ 49

Hình 4.7 Hàm lượng nitơ formol sinh ra sau khi xử lý BĐN bởi chế phẩm vi

sinh B amyloliquefacien N1 qua các nhiệt độ ủ 50

Hình 4.8 Hàm lượng đường và nitơ formol sinh ra trong BĐN khi được xử lý

bởi chế phẩm vi sinh B amyloliquefacien N1 ở nhiệt độ ủ là 450C 51

Hình 4.9 Dịch trong lọc được từ BĐN xử lý bằng chế phẩm B.subtilis DC5 (DC5) và B amyloliquefacien N1(N1) để xác định hàm lượng đường khử 52

Hình 4.10 Phản ứng giữa đường khử sinh ra với DNS trước khi ủ ở 1000C để tạomàu 52Hình 4.11 Phản ứng tạo màu giữa đường khử sinh ra và DNS sau khi ủ ở 1000C 53Hình 4.12 Dung dịch sau phản ứng chuẩn độ bằng NaOH 0,1N để định lượngnitơ amin bằng phương pháp formol 53Hình 4.13 Sơ đồ quy trình xử lý BĐN bởi chế phẩm vi sinh Bacillus sp 54

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong công nghiệp thực phẩm, bên cạnh quá trình tạo ra các chính phẩm cóchất lượng, việc tận thu các phế phụ phẩm là rất cần thiết Bên cạnh có ý nghĩa

về mặt bảo vệ môi trường, việc xử lý phế phụ phẩm sẽ mang lại hiệu quả kinh tếcho doanh nghiệp Một trong những phụ phẩm của công nghiệp thực phẩm phải

kể đến là bã đậu nành Bã đậu nành là phụ phẩm chủ yếu thu được sau quá trìnhchế biến đậu nành thành sữa đậu nành

Nước ta có điều kiện tự nhiên thuận lợi cùng với kinh nghiệm canh tácnông nghiệp của nông dân nên diện tích trồng và sản lượng đậu nành thu đượckhá cao qua các năm Tổng cục thống kê Việt Nam và Bộ Nông nghiệp-Pháttriển Nông thôn cho biết: năm 2012 diện tích trồng đậu nành là 119,6 nghìn havới tổng sản lượng thu được là 173,7 nghìn tấn Năm 2013, diện tích trồng đậunành là 117,8 nghìn ha với tổng sản lượng 168,4 nghìn tấn Năm 2014, diện tíchtrồng sẽ đạt 120 nghìn ha, sản lượng dự kiến là 176,4 nghìn tấn Cùng với diệntích và sản lượng đậu nành không ngừng tăng lên thì lượng bã đậu nành thuđược trong sản xuất sữa đậu nành dự báo cũng sẽ tăng theo

Hiện nay, một lượng lớn đậu nành được sử dụng để sản xuất sữa đậu nành

Ở nước ta có các thương hiệu sữa đậu nành lớn như: Vinasoy, Vinamilk,Tribeco Với công suất 120 triệu lít/năm ở nhà máy Vinasoy (Quảng Ngãi) và 90triệu lít/năm ở nhà máy Vinasoy (Bắc Ninh), các nhà chuyên môn nhận định:Vinasoy đang dẫn đầu năng lực sản xuất về sản phẩm sữa đậu nành Tổng lượng

bã đậu nành thải ra hằng năm riêng hai nhà máy của Vinasoy có thể đạt hơn 20nghìn tấn/năm

Bã đậu nành chứa một lượng lớn protein, glucid, chất béo và chất xơ Vấn

đề đặt ra là bã đậu nành nếu xử lý bằng cách thủy phân các thành phần phức tạpthành đơn giản, tăng khả năng tiêu hóa và kéo dài thời gian bảo quản thì bã đậunành sẽ có nhiều ứng dụng hơn nữa trong ngành thực phẩm, thức ăn gia súc,phân bón,

Kết quả đạt được trong việc khảo sát khả năng thủy phân bã đậu nành củanhóm nghiên cứu Đỗ Thị Bích Thủy cho thấy: 2 chủng vi khuẩn thuộc giống

Bacillus là Bacillus subtilis DC5 và Bacillus amyloliquefacien N1 có khả năng

xử lý bã đậu nành tốt [7], [18] Từ kết quả đạt được, chúng tôi tiếp tục các

nghiên cứu tiếp theo Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành: “ Nghiên cứu xây

dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh Bacillus sp ở quy mô phòng thí nghiệm”.

PHẦN 2 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1.Tổng quan về bã đậu nành (okara)

2.1.1 Sơ lược về bã đậu nành

Bã đậu nành (BĐN) hay còn gọi tắt là bã đậu: là phần rắn còn lại sau khilọc trong quá trình sản xuất đậu phụ, sữa đậu nành và các sản phẩm từ đậu nànhkhác

Trên thế giới, từ ngữ thông dụng để chỉ bã đậu nành là “okara”, thuật ngữ này xuất phát từ Nhật Bản (phát âm theo tiếng Nhật là “oh-KAR-uh”) [53]

Hình 2.1 Bã đậu nành được công ty Vinasoy (Quảng Ngãi) cung cấp

Okara là thứ bã màu trắng hoặc trắng ngà bao gồm các phần không hòa tancủa hạt đậu nành còn lại, khi hạt đậu nành xay nhuyễn được lọc trong sản xuấtsữa đậu nành và đậu phụ Khi sấy khô, bã đậu nành có màu vàng [33]

Okara là một sản phẩm phụ từ ngành công nghiệp chế biến sữa đậu nành vàđậu phụ Nó chứa protein, chất xơ có giá trị và có thể được sử dụng trong cácsản phẩm thực phẩm để đáp ứng nhu cầu của thị trường Tuy nhiên, chúng taphải xử lý một cách nhanh chóng để duy trì được các tính chất của nó BĐNchứa hầu hết cacbohydrate, một phần protein và một lượng nhỏ phần dầu của hạtđậu nành Bã ướt giống như mùn cưa ẩm, nó được cho là giống với cơm dừa vềkết cấu và hình thức, thường được sử dụng như một thành phần thực phẩm trongmón súp Nhật Bản, salad và các món ăn được chế biến từ thực vật [38]

2.1.2 Quy trình sản xuất sữa đậu nành tại công ty Vinasoy

Đồng hóa

Bã đậu nành

Là một trong những công ty phát triển mạnh về sản phẩm sữa đậu nành,Vinasoy đã và đang đứng vững trên thị trường ngành sữa Việt Nam Với tầmnhìn “trở thành và được công nhận là công ty hàng đầu về những sản phẩm dinhdưỡng từ đậu nành tại những thị trường Vinasoy có hoạt động kinh doanh”,Vinasoy đã tạo ra một thương hiệu vững chắc và được người tiêu dùng ở nước tatin cậy

Với công nghệ sản xuất được đầu tư hiện đại, quy trình công nghệ sản xuấtsữa đậu nành của Vinasoy theo sơ đồ hình 2.2 [55]:

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình sản xuất sữa đậu nành ở công ty Vinasoy (Quảng Ngãi)

Đậu nành nguyên liệu được cung cấp bởi các nhà cung cấp có uy tín vớinguồn gốc rõ ràng, đáp ứng yêu cầu chế biến và vệ sinh thực phẩm Hạt đậunành được qua hệ thống làm sạch-phân loại để loại bỏ các tạp chất và phân loạihạt Qua quá trình nghiền thô và nghiền tinh với nước nóng, đậu nành hạtchuyển sang dạng dịch, các chất dinh dưỡng được hòa tan Hệ thống ly tâm sẽtrích ly phần lớn các tinh chất có trong đậu nành

Các enzyme không có lợi cho sản phẩm như lypoxygenase và anti-tripsinđược loại bỏ hoàn toàn qua quá trình xử lý nhiệt và bài khí Dịch đậu nành thu

được được hòa trộn các thành phần nguyên liệu khác như: đường, nước, dịch mèđen nguyên chất, hương liệu, phụ gia, để tạo ra sản phẩm có thành phần dinhdưỡng hài hòa, cân đối Đồng thời, quá trình đồng hóa giúp đồng nhất các thànhphần trong sữa Chế độ xử lý tiệt trùng hiện đại UHT đảm bảo tiêu diệt vi khuẩngây hại mà vẫn giữ nguyên hương vị của sản phẩm Sản phẩm được đóng gói vôtrùng trong bao bì hộp giấy phù hợp với tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm đểphân phối ra thị trường tiêu thụ

Trong quá trình sản xuất, sau khi trích ly thu được dịch sữa đậu nành, phần

bã tách ra chính là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất Phần lớn BĐN đượcbán lại cho các công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi Đây là đối tượng nghiên cứutrong bài

2.1.3 Thành phần hóa học của bã đậu nành

Okara là một sản phẩm phụ từ ngành công nghiệp sữa đậu nành Okara thô còngọi là bột đậu nành, là một vật liệu có màu vàng nhạt, gồm các chất không hòa tan từhạt đậu nành còn lại trong túi lọc khi đậu nành xay nhuyễn được lọc cho các sản xuấtsữa đậu nành (O'Toole,1999) Okara được làm giàu từ các polysaccharides ở thành tếbào của hạt đậu nành Đặc tính của sản phẩm phụ này là bao gồm cả protein, dầu,chất xơ, thành phần khoáng, các monosaccharides và oligosaccharides cũng có thểđược tìm thấy trong đó [37]

Okara có ít chất béo, nhiều chất xơ gồm: cellulose, hemicellulose và lignin, vàcũng chứa protein, canxi, sắt, và riboflavin Trên cơ sở okara khô chứa 24%protein, 8÷15% chất béo, và 12÷14,5% chất xơ thô, ít tinh bột hoặc carbohydrateđơn giản (O'Toole, 1999) [25]

Okara ướt từ sản xuất sữa đậu nành có độ ẩm khoảng 80% Okara sauquá trình ly tâm có thể có độ ẩm nhỏ hơn 65% Hàm lượng protein của bã đậunành khác nhau tùy từng loại và phải được kiểm tra để xác định chính xác tỷ

lệ phần trăm Một số nguồn tin cho rằng BĐN khô có 24÷40% protein đậunành, nhưng theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (Cẩm nang “Dinh dưỡng người,thông tin dịch vụ Nông nghiệp số 16/8”) okara ướt có khoảng thành phầndinh dưỡng trên bảng 2.1:

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng trên 100 gam BĐN ướt.

Các giống đậu nành khác nhau cũng như quá trình sản xuất các sản phẩm

từ đậu nành khác nhau sẽ cho ra BĐN với mức chất dinh dưỡng có phần khácbiệt nhau BĐN giàu chất xơ và protein, nó cũng chứa isoflavone Do các thànhphần đặc biệt này mà BĐN có tiềm năng lớn cho việc sử dụng trong ngành côngnghiệp thực phẩm như một thành phần chức năng [33]

Thành phần tương đối, khoáng chất và vitamin trên cơ sở chất khô của bãđậu nành trên 3 giống đậu nành khác nhau được thể hiện qua bảng 2.2:

Bảng 2.2 Thành phần tương đối, khoáng chất và vitamin trên cơ sở chất khô

của BĐN của 3 giống đậu nành khác nhau [41]

Các thành phần tương đối (g/100g) Vitamin (mg/g)

Giống Protein Chấtbéo Cacbohydrates Phyticacid Chấtxơ

Thiamin(B1)

Riboflavin(B2)

Nicotinicacid(B3)

Trong thành phần cacbohydrates của BĐN có chứa: rafinose và stachyose

là hai thành phần đường phức tạp khó tiêu hóa Theo tác giả Nguyễn Đức Lượngthì BĐN có thành phần hóa học như sau [9]:

+ Protein: 3÷4%

+ Lipid: 1÷2%

+ Glucid: 5÷6%

+ Độ ẩm: 8÷90%

Thành phần trong BĐN của Vinasoy (Quảng Ngãi) được Nguyễn ThịThanh Tịnh (Đại học Bách Khoa Đà Nẵng) phân tích vào năm 2012, thể hiệndưới bảng sau [20]:

xơ, 17,8% protein, 5,9% lipid, tro 3,9%, 2,6% đường khử, 0,22% flavone và6,7% ẩm Một số thành phần của đậu nành khác cũng có khả năng hiện diệntrong bã đậu nành, bao gồm: isoflavones, lignans, phytosterol, counestans,saponin và phytates [36]

Đối với bã đậu nành được cung cấp từ nhà máy sữa đậu nành Vinasoy(Quảng Ngãi), chúng tôi đã xác định được một số thành phần như sau:

+ Protein thô (protein toàn phần): 4,252%

Làm chất nền (cơ chất) cho quá trình lên men: Tiềm năng sử dụng bãđậu nành như một cơ chất cho quá trình lên men ethanol hoặc sản xuất metan đãđược xem xét và có tính khả thi

Làm phân bón: trong trường hợp nhu cầu chăn nuôi là không đủ lớn đểsản xuất, okara có thể chuyển hướng để xử lý tạo các chất dinh dưỡng cho câytrồng và đất

Làm thức ăn cho thú cưng: okara có thể được sử dụng trong thức ăn chothú cưng vì nó chứa hàm lượng lớn các chất và protein Để sử dụng được, nóphải được sấy khô và tạo thành dạng hạt để dễ dàng đưa vào thức ăn cho thúnuôi

Làm thực phẩm: okara có thể sử dụng trong một loạt các sản phẩm thựcphẩm Nó có thể sử dụng ở dạng ướt, dạng khô hoặc như là một trong các sảnphẩm thực phẩm dạng bột nhão khác

Polysaccharides từ chất xơ rất quan trọng trong số các hợp chất chức năng

có vai trò được biết đến trong nhiều quá trình sinh lý và ngăn ngừa các bệnhkhác nhau Trong những năm gần đây, đã có một xu hướng tìm kiếm các nguồnchất xơ mới có thể được sử dụng như là thành phần trong các ngành công nghiệpthực phẩm Okara khô chứa khoảng 50% chất xơ và 25% protein, do đó, nó làmột nguồn chất xơ tuyệt vời, như vậy có thể được thêm vào các loại thực phẩmkhác nhau [38]

Okara là một loại thực phẩm đã được nhắc đến từ lâu, nhưng khả năng ứngdụng của nó chỉ theo quy mô nhỏ Mặc dù được sử dụng trong một số sản phẩmthương mại từ những năm 1970, nhưng nó vẫn không được sử dụng rộng rãi trênthế giới Các cơ sở sản xuất đồ uống từ đậu nành với quy mô lớn không sử dụnghoặc bán bã đậu nành cho các mục đích thực phẩm

Theo Catharina và cộng sự (1999) thì việc sử dụng chính của okara là làmthức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, có những cách khác nhau để sử dụng okara làmthực phẩm Ví dụ, trong một số vùng của Trung Quốc, okara được muối cùnggia vị và phục vụ như dưa chua, hoặc đơn giản làm thành một món ăn với thịt vàrau Ở nhiều vùng khác của Trung Quốc, okara được ép thành bánh và để lênmen trong khoảng 10÷15 ngày cho đến khi các bánh đậu được bao phủ bằng

màu trắng của sợi nấm Rihizopus Các loại bánh được phơi khô dưới ánh nắng

mặt trời và sau đó chiên hay nấu với rau Một sản phẩm tương tự cũng phổ biến

ở Indonesia gọi là tempeh-gembus Đôi khi, okara có thể trộn với đậu nành trước

khi lên men Nhận thức thấy những lợi ích của chất xơ trong sức khỏe conngười, nên sự quan tâm ngày càng tăng trong việc sử dụng okara như một thànhphần thực phẩm Ví dụ, có thể dễ dàng sấy khô okara bằng thiết bị sấy trốngquay cho sản phẩm khô, sau đó bã đậu nành khô có thể được tiếp tục xay thànhbột trước khi được sử dụng như một thành phần thực phẩm nhiều chất xơ [28]

Qua đó cho thấy, bã đậu nành là phụ phẩm có tiềm năng lớn trong sản xuấtthực phẩm, hóa học, bên cạnh việc sử dụng làm thức ăn cho chăn nuôi.

