Từ giá trị OD thu được, dựa vào đường chuẩn maltose (ở phần phụ lục) để biết nồng độ maltose.
Đọc lượng phân đoạn khử được hình thành từ đường chuẩn dưới dạng μmol maltose. Một đơn vị hoạt độ α-amylase được xác định là lượng μmol maltose tạo thành bởi 1ml dịch enzyme trong thời gian một phút ở nhiệt độ 30oC.
μmol maltose t .v
Hoạt độ = ( U/ml)
Trong đó: t: thời gian phản ứng (10 phút) v: thể tích enzyme (0,1ml)
Xác định hoạt độ prtotease bằng phương pháp Anson cải tiến [22], [23] - Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự thuỷ phân casein bởi protease. Sau đó bất hoạt enzyme và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng acid tricloacetic (TCA) 5% . Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết quả phân tích dựa vào đường chuẩn tyrosin (phần phụ lục).
Đơn vị hoạt độ protease (HP) là lượng enzyme trong một phút ở 30oC chuyển hoá được một lượng casein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong TCA cho phản ứng màu với thuốc thử Folin tương đương với 1µmol tyrosin.
- Tiến hành:
Thực hiện phản ứng thuỷ phân: chuẩn bị 2 eppedorf sạch trong đó 1 eppendorf kiểm tra và 1 eppendorf thí nghiệm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Trước khi tiến hành phản ứng thuỷ phân thì dung dịch cơ chất là casein và dung dịch enzyme đều phải được ủ ở nhiệt độ 30oC.
Đối với ống thí nghiệm:
+ Cho vào mỗi ống 350µl dung dịch casein ở 30oC.
+ Tiếp tục cho thêm 175µl dung dịch enzyme ở 30oC vào ống đã có casein và giữ ở 300C trong thời gian 10 phút để phản ứng thuỷ phân xảy ra.
+ Kết thúc phản ứng bằng cách cho 875µl dung dịch acid tricloacetic 5% vào để bất hoạt enzyme và kết tủa cơ chất không được thuỷ phân, lắc đều.
+ Để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 15 phút.
+ Ly tâm tách kết tủa và thu dung dịch trong suốt. Dung dịch thu được dùng để làm phản ứng màu với thuốc thử Folin 0,2 N.
Đối với ống kiểm tra:
+ Cho 175µl dung dịch enzyme ở 30oC vào ống.
+ Cho 875µl dung dịch tricloacetic 5% vào, lắc đều để bất hoạt enzyme. + Tiếp tục cho vào ống 350µl dung dịch casein ở 30oC giữ trong thời gian 10 phút.
+ Lọc thu dịch trong để làm phản ứng màu với thuốc thử Folin 0,2 N.
Phản ứng tạo màu:
+ Cho 0,5 ml dịch lọc vào ống nghiệm. + Tiếp tục cho 2 ml Na2CO3 6%, lắc đều.
+ Cho thêm 0,5 ml thuốc thử Folin 0,2N lắc đều. + Giữ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
+ So màu trên máy quang phổ bước sóng 750 nm.
- Tính kết quả:
Từ giá trị OD đo được, dựa vào phương trình đường chuẩn tyrosin (phần phụ lục) để tính lượng µmol tyrosin tương ứng.
Tính số đơn vị hoạt động proteolitic của 1ml dung dịch enzyme theo công thức:
HP/ml = (µmol tyrosine 8)/t
Trong đó:
HP/ml: hoạt độ chung
t: thời gian để enzyme tác dụng với cơ chất (10 phút).
3.3.1.2. Định lượng hàm lượng đường khử sinh ra trong BĐN sau khi xử lý bởi chế phẩm vi sinh Bacillus sp.
• Sơ đồ thu nhận dịch để định lượng hàm lượng đường khử và định lượng hàm lượng nitơ formol sinh ra trong BĐN đã xử lý bằng chế phẩm vi sinh:
Bã đậu nành sau khi xử lý bởi chế phẩm Bacillus 5 gam Lắc đều Lọc thu dịch Định mức lên 100 ml bằng nước cất Nước cất (75÷80oC) Xác định đường khử và Nitơ formol 50 ml
Hình 3.2. Sơ đồ thu nhận dịch để định lượng hàm lượng đường khử và nitơ formol Bã đậu nành sau khi xử lý bằng chế phẩm Bacillus được trộn đều. Cân
chính xác 5 gam bã cho vào bình tam giác 100 ml, thêm 50 ml nước cất nóng 75÷80oC và lắc đều. Sau đó, lọc thu dịch và định mức lên 100 ml bằng nước cất. Lắc đều dịch thu được rồi lấy 20 ml dịch đó để định lượng hàm lượng nitơ formol bằng phương pháp chuẩn độ formol.
Lượng dịch còn lại được xử lý bằng chì acetate 30% và Na2SO4 10% để thu dịch trong rồi xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS.
Định lượng đường khử bằng phương pháp quang phổ so màu (phương pháp DNS) [5]
Phương pháp dựa trên cơ sơ phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử Dinitrosalisilic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong phạm vi nhất định. So màu ở bước sóng 540 nm. Dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose (phần phụ lục) tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.
Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS:
Acid dinitrosalysilic 3-amino, 5-ditrosalisilic
Tiến hành:
+ Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: