- Hàm lượng đường khử trong nguyên liệu được tính theo công thức sau:
4.1.1. Khả năng sinh enzyme thủy phân
Để thu được chế phẩm Bacillus sp. (gồm 2 chủng B. subtilis DC5 và B.
amyloliquefacien N1) trong môi trường BĐN tiệt trùng, chúng tôi tiến hành
khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của hai chủng này. Trong đó, hai enzyme thủy phân quan trọng là amylase và protease.
Chọn thời gian khảo sát là 16 giờ, 20 giờ và 24 giờ cho hai chủng này là vì: theo nhiều kết quả nghiên cứu về B. subtilis DC5 và B. amyloliquefacien N1 thu được thời gian nuôi cấy thích hợp để thu nhận enzyme ngoại bào cao là 24 giờ và lân cận dưới 24 giờ hoạt độ enzyme sinh ra cũng rất cao, các nghiên cứu cũng chỉ ra sau 24 giờ thì hoạt độ enzyme sinh ra ở các môi trường nghiên cứu giảm xuống [2], [3], [13], [16]. Do đó, để tiến hành nghiên cứu khả năng sinh enzyme trong BĐN tiệt trùng của hai chủng Bacillus này nhằm thu nhận chế phẩm, chúng tôi nuôi cấy hai chủng vi khuẩn này trong BĐN tiệt trùng ở 3 mốc thời gian là: 16 giờ, 20 giờ và 24 giờ.
(a) (b)
Hình 4.1. Phản ứng màu xác định hoạt độ enzyme amylase (hình a) và enzyme
Kết quả nghiên cứu thu được về hoạt độ amylase và protease qua các thời gian nuôi cấy của chủng B. subtilis DC5 thể hiện ở bảng 4.1:
Bảng 4.1. Hoạt độ enzyme ngoại bào sinh ra trong bã đậu nành tiệt trùng của chủng B. subtilis DC5 qua các giờ khảo sát
Hoạt độ enzyme Mẫu khảo sát Amylase (UI/g) Protease (HP/g) 16 giờ 10,581bc 0,225c 20 giờ 22,051a 0,388a 24 giờ 10,357cb 0,330b Đối chứng 0d 0d
(Kết quả xử lý sai khác theo cột, các chữ cái khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê, Duncan’test (P< 0,05))
Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy rằng, hoạt độ enzyme amylase và protease sinh ra bởi chủng B. subtillis DC5 trong môi trường BĐN tiệt trùng tăng từ 16 giờ đến 20 giờ. Sau 20 giờ thì hoạt độ có xu hướng giảm xuống. Hoạt độ amylase và protease đạt cao nhất là ở mẫu 20 giờ (hoạt độ amylase là 22,051 UI/g và hoạt độ protease là 0,388 HP/g). Hoạt độ amylase ngoại bào sinh ra ở mẫu 20 giờ gấp 2,084 lần mẫu 16 giờ (10,581 UI/g) và gấp 2,129 lần so với mẫu 24 giờ (10,357 UI/g).
Hoạt độ protease ở 20 giờ (0,388 HP/g) cao gấp 1,724 lần so với mẫu 16 giờ (0,225HP/g) và gấp 1,176 lần so với mẫu khảo sát ở 24 giờ (0,330 HP/g).
Ở mẫu đối chứng đã được tiệt trùng và không bổ sung chủng B. subtilis DC5 nên hoạt độ enzyme đo được là 0, do không có vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào.