2.1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng bã đậu nành trong nước

Với hàm lượng protein khá cao cùng với thành phần khoáng chất phongphú, lại chứa lượng lớn chất xơ, nên nhiều nhà khoa học nhận thấy đây là mộtphụ phẩm có tiềm năng nghiên cứu ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm vàhóa học, không chỉ đơn thuần là làm thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, nhữngnghiên cứu ứng dụng từ bã đậu nành ở nước ta là không nhiều, đặc biệt là nhữngnghiên cứu ứng dụng bã đậu nành trong thực phẩm

Từ những phân tích thành phần của bã đậu nành, những năm gần đây, ởnước ta đã có một số đề tài nghiên cứu ứng dụng bã đậu nành:

Năm 2004, Ngô Đại Nghiệp (Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệtrẻ) đã nghiên cứu “Tận dụng bã đậu nành từ công nghiệp sản xuất sữa đậu nànhchế biến tương xay và một số sản phẩm phụ” và đề tài “Nghiên cứu sản xuấttương xay từ bã đậu nành” Kết quả kiểm nghiệm cho thấy tương thành phẩm cógiá trị dinh dưỡng cao Phương pháp chế biến này đã tận dụng nguồn tài nguyênphế liệu dồi dào, rẻ tiền để chế biến thành loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡngcao, có lợi cho sức khỏe và góp phần bảo vệ môi trường [48]

Bã đậu nành đã qua xử lý kỹ thuật có thể thay thế 10÷17% bột mì trong sảnxuất bánh mì, cookie và cracker Đồng thời, làm cho bánh giàu chất xơ, mộtthành phần dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể, Đó là kết quả của đề tài “Nghiêncứu công nghệ chế biến bã đậu nành tạo chế phẩm dinh dưỡng giàu chất xơ” doLại Mai Hương (Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh) làm chủ nhiệm đềtài thu được từ năm 2007 [47]

Năm 2013, Nguyễn Thị Thanh Tịnh đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá

trình thuỷ phân và lên men axit xitric từ bã đậu nành bằng Aspergillus oryzae

và Aspergillus niger” Đề tài đã thu được một số kết quả: sau khi khảo sát

thời gian thủy phân thì nhận thấy với thời gian là 6 ngày, hiệu quả quá trìnhlên men axit xitric cao nhất là 8,24g/100g bã, đã đề xuất quy trình công nghệ

thủy phân - lên men axit xitric từ bã đậu nành sử dụng nấm mốc Aspergillus oryzae thủy phân cơ chất và Aspergillus niger để lên men tạo axit xitric Kết

quả nghiên cứu này có ý nghĩa trong việc góp phần làm giảm thiểu các vấn đề

xử lý chất thải trong công nghiệp thực phẩm và đồng thời sản xuất axit hữu

cơ có tầm quan trọng, có giá trị cho ngành công nghiệp thực phẩm cũng nhưcác ngành công nghiệp khác [20]

Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu chỉ dừng lại ở quy mô phòng thínghiệm hoặc chỉ ứng dụng ở một số cơ sở nhỏ, chưa được ứng dụng và pháttriển như một quy trình sản xuất công nghiệp.

Các thành phần hóa học trong bã đậu nành như các loại đường (rafinose,stachyose) và chất xơ đều là những thành phần khó tiêu hóa ở người và độngvật Việc sử dụng các chủng vi khuẩn, để thủy phân các thành phần này thànhcác thành phần đơn giản hơn sẽ góp phần xử lý BĐN và ứng dụng sản phẩmthủy phân này trong các ngành công nghiệp khác mà đặc biệt là trong côngnghiệp thực phẩm

2.1.6 Tình hình nghiên cứu ứng dụng bã đậu nành ở nước ngoài

Hằng năm, một lượng rất lớn BĐN được tạo ra trên toàn thế giới Tại NhậtBản khoảng 800.000 tấn, ở Hàn Quốc khoảng 310.000 tấn, và ở Trung Quốckhoảng 2.800.000 tấn BĐN được tạo ra từ ngành công nghiệp sản xuất đậu hũmỗi năm

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên các thành phần hóa học, dinh dưỡng

và việc sử dụng okara Tuy nhiên, rất ít báo cáo được tìm thấy trong các tài liệu cónêu về các đặc điểm cấu trúc của polysaccharides trong okara Các kiến thức về cấutrúc có thể giải thích các mối quan hệ chức năng và cấu trúc của polysaccharidesokara cũng như cho phép sử dụng okara trong thực phẩm chức năng khác nhau.Mục đích của việc này là để điều tra các đặc điểm cấu trúc của polysaccharides từokara thông qua khai thác liên tục với các giải pháp khác nhau Li Bo và cộng sự(2012) đã xác định được một số đặc điểm cấu trúc của polysaccharides của BĐN,

từ những kết quả đã chỉ ra trong BĐN có thể chứa galactan, arabinan,arabinogalactan, xylogalacturonan, rhamnogalacturonan, xylan, xyloglucan vàcellulose [36]

Gần đây, trong một số thí nghiệm đã cho thấy okara là một nguồn tiềmnăng của các thành phần chống oxy hóa (Amin & Mukhrizah, 2006), thấy rằngmột sản phẩm thủy phân protease từ okara có khả năng hoạt động chống oxyhóa (Yokomizo, Takenaka, và Takenaka, 2002) Kết quả nghiên cứu củaPréstamo và cộng sự (2007) đã kiểm tra được tác động của okara ở chuột đã kếtluận rằng: okara có thể có ích như một thành phần phụ bổ sung vào khẩu phần

ăn và có thể bảo vệ môi trường ruột về khả năng chống oxy hóa và probiotic(Jimeınez- Escrig, Tenorio, Espinosa-Martos, & Rupérez, 2008) Trong môphỏng các điều kiện sinh lý, okara có thể giải phóng các peptide có hoạt tínhsinh học tiềm năng (Jiménez-Escrig và cộng sự, 2010) Đặc biệt, protein được côđặc từ okara và thu được kết tủa, tiếp theo cho enzyme thủy phân để giải phóngpeptide có hoạt tính sinh học tiềm năng [37]

Wua Jinhong và cộng sự (2012) đã tiến hành thủy phân BĐN bằng chếphẩm viscozyme L để thu các oligosaccharides của BĐN, sản lượng thu đượcsau thủy phân có thể đạt tối đa 10% Các oligosaccharides này có đặc tính vàchức năng sinh học như chất chống oxy hóa, có khả năng ứng dụng trong thựcphẩm chức năng và các ứng dụng khác trong thực phẩm sẽ tiếp tục được nghiêncứu trong tương lai [44].

Xu và cộng sự (2012), đã tiến hành nghiên cứu quá trình lên men BĐN tạo

sản phẩm “meitauza” (là từ gọi chung cho sản phẩm BĐN lên men ở Trung Quốc) từ hai chủng nấm mốc Actinomucor elegans và vi khuẩn Zymomonas mobilis Nghiên cứu tập trung vào những thay đổi về hóa học, vật lý và sự thay

đổi cấu trúc của hệ vi sinh vật để đo lường sự phát triển của hai chủng vi khuẩn

Một số công trình nghiên cứu khác lại tập trung thu nhận các hợp chất dinhdưỡng và hợp chất có tính chất công nghệ khác trong BĐN: Viswanathan vàcộng sự (2012) đã nghiên cứu khả năng tách chiết protein từ BĐN sau khinghiền Công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng, với kích thước BĐN sau nghiềnnhỏ hơn 75 µm sẽ cho hiệu suất tận thu protein cao nhất [42] Chan và cộng sự(1999) chỉ ra rằng, protein trong BĐN có tỷ lệ cân đối của các axit amin Do tácdụng nhiệt nên protein trong BĐN còn lại của quá trình chế biến sữa đậu nành bịbiến tính và mất đi một số chức năng công nghệ Vì vậy, Chan và cộng sự đãtiến hành nghiên cứu phương pháp tách chiết protein từ BĐN để tăng khả năngtiêu hóa chúng, khả năng tạo bọt và tạo nhũ của sản phẩm [29]

Từ tổng quan trên cho thấy: nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng BĐN đãđược thực hiện bởi các nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới, có thể nói BĐN

là một phụ phẩm đầy tiềm năng trong ngành thức ăn chăn nuôi và công nghiệpthực phẩm

2.2 Tổng quan về Bacillus sp.

Từ “Bacillus” nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi quan sát dưới kính hiển vi Nó xuất phát từ Tiếng Latin, có nghĩa là hình que Do đó, một số nơi gọi là khuẩn que hoặc trực khuẩn Bacillus là một chi thuộc các trực

khuẩn gram dương sinh nội bào tử Trong phân loại khoa học, nếu xếp đầy đủ

theo thứ tự từ giới đến chi sẽ là: giới: Bacteria; ngành: Firmicutes; lớp: Bacillii; bộ: Bacillales; họ: Bacillaceae; chi: Bacillus [54].

(a) (b)

Hình 2.3 Hình ảnh tế bào vi khuẩn B subtilis (hình a), vi khuẩn B coagulans

(hình b) (Nguồn:[50],[51]) Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả

trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ

19 Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, có khảnăng sinh nội bào tử để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường

sống Bacillus phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên: từ trên cạn đến

dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các ĐạiDương [21]

Đặc điểm của các loài thuộc chi Bacillus là có tế bào hình que, thẳng, thay

đổi nhiều về kích thước (nhỏ, trung bình hoặc lớn; 0,5÷1 x 2÷10µm) và có hìnhdạng (dày hoặc mỏng) Chúng đứng đơn độc hoặc thành chuỗi, có thể di độnghoặc không di động, ưa ấm hoặc ưa lạnh, hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc Tất

cả đều tạo thành nội bào tử có hình cầu hoặc hình oval nhỏ hoặc lớn (mỗi tế bào

hình thành một bào tử) Bào tử của chúng có khả năng kháng nhiệt Bacillus gồm

nhiều loài và có vai trò quan trọng trong thực phẩm Enzyme ngoại bào từ một sốloài và chủng thuộc chi này có khả năng thủy phân hydratcacbon, protein, lipid vàđược sử dụng trong chế biến sinh học thực phẩm Chúng có mặt trong đất, bụi vàcác sản phẩm thực vật (đặc biệt là các đồ gia vị) Ngoài ra, một số loài trong chi

này có thể gây bệnh phát sinh từ thực phẩm khi chúng tồn tại trong thực phẩm,

điển hình nhất là B.cereus Và có thể gây hư hỏng thực phẩm, đặc biệt là thực phẩm đóng hộp (các loài thường thấy là B.coagulans, B.stearothemophilus) [1] Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus thường gặp: B amyloliquefaciens,

B anthracis, B cereus, B.coagulans, B.lichenifomis, B pumilus, B sphaericus,

B subtilis, B thuringensis, B.stearothemophilus

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đa dạng về hình thái Các loài thuộc Bacillus đã, đang và ngày càng trở thành những vi sinh

vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng Các ứng dụng của chúng bao trùmhàng loạt lĩnh vực: từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệlên men hiện đại, sinh học phân tử, y-dược học chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹphẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu Chính vì

lẽ đó nên đã có ngày càng nhiều các nghiên cứu sâu về chi Bacillus này cũng

như mở rộng ứng dụng của chúng đối với đời sống con người [45]

Bên cạnh các loài vi khuẩn gây bệnh cho con người như B anthracis và B cereus, nhiều loài vi khuẩn Bacillus, đặc biệt là nhóm B subtilis, có tiềm năng

sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng trong y học, trong nông nghiệp và

trong công nghiệp thực phẩm Vì lẽ đó, Bacillus đã được quan tâm nghiên cứu ở

mọi cấp độ trong tế bào như giải mã trình tự genome Nghiên cứu cơ chế điềuhòa biểu hiện enzyme và protein, sàng lọc các chất hoạt tính sinh học từ các sảnphẩm trao đổi chất bậc hai cũng như ứng dụng các kỹ thuật sinh học hiện đạitrong phân loại vi sinh vật ở cấp độ loài và dưới loài [21]

Trong nhiều thập kỷ qua, các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus như: B amyloliquefaciens, B subtilis, B lichenifomis được sử dụng để sản xuất các

enzyme ngoại bào theo quy mô công nghiệp cũng như làm thành phần chínhtrong nhiều sản phẩm hỗ trợ tiêu hóa (men vi sinh) Trong bài này, tôi sử dụng

hai giống vi khuẩn thuộc chi Bacillus để nghiên cứu xử lý bã đậu nành, đó là: B subtilis DC5 được phân lập từ dưa cải muối chua và B amyloliquefaciens N1

được phân lập từ sản phẩm nem chua ở Huế

2.3 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus subtilis (B subtilis)

2.3.1 Lịch sử phát hiện

B subtilis đầu tiên được đặt tên là Vibrio subtilis bởi Christian Gottfried

Ehrenberg Sau đó, vào năm 1872 được Ferdinand Cohn (nhà khoa học cùng

thời với Roberi Koch) đổi tên thành B subtilis [46].

B subtilis được phát hiện trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học

Nazi của Đức Ban đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh

sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi trong thế chiến 2 Từ những năm 1949 đến 1957,

khi Henry, Albot và cộng sự tách được chủng B subtilis thuần khiết thì ứng dụng của vi khuẩn này mới trở nên rộng rãi Từ đó, thuật ngữ “subtilis therapy”

có nghĩa là “thuốc subtilis” ra đời B subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến

và được xem như là sinh vật điều trị các chứng bệnh về rối loạn đường tiêu hóa,các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy, [17]

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy tiềm năng sử dụng của chủng vi khuẩn này

là rất lớn trong nông nghiệp, thực phẩm, y học, xử lý môi trường B subtilis

ngày nay được phân lập từ nhiều nguồn như: đất vườn, một số sản phẩm thựcphẩm lên men, nước thải trong chế biến thủy hải sản,

2.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa của B subtilis

Theo phân loại vi khuẩn của Bergey (1974), B subtilis thuộc:

- Loài: Bacillus subtilis.

B subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí bắt buộc hay kị khí theo điều

kiện thích nghi, chúng phân bố hầu khắp trong tự nhiên Phần lớn chúng cư trútrong đất, thông thường đất trồng chứa khoảng 10 đến 100 triệu cfu/g Đất nghèo

dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn B subtilis rất hiếm Nước và bùn ở cửa sông cũng như ở nước biển cũng có bào tử và tế bào của B subtilis [19].

B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, gram dương Kích thước từ 0,5÷0,8 x 1,5÷3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi B subtilis có khả năng di

động, tế bào có từ 8 đến 12 tiên mao

Hình 2.4 Hình thái vi khuẩn B.subtilis (độ phóng đại 1000) [50]

Một đặc điểm quan trọng của vi khuẩn B subtilis là khả năng hình thành bào tử B subtilis có khả năng sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn

và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8÷1,8 µm B subtilis có khả năng hình

thành bào tử theo chu trình tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡngtrong môi trường bị cạn kiệt, ) Sự tạo thành bào tử diễn ra gồm nhiều giaiđoạn, quá trình gồm các giai đoạn sau:

Bào tử của vi khuẩn B subtilis gồm một lớp màng ngoài cùng, bên dưới

lớp màng đó là vỏ Vỏ chứa nhiều lớp, nhờ các lớp vỏ này mà thành phần bêntrong của vi khuẩn không bị tác động của áp suất thẩm thấu, nhiệt, Dưới vỏ làlớp màng bên trong của bào tử và trong cùng là khối tế bào chất đồng nhất Bào

tử giúp tế bào vi khuẩn sống tiềm sinh, vi khuẩn có thể ở trạng thái này trongnhiều năm

Bào tử có khả năng chống chịu nhiệt độ cao, chịu ẩm, không thuận lợi.Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào mới

[4] B subtilis có thể hình thành lớp màng nhầy (giáp mạc) là một lớp nhầy lỏng, sền sệt, không rõ bao quanh, còn gọi là capsule Màng nhầy có thể quan

sát được khi nhuộm bằng mực tàu, sẽ thấy rõ nó nổi lên trên nền sẫm Thànhphần chủ yếu của lớp màng nhầy này là polypeptid (chủ yếu là acidpolyglutamic) Chức năng của lớp vỏ nhầy này là bảo vệ, dự trữ, tích lũy và tăngkhả năng bám

B subtilis có khả năng sinh các enzyme thủy phân như: amylase, protease,

cellulase, để thủy phân protein, cacbohydrat, Phản ứng sinh hóa dương tínhkhi thử catalase, có khả năng sử dụng và khử citrat, khả năng phân giải tinh bột

và một số loại đường như: arabinose, saccharose, manitol, glucose, maltose B.subtilis không có hoạt tính lecithinase [11], [24]

2.3.3 Khả năng sinh enzyme của B subtilis

2.3.1.1 Enzyme nội bào của B.subtilis

Trong tế bào vi sinh vật nói chung và tế bào B subtilis nói riêng đều có

những enzyme xúc tác các phản ứng hóa sinh Các enzyme này sinh ra nhằmtham gia vào quá trình phân giải các hợp chất trong tế bào của chúng, giúp tếbào sinh trưởng và phát triển Tuy nhiên, các enzyme đang nói trên nằm trong tếbào của vi sinh vật mà không di chuyển ra bên ngoài tế bào Các enzyme nàychính là enzyme nội bào của vi khuẩn

Các enzyme nội bào của B subtilis gồm: các enzyme thủy phân như protease

nội bào, penicilin amidase, catalse, amylase, các enzyme tổng hợp như asparagin,các enzyme tham gia vào quá trình oxy hóa-khử như dehydrogenase, oxydase, vàcác enzyme tham gia chuyển hóa vật chất có trong tế bào

2.3.1.2 Enzyme ngoại bào của B subtilis

Hệ enzyme ngoại bào của B.subtilis rất phong phú và đa dạng gồm

protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase.[31], [35]

Trong đó, enzyme amylase và protease ngoại bào của loài B.subtilis được

nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất

 Khả năng sinh amylase của B subtilis

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra B subtilis là loài có khả năng sinh enzyme

amylase ngoại bào cao

Theo nghiên cứu của Raul và cộng sự (2014), nhiệt độ và pH có ảnh hưởng

sâu sắc đến enzyme amylase sinh ra bởi một số loài B subtilis Nghiên cứu chỉ

ra rằng: nhiệt độ tối ưu là 40 oC và pH là từ 7÷7,5 [40]

Theo công bố của Đỗ Thị Bích Thủy và cộng sự (2008), B subtilis C10 có

khả năng sinh amylase ngoại bào cao, và sinh tổng hợp amylase ngoại bào cao làtại pH= 8 Công bố nghiên cứu vào năm 2012 của Phạm Trần Thùy Hương và

Đỗ Thị Bích Thủy cho thấy chủng B subtilis DC5 có khả năng sinh amylase

ngoại bào cao [6]

Theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, có 3 loại amylase đượcbiết đến nhiều nhất là: α-amylase, β-amylase và γ-amylase (còn gọi là

glucoamylase) β-amylase và γ-amylase là các exo-enzyme, vì chúng xúc tácgiải phóng maltose và glucose từ α-glucan Còn α-amylase là một endo-enzyme

vì nó tác dụng thủy phân bên trong mối liên kết glucosid của α-glucan để tạo racác oligosaccharides với các mức độ trùng hợp khác nhau

 α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, EC.3.2.1.1) đóng vai

trò trung tâm trong quá trình thủy phân tinh bột cả trong tự nhiên và trong côngnghiệp Một lượng lớn enzyme trong nhóm này được thu nhận từ thực vật và visinh vật α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm giống nhau: chúng cókhả năng xúc tác thủy phân liên kết α-1,4 glucoside nội mạch ở bất kì vị trí nào

và không tuân theo một trật tự nào trong phân tử tinh bột mà không thể phân cắtcác mối liên kết α-1,6 Dưới tác dụng của α-amylase thì amylose bị thủy phânkhá nhanh, sản phẩm tạo thành chứa khoảng 13% glucose và 78% maltose Tácdụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự, sản phẩm tạo thành

là các dextrin phân trử thấp như maltose, glucose, isomaltose và không cho phảnứng màu với iod α-amylase hầu như không tác dụng lên tinh bột nguyên thể vàtác dụng mạnh lên tinh bột đã hồ hóa [15]

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase qua 3 giai đoạn: [15]

+ Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số liên kết trong phân tử

cơ chất bị thủy phân, tạo thành một lượng dextrin phân tử thấp đồng thời độnhớt của tinh bột giảm nhanh

+ Giai đoạn hai (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp vừa đượctạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo thành các dextrin phân tử thấp hơn

+ Ở giai đoạn cuối cùng thì sản phẩm của sự thủy phân bao gồm mộtlượng lớn maltose, maltotriose, glucose, và oloigosaccharides

 β-amylase (α-1,4-glucan maltosehydrolase, EC.3.2.1.2) xúc tác thủy phân

các liên kết α-1,4-glucan trong tinh bột, glucogen, polysacchrides đồng loại, phâncắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch Khi amylosepectin

bị tác động phân giải của enzyme này thì liên kết α-1,4 của chuỗi glucan trong phân

tử nhánh cao được giảm xuống nhưng sự phân cắt sẽ kết thúc khi gặp mối liên kếtα-1,4 glucoside đứng gần kề α-1,6 của chuỗi β-amylase không thủy phân hạt tinhbột nguyên mà thủy phân mạnh hồ tinh bột β-amylase thủy phân 100% amylosethành maltose, 54 đến 58% amylopectin thành maltose

 γ-amylase hay còn gọi là glucoamylase (α-1,4-glucan glucohydrolase,

EC.3.2.1.3): thủy phân được liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ đầu mạch khôngkhử của mạch tinh bột tạo ra đường glucose Nó cũng có khả năng thủy phân

maltose, isomaltose và dextrin B subtilis hiếm khi sản xuất ra loại enzyme này

 Khả năng sinh protease của B subtilis

Theo nghiên cứu của Đỗ Thị Bích Thủy (2006), chủng B subtilis có khả

năng sinh enzyme ngoại bào cao Trong nghiên cứu, nguồn cacbon ảnh hưởng

đến khả năng sinh enzyme protease của B subtilis lớn nhất là tinh bột Nguồn

nitơ ảnh hưởng đến khả năng sinh protease là casein

Đỗ Thị Bích Thủy (2006) cũng đã công bố nghiên cứu ảnh hưởng pH ban

đầu và nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp protease của B subtilis.

Khả năng sinh protease cao nhất của loài này trong nghiên cứu là khi nuôi cấy ở

- Endopeptidase xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide nội mạch.

- Exopeptidase xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide đầu mạch.

Dựa vào sự có mặt các nhóm chức năng ở trung tâm hoạt động, cácprotease được chia làm 4 nhóm sau: serin protease, cystein protease, asparticprotease và metallo protease

- Serin protease: Là những protease có nhóm -OH của gốc serin trong trung

tâm hoạt động, có vai trò đặc biệt quan trọng trong hoạt động xúc tác củaenzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ phân biệt: Nhóm chymotrypsin vàsubtilisin Hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính

- Cystein protease: các protease thuộc nhòm này có nhóm -SH trong trung

tâm hoạt động Các enzyme nhóm này hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính

- Aspartic protease: hầu hết đều thuộc nhóm pepsin Nhóm này bao gồm

các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các asparticprotease có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động và hoạt động mạnh

ở vùng pH trung tính

- Metallo protease: là nhóm protein hoạt động mạnh ở pH trung tính, được

tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc và các sinh vật bậc cao

2.3.4 Giới thiệu về B subtilis DC5

Bacillus subtilis DC5 được phân lập từ dưa cải muối chua ở Huế, là loài có

khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cao

Khi nghiên cứu về pH và môi trường nuôi cấy cho B subtilis DC5 sinh

tổng hợp amylase ngoại bào cao, Phạm Trần Thùy Hương và Đỗ Thị Bích Thủy(2012) đã công bố rằng: tại pH=5 là giá trị pH tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp

amylase ngoại bào cao của chủng B subtilis DC5 trên môi trường thích hợp

(môi trường cơ bản có bổ sung 0,25% lactose) Thời gian nuôi cấy 24 giờ tạo

điều kiện thuận lợi cho B subtilis DC5 sinh tổng hợp amylase ngoại bào trong

môi trường thích hợp, pH=5, nhiệt độ ban đầu là 35 oC [6]

Hình ảnh khuẩn lạc B subtilis DC5 sau 24 giờ và 48 giờ trên môi trường

thạch cơ bản:

Hình 2.5 Khuẩn lạc B subtilis DC5 sau 24 giờ nuôi trên thạch cơ bản

Hình 2.6 Khuẩn lạc B subtilis DC5 sau 48 giờ nuôi trên thạch cơ bản

2.4 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens (B amyloliquefaciens)

2.4.1 Lịch sử phát hiện

B amyloliquefaciens được Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả năng sinh α-amylase và protease Tại thời điểm đó, B amyloliquefaciens được

xem như một dòng khác của loài B subtilis hay là loài phụ B subtilis subsp amyloliquefaciens.

Đến năm 1987, B amyloliquefaciens mới được tách ra thành một loài riêng dựa trên kết quả lai DNA lần lượt là 23, 15 và 5% so với các loài B subtilis, B lichenfomis, B pumilus [39].

Từ đó đến nay, nhiều chủng B amyloliquefaciens được phân lập từ các hệ

sinh thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau được công bố Năm 2010, Borriss

và cộng sự đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số so sánh hệ genbằng microarray (microarray-based comparative genome hybridirazation), tínhtương đồng của toàn bộ hệ genome và phổ các chất hoạt tính sinh học lipopeptide

và polypeptide giữa một nhóm B amyloliquefaciens DSM 7 không có khả năng

và một nhóm B amyloliquefacien FZB 42 có khả năng sống cộng sinh trong rễ

thực vật [27]

Ngày nay, nhiều nghiên cứu ứng dụng B amyloliquefaciens đã được thực

hiện, đa phần là sử dụng loài này trên các môi trường và nhiệt độ thích hợp để

thu enzyme Nguồn phân lập được B amyloliquefaciens cũng đa dạng hơn.

2.4.2 Đặc điểm hình thái, sinh hóa của B amyloliquefaciens

Theo phân loại của Priest và cộng sự (1987), B amyloliquefaciens thuộc:

- Loài: Bacillus amyloliquefaciens [49].

B amyloliquefaciens là vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, hiếu

khí, hình que và có khả năng di động Chủng này được nghiên cứu ứng dụng đểsản xuất các chế phẩm sinh học như: chế phẩm kiểm soát bệnh trên thực vật

(Correa và cộng sự, 2009; Rao và cộng sự., 2006), enzyme (Peng và cộng sự ,

2003; Gangadharan và cộng sự., 2008)

Kích thước của tế bào B amyloliquefaciens từ 0,7÷0,9 x 1,8÷3,0 µm, có

khả năng sinh nội bào tử, nội bào tử sinh ở trung tâm hoặc gần trung tâm tế bào.Bào tử có dạng hình elip, kích thước nằm trong khoảng 0,6÷0,8 x 1,0÷1,4 µm

Hoạt tính sinh hóa của B amyloliquefaciens cho kết quả dương tính với:

oxidase, catalase, nitrate, thủy phân tinh bột, gelatin, casein, esculin, tween 40

và tween 60 Kết quả âm tính với: arginine hydrolase, lysine carboxylase,ornithine decarboxylase[52]

Cũng như B subtilis, nhiều nghiên cứu đã cho thấy loài B amyloliquefaciens

cũng có khả năng sinh enzyme ngoại bào cao Trong đó có hai loại enzyme thủyphân chính là amylase và protease

2.4.3 Khả năng sinh enzyme của B amyloliquefaciens

2.4.3.1 Enzyme nội bào của B.amyloliquefaciens

Cũng như loài B subtilis và các loại vi sinh vật khác, B amyloliquefaciens

cũng có một hệ enzyme nội bào để giúp quá trình sinh trưởng và phát triển tếbào như: amylase, protease, catalsae, các enzyme tham gia vào quá trình oxyhóa-khử: cacboxydehydrogenase, cùng các enzyme chuyển hóa vật chất trong

tế bào

2.4.3.2 Enzyme ngoại bào của B.amyloliquefaciens

Bên cạnh hệ enzyme nội bào, hệ enzyme ngoại bào sinh ra của loài B amyloliquefaciens được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu thu nhận và

ứng dụng Đáng quan tâm hơn cả là amylase và protease ngoại bào sinh ra củaloài này

Nghiên cứu của Khosro và cộng sự (2006) cho biết: B amyloliquefaciens

có khả năng sinh tổng hợp nhiều enzyme ngoại bào như: protease, amylase,phytase, nên được nghiên cứu rộng rãi Hiện nay, chế phẩm enzyme amylase

từ loại vi khuẩn này chiếm khoảng 30% các enzyme tiêu hóa của thế giới sảnxuất [34]

 Khả năng sinh amylase của B amyloliquefaciens

B amyloliquefaciens được phân lập từ nhiều nguồn như: sản phẩm tôm chua, ruột cá, nem chua, Các nghiên cứu cũng đã chỉ ra B amyloliquefaciens

có khả năng sinh amylase ngoại bào cao

Một loài B amyloliquefacien được phân lập từ tôm chua được nghiên cứu

cho thấy loài này có khả năng sinh amylase ngoại bào cao Trần Thị Ái Luyến

đã nghiên cứu thu nhận chế phẩm amylase từ chủng B Amyloliquefacien T9.

Nguồn nguyên liệu tự nhiên gồm: bột đậu nành, bột phế liệu tôm, bột sắn thô vàbột cá được sử dụng cho nghiên cứu do nguồn nguyên liệu này rẻ tiền, dễ kiếm

và có thể thay thế một lượng môi trường tương ứng với các thành phần dinhdưỡng trong môi trường nuôi cấy sinh enzyme Kết quả cho thấy: bột phế liệutôm và bột sắn thô là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho sự sinh tổng hợp amylasecao và đạt hiệu quả kinh tế nhất Thời điểm thu nhận ezyme đạt cực đại và điềukiện nuôi cấy thích hợp là: 32 giờ, ở nhiệt độ 40oC, pH là 6,5 Nghiên cứu cũng

xác định một số tính chất của chế phẩm amylase thu được khi nuôi B amyloliquefacien T9 ở môi trường tự nhiên: khoảng nhiệt độ thích hợp cho

amylase hoạt động là 40÷70oC trong đó nhiệt độ tối thích là 50oC; khoảng pHthích hợp là 5,0÷7,0 trong đó pH tối thích là 7,0 [8]

Khi thực hiện đề tài “nghiên cứu thu nhận và xác định một số tính chất chế

phẩm amylase ngoại bào từ chủng Bacillus amyloliquefacien R20 phân lập từ

ruột cá nục”, tác giả Hoàng Thị Thúy đã xác định được môi trường thích hợp để

nuôi cấy chủng B amyloliquefacien R20 phân lập từ ruột cá nục sinh tổng hợp

amylase ngoại bào cao: Môi trường cơ bản có bổ sung thêm 0,5% tinh bột hòatan, pH ban đầu thích hợp là 7, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 40 oC, thu nhậnenzyme sau 24 giờ nuôi cấy là thích hợp nhất [13]

 Khả năng sinh protease của B amyloliquefaciens

Bên cạnh khả năng sinh amylase ngoại bào, B amyloliquefaciens cũng có

khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào cao Năm 2010, Võ Văn Quốc Bảo

và Đỗ Thị Bích Thủy đã nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh

tổng hợp amylase ngoại bào từ chủng B amyloliquefacien N1 phân lập từ nem

chua Huế Nội dung nghiên cứu bao gồm ảnh hưởng của thành phần môi trường,

pH ban đầu, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp amylase

ngoại bào bởi B amyloliquefacien N1 Kết quả cho thấy: thành phần môi trường

nuôi cấy thích hợp để chủng này có khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào

cao bao gồm: 1% peptone, 0,3% cao thịt, 0,5% NaCl và 0,25% tinh bột hòa tan

pH ban đầu thích hợp là 6,0, nhiệt độ nuôi cấy là 40oC Thời gian nuôi cấy đểthu nhận enzyme cao nhất các điều kiện thích hợp ở trên là 24 giờ [2]

Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là kiềm tính và trung tính được

sản xuất từ vi sinh vật thuộc chi Bacillus Trong đó, có hai loài đang nghiên cứu là: B subtilis và B amyloliquefaciens B amyloliquefaciens có khả năng sinh cả protease ngoại bào mang tính kiềm đó là subtilisin (gồm 2 loại: subtilisin carlberg và subtilisin BPN) [14].

Từ kết quả của các đề tài nghiên cứu trên cho thấy: hoạt độ protease sinh

ra bởi B amyloliquefaciens đạt giá trị cao trong khoảng pH từ 6 đến 8, nhiệt độ

nuôi cấy thích hợp là từ 30 đến 40oC

2.4.4 Giới thiệu về Bacillus amyloliquefacien N1 (B amyloliquefacien N1)

Bacillus amyloliquefacien N1 là vi khuẩn được phân lập từ sản phẩm nem

chua ở Huế Loài này có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cao, đặc biệt

là amylase và protease ngoại bào

Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường thích hợp để thu nhận chế phẩm

protease ngoại bào từ chủng B amyloliquefacien N1 của Đỗ Thị Bích Thủy là:

môi trường cơ bản và 0,75% tinh bột hòa tan, pH nuôi cấy ban đầu thích hợpnhất là 8 ở nhiệt độ nuôi cấy ban đầu là 35 oC Thời gian thích hợp để thu nhậnenzyme là sau 32 giờ nuôi cấy [16]

Nghiên cứu của Võ Mai Diễm (2010) thì cho kết quả rằng: môi trường

thích hợp để nuôi cấy chủng B amyloliquefacien N1 sinh amylase ngoại bào cao

là môi trường cơ bản có bổ sung thêm 0,25% tinh bột hòa tan Khi nuôi cấytrong môi trường cơ bản có bổ sung 0,25 tinh bột hòa tan và điều chỉnh pH banđầu là 6, nhiệt độ nuôi cấy là 40oC và thời gian thích hợp để thu nhận enzymeamylase là 24 giờ [3]

Hình ảnh khuẩn lạc B amyloliquefacien N1 sau 24 giờ và 48 giờ trên môi

trường thạch cơ bản:

Hình 2.8 Hình ảnh khuẩn lạc B amyloliquefacien N1sau 24 giờ nuôi cấy

trên thạch cơ bản

Hình 2.9 Hình ảnh khuẩn lạc B amyloliquefacien N1 sau 48 giờ nuôi cấy

trên thạch cơ bản

Canh trường vi khuẩn trong

bã đậu nành

10 gam

10 ml

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

+ Bã đậu nành được cung cấp từ nhà máy sữa đậu nành Việt Nam (Vinasoy)thuộc Công ty cổ phần đường Quảng Ngãi Kết quả phân tích các thành phần (độ

ẩm, đường khử, protein) trong bã đậu nành do nhà máy cung cấp:

- Protein thô (protein toàn phần): 4,252%

3.2 Nội dung nghiên cứu

+ Khảo sát tạo ra chế phẩm vi sinh Bacillus sp (gồm chế phẩm B subtilis DC5 và B amyloliquefacien N1) trong bã đậu nành.

+ Nghiên cứu xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh Bacillus sp thu được

nhằm xác định:

- Tỷ lệ phối trộn thích hợp của chế phẩm B subtilis DC5 và chế phẩm

B amyloliquefacien N1 để xử lý bã đậu nành không tiệt trùng.

- Hoạt độ enzyme còn lại, hàm lượng đường khử (%), hàm lượng nitơ

formol sinh ra trong bã đậu nành đã xử lý bằng chế phẩm

- Nhiệt độ ủ thích hợp cho từng chế phẩm để đạt hiệu quả xử lý cao nhất.

+ Xây dựng quy trình xử lý bã đậu nành bởi chế phẩm vi sinh Bacillus sp (B subtilis DC5 và B amyloliquefacien N1) từ các kết quả đã khảo sát được.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp hóa sinh

3.3.1.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme amylase và protease

Để thu được enzyme ngoại bào mà vi khuẩn sinh ra trong BĐN trong quátrình nuôi cấy (hoặc còn lại sau khi xử lý BĐN) chúng tôi tiến hành các thao táctheo sơ đồ hình 3.1:

30

Ly tâm thu dịch(4000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút)

Bã đậu nành sau khi nuôi cấy (hoặc mẫu sau khi xử lý bởi chế phẩm

Bacillus sp.) được trộn đều và lấy ra 10 gam

Chuẩn bị các ống fancol sạch và đệm phosphate pH= 7,4 Cân đúng 10 gam

bã vào ống fancol, cho 10 ml đệm vào và votex đều Tiến hành ly tâm thu dịch ởchế độ 4000 vòng/phút trong 5 phút , 4oC Dịch ly tâm được bảo quản lạnh 4oCtrước khi xác định hoạt độ các enzyme

 Xác định hoạt độ amylase bằng phương pháp Bernfield [26]

- Nguyên tắc:

Dùng dung dịch tinh bột làm cơ chất để xác định hoạt độ thủy phân củaenzyme amylase, trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màuvới thuốc thử tạo màu Dinitrosalisilic 1% Độ hấp thụ ánh sáng (OD) được đotrên máy quang phổ, ở bước sóng 540 nm Dựa vào đường chuẩn maltose (phầnphụ lục) để tính sản phẩm tạo thành dưới tác dụng của enzyme

- Hóa chất:

+ Dinitrosalisilic 1% (hòa tan 1g acid 3,5-dinitrosalisilic trong 20ml

NaOH 2N và 50ml nước cất, cho thêm 30g kalinatri tactrat và dẫn nước đến100ml)

+ Dung dịch tinh bột 1% (hòa tan 1g tinh bột và 35 mg NaCl trong 60mldịch đệm phosphate (pH= 7), đun sôi cho đến tan, để nguội và dẫn đến 100ml)

- Tiến hành:

+ Hỗn hợp phản ứng gồm 0,1 ml tinh bột 1% và 0,1ml dung dịch enzyme.+ Hỗn hợp phản ứng được ủ 10 phút ở 30oC

μmol maltose mol maltose

t v

+ Tiếp tục cho vào hỗn hợp trên 0,2 ml dung dịch 1% DNS và ủ 10 phúttrong nước sôi Sau đó, ủ 10 phút trong nước đá Bổ sung 2 ml nước cất vào hỗnhợp và so màu ở 540 nm

Tiến hành làm mẫu trắng song song với mẫu chuẩn bằng cách vô hoạtenzyme bởi nhiệt (đun trong nước sôi 10 phút) và DNS 1% trước khi tiến hànhcác bước tiếp theo như với mẫu thí nghiệm

Lượng đường khử tạo thành được xác định dựa vào đường chuẩn maltose.Một đơn vị hoạt độ α-amylase được xác định là lượng μmol maltose tạo thànhmol maltose tạo thànhbởi 1 ml dịch enzyme trong thời gian 1 phút ở 30C

Đơn vị hoạt độ protease (HP) là lượng enzyme trong một phút ở 30oCchuyển hoá được một lượng casein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong TCAcho phản ứng màu với thuốc thử Folin tương đương với 1µmol tyrosin

- Tiến hành:

Thực hiện phản ứng thuỷ phân: chuẩn bị 2 eppedorf sạch trong đó 1eppendorf kiểm tra và 1 eppendorf thí nghiệm Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.Trước khi tiến hành phản ứng thuỷ phân thì dung dịch cơ chất là casein và dungdịch enzyme đều phải được ủ ở nhiệt độ 30oC

Đối với ống thí nghiệm:

Bã đậu nành sau khi xử lý bởi chế phẩm Bacillus

5 gam

50 ml

+ Cho vào mỗi ống 350µl dung dịch casein ở 30oC

+ Tiếp tục cho thêm 175µl dung dịch enzyme ở 30oC vào ống đã có casein

và giữ ở 300C trong thời gian 10 phút để phản ứng thuỷ phân xảy ra

+ Kết thúc phản ứng bằng cách cho 875µl dung dịch acid tricloacetic 5%vào để bất hoạt enzyme và kết tủa cơ chất không được thuỷ phân, lắc đều

+ Để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 15 phút

+ Ly tâm tách kết tủa và thu dung dịch trong suốt Dung dịch thu đượcdùng để làm phản ứng màu với thuốc thử Folin 0,2 N

Đối với ống kiểm tra:

+ Cho 175µl dung dịch enzyme ở 30oC vào ống

+ Cho 875µl dung dịch tricloacetic 5% vào, lắc đều để bất hoạt enzyme.+ Tiếp tục cho vào ống 350µl dung dịch casein ở 30oC giữ trong thời gian

10 phút

+ Lọc thu dịch trong để làm phản ứng màu với thuốc thử Folin 0,2 N

Phản ứng tạo màu:

+ Cho 0,5 ml dịch lọc vào ống nghiệm

+ Tiếp tục cho 2 ml Na2CO3 6%, lắc đều

+ Cho thêm 0,5 ml thuốc thử Folin 0,2N lắc đều

Lắc đều

Lọc thu dịchĐịnh mức lên 100 ml bằng

Hình 3.2 Sơ đồ thu nhận dịch để định lượng hàm lượng đường khử và nitơ formol

Bã đậu nành sau khi xử lý bằng chế phẩm Bacillus được trộn đều Cân

chính xác 5 gam bã cho vào bình tam giác 100 ml, thêm 50 ml nước cất nóng75÷80oC và lắc đều Sau đó, lọc thu dịch và định mức lên 100 ml bằng nước cất.Lắc đều dịch thu được rồi lấy 20 ml dịch đó để định lượng hàm lượng nitơformol bằng phương pháp chuẩn độ formol

Lượng dịch còn lại được xử lý bằng chì acetate 30% và Na2SO4 10% để thudịch trong rồi xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS

 Định lượng đường khử bằng phương pháp quang phổ so màu (phương pháp DNS) [5]

Nguyên tắc:

Phương pháp dựa trên cơ sơ phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốcthử Dinitrosalisilic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận vớinồng độ đường khử trong phạm vi nhất định So màu ở bước sóng 540 nm Dựavào đồ thị đường chuẩn glucose (phần phụ lục) tinh khiết với thuốc thử DNS sẽtính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS:

Acid dinitrosalysilic 3-amino, 5-ditrosalisilic

Tiến hành:

+ Chuẩn bị mẫu thí nghiệm:

- Cân 5 gam bã đậu nành cho vào bình tam giác 100ml

- Cho 50ml nước cất nóng (75÷80 oC) vào bình tam giác chứa bã đậu nành

và lắc mạnh trong 5 phút

- Lọc tách dịch và loại bã.

- Dịch lọc được đưa đi khử tạp chất bằng chì acetat 30%.

- Kết tủa lượng chì thừa bằng Na2SO4

- Định mức đến 100ml, lắc đều và lọc qua giấy lọc vào bình sạch Dịch lọc

thu được là mẫu phân tích đường khử

+ Dựng đường chuẩn glucose và tiến hành phản ứng (phần phụ lục)

Khi nhóm amin của axit amin phản ứng với nhóm aldehyd củaformandehyde sẽ tạo thành metylen

Kết quả phản ứng: nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó Nhóm carboxyltrong axit amin tồn tại ở dạng metylen không bị cản trở và có thể chuẩn độ

Số nhóm carboxyl tự do bằng số nhóm amin liên kết với formandehyd Khichuẩn độ nhóm carboxyl thì xác định được nhóm amin Vì vậy, cho phép địnhlượng được lượng axit amin có trong dung dịch nghiên cứu.

Tính kết quả:

Ta có:

1ml NaOH 0,1N tương ứng trung hòa 1,4 mg N2 nên: mg N = ( A – B).1,4Trong đó:

A: Số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ bình thí nghiệm

B: Số ml NaOH 0,1N sử dụng để chuẩn độ bình kiểm tra

3.3.2 Phương pháp vi sinh

3.3.2.1 Nuôi cấy tăng sinh

Mục đích: Nuôi cấy tăng sinh nhằm làm giàu số lượng tế bào vi khuẩn Tiến hành:

Dùng pipetman hút 100 µl dịch ở ống giống gốc cho vào eppendorf có chứa

900 µl môi trường cơ bản (Môi trường cơ bản gồm: 1% peptone, 0,3% cao thịt,

Chủng gốc

Cấy truyền trên đĩa thạch (nuôi ở 37oC, 24

giờ)

Ly tâm (4000 vòng/phút, 15 phút)Nuôi lắc (140 vòng/phút, 37oC, 24 giờ)

Sinh khối vi khuẩn

0,5% NaCl) Sau đó, đưa các ống eppendorf vào tủ ấm nuôi cấy ở 37 oC trong

24 giờ

3.3.2.2 Cấy truyền trên đĩa thạch

Từ các ống giống đã tăng sinh, hút một ít dịch bằng pipetman rồi nhỏ mộtgiọt lên đĩa thạch cơ bản Dùng que cấy ria đã tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn(để nguội) ria giọt dịch ra đĩa thạch Các đĩa thạch đã ria được gói trong giấybáo và nuôi ở tủ ấm 37 oC trong 24 giờ

Thạch cơ bản là môi trường cơ bản có bổ sung thêm 15÷20g agar-agartrong 1 lít môi trường cơ bản

3.3.2.3 Nuôi cấy và thu nhận sinh khối

Tiến hành quan sát khuẩn lạc mọc ở đĩa thạch, các đĩa mọc khuẩn lạc cần

xem xét kĩ hình thái để chọn đĩa có khuẩn lạc thuần của hai giống B subtilis DC5 và B amyloliquefacien N1

Sơ đồ nuôi cấy và thu nhận sinh khối của hai chủng vi khuẩn B subtilis DC5 và B amyloliquefacien N1 được thể hiện qua sơ đồ hình 3.3:

Hình 3.3 Sơ đồ quá trình nuôi cấy và thu nhận sinh khối vi khuẩn B subtilis

DC5 và B amyloliquefacien N1

Lấy que ria đã tiệt trùng, bắt khuẩn lạc mọc ở đĩa thạch cho vào bình tamgiác 100ml đã chứa 40ml môi trường cơ bản Nuôi lắc vi khuẩn đã bắt vàobình tam giác với chế độ 140 vòng/phút ở 37 oC trong 24 giờ để phát triển tếbào Sau 24 giờ nuôi cấy, đổ dịch nuôi cấy vào các ống fancol đã tiệt trùng rồi

ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút Tế bào vi khuẩn sau khi ly tâm sẽ nằm

Sinh khối vi khuẩn

Tái huyền phù Nước muối sinh lý-peptone

Đo OD

Ly tâm (4000 vòng/phút, 15 phút)

Tái huyền phù lần 2 Nước muối sinh lý-peptone

ở phía đáy ống fancol, nhẹ nhàng bỏ phần dịch nổi để tránh khuấy động sinhkhối phía dưới

3.3.2.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang OD

Hình 3.4 Sơ đồ quá trình xác định mật độ tế bào vi khuẩn

Sinh khối vi khuẩn thu được sau khi ly tâm được tái huyền phù bằng dungdịch nước muối sinh lý-peptone (1% peptone, 0,85% NaCl) Dịch chứa sinhkhối sau khi tái huyền phù lần 1 tiến hành ly tâm lần 2 trong 15 phút, 4000vòng/phút Sau khi ly tâm lần 2, thu nhận sinh khối và bỏ phần dịch lỏng Chodịch nước muối sinh lý-peptone vào để tái huyền phù lần 2 rồi đưa đi đo mật độquang OD ở bước sóng 600nm, mẫu trắng (mẫu blank) là dung dịch nước muốisinh lý-pepetone

Nguyên tắc của phương pháp này là: khi ánh sáng truyền qua môi trườnglỏng có các hạt rắn lơ lững (ở đây là tế bào vi khuẩn) sẽ bị tán xạ trở lại Ngoài

ra, chính bản thân chất lỏng cũng hấp thụ một phần ánh sáng truyền vào Do đó,cường độ ánh sáng đi qua chất lỏng cũng bị ảnh hưởng bởi bản chất của môitrường chất lỏng đó Lượng ánh sáng bị hấp thụ tỉ lệ tuyến tính với mật độ tế bàotheo định luật Lamber-Beer Theo định luật Lamber-Beer thì điều kiện đúng củađịnh luật là mức OD thấp hơn hoặc bằng 1, nên trong quá trình đo mật độ tế bàothì cần pha loãng để điều chỉnh OD thấp hơn hoặc bằng 1 OD thực sự sẽ đượctính theo hệ số pha loãng của mẫu OD=1 tương ứng với mật độ vi khuẩn 8.108

tế bào/ml

3.3.2.5 Xác định mật độ tế bào sống bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch (phương pháp Koch) [10]

Nguyên tắc của phương pháp là: cấy một thể tích xác định huyền phù cầnnghiên cứu lên môi trường đặc trưng (ở đây chúng tôi sử dụng môi trường thạch

cơ bản) trên đĩa petri Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩnlạc mọc lên sau thời gian nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc được xem là kết quả của sựphát triển của một tế bào

Tiến hành lấy 1 gam mẫu BĐN sau khi nuôi cấy các chủng Bacillus ở các

thời gian khảo sát là 16 giờ, 20 giờ và 24 giờ Cho mẫu vào ống fancol đã chứa

9 ml dung dịch nước muối sinh lý ta được mẫu đã pha loãng 10 lần (10-1) Lắcđều, dùng pipetman hút 1ml dung từ mẫu đó tiếp tục đưa sang ống fancol kháccũng chứa 9ml nước muối sinh lý, ta được mẫu đã pha loãng 100 lần (10-2) Tiếptục pha loãng như trên đến nồng độ pha loãng 10-12 Lắc đều và hút 0,05 ml dungdịch đã pha loãng đến nồng độ pha loãng 10-12, cho lên đĩa thạch cơ bản đã đổsẵn Dùng que trang, trang đều dịch trên bề mặt đĩa thạch

Nuôi cấy ở nhiệt độ 37 oC trong 24 giờ, sau đó đếm số khuẩn lạc mọc trênđĩa thạch Số lượng tế bào trong 1 gam mẫu được tính theo công thức sau:

N (cfu/g) =  1 1 i i

C



Trong đó: N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1 gam mẫu

C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri (số khuẩn lạcnằm trong khoảng 25÷250 khuẩn lạc/đĩa)

ni: số hộp đĩa cấy tại độ pha loãng thứ iv: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào mỗi đĩa

di: hệ số pha loãng tương ứng

Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc sau khi trang ra đĩa 24 giờ của chủng B.

amyloliquefacien N1

Tế bào Bacillus sp.

Phối trộn

Nuôi cấy ở 37oC với thời gian khác nhau(16 giờ, 20 giờ và 24 giờ)

Sơ đồ quy trình khảo sát thu nhận chế phẩm Bacillus sp trong môi trường

bã đậu nành tiệt trùng được thể hiện qua hình 3.7:

Hình 3.7 Sơ đồ quy trình khảo sát thu nhận chế phẩm Bacillus

trong môi trường bã đậu nành tiệt trùng

Bã đậu nành làm nguội sau khi tiệt trùng được cấy tế bào vi khuẩn với mật

độ là: 107 cfu/g đối với chủng B amyloliquefacien N1, 106 cfu/g đối với chủng