Theo nghiên cứu đã công bố của Phạm Trần Thùy Hương và Đỗ Thị Bích Thủy (2012) khi khảo sát thời gian sinh amylase ngoại bào cao của chủng B.
subtilis DC5 thì thời gian tối ưu để nuôi cấy là 24 giờ trong môi trường cơ bản
có bổ sung 0,25 lactose và pH ban đầu là 5. So với kết quả khảo sát của chúng tôi thì có sự sai khác về thời gian nuôi cấy. Sự sai khác này cũng dễ hiểu, vì trong môi trường khác nhau và mật độ nuôi cấy khác nhau thì khả năng sinh enzyme tốt nhất ở khoảng thời gian nuôi cấy cũng có phần khác nhau. Mật độ ban đầu đưa vào nuôi cấy sẽ tác động đến đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường đó, mật độ đưa vào quá nhỏ thì thời gian từ pha mở đầu đến pha logarit (pha luỹ tiến) kéo dài hơn. Còn mật độ nuôi cấy ban đầu lớn thì thời gian giữa hai pha này rút ngắn lại.
Qua kết quả khảo sát trên về khả năng sinh enzyme thủy phân (amylase và protease) của chủng B. subtilis DC5, thì khi nuôi cấy thu nhận chế phẩm ở 20
giờ là tốt nhất để sinh enzyme thủy phân nhằm xử lý BĐN. Do đó, chúng tôi chọn thời gian nuôi cấy là 20 giờ để thu nhận chế phẩm B. subtilis DC5 trong BĐN và xử lý BĐN không tiệt trùng.
Đối với chủng B. amyloliquefacien N1 thì hoạt độ amylase và protease qua các thời gian nuôi cấy được trình bày ở bảng 4.2:
Bảng 4.2. Hoạt độ enzyme sinh ra trong bã đậu nành tiệt trùng của chủng B. amyloliquefacien N1 qua các giờ khảo sát
Hoạt độ enzyme Mẫu khảo sát Amylase (UI/g) Protease (HP/g) 16 giờ 9,011c 0,368b 20 giờ 13,123b 0,260c 24 giờ 20,241a 0,488a Đối chứng 0d 0d
(Kết quả xử lý sai khác theo cột, các chữ cái khác nhau biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê, Duncan’test (P< 0,05))
(a) (b)
Hình 4.2. Phản ứng xác định hoạt độ của enzyme amylase (hình b) và enzyme
protease (hình b) sinh ra bởi B. amyloliquefacien N1 ở 24 giờ.
Kết quả đo hoạt độ enzyme sinh ra trong môi trường bã đậu nành của chủng B. amyloliquefacien N1 đạt được cao nhất là ở 24 giờ. Hoạt độ amylase ngoại bào sinh ra ở 24 giờ (20,241UI/g) của chủng B. amyloliquefacien N1 cao gấp 2,246 lần hoạt độ amylase ở 16 giờ (9,011 UI/g) và gấp 1,542 lần so với hoạt độ amylase ở 20 giờ (13,123 UI/g). Hoạt độ protease ở 24 giờ (0,488 HP/g) cao gấp 1,326 lần ở 16 giờ (0,368 HP/g) và cao gấp 1,877 lần ở 20 giờ (0,260 HP/g).
Kết quả về thời gian nuôi cấy của chúng tôi phù hợp với kết quả của nhiều nghiên cứu về chủng vi khuẩn này, như: nghiên cứu của Võ Mai Diễm (2010) thu được khả năng sinh enzyme ngoại bào cao ở 24 giờ nuôi cấy chủng B.
amyloliquefacien N1 trong môi trường cơ bản tối ưu (môi trường cơ bản có
thêm 0,25% tinh bột). Nghiên cứu của Hoàng Thị Thúy (2010) về thời gian nuôi cấy để chủng B. amyloliquefacien N1 sinh enzyme ngoại bào cao thu được cũng trong 24 giờ ở môi trường cơ bản có pH ban đầu là 7. Kết quả nghiên cứu của Võ Văn Quốc Bảo và Đỗ Thị Bích Thủy về chủng này cũng cho kết quả sinh enzyme ngoại bào cao là ở 24 giờ [2], [3], [13].
Với kết quả thu được như trên của chủng B. amyloliquefacien N1 thì chúng tôi chọn thời gian nuôi cấy thu nhận chế phẩm vi sinh B. amyloliquefacien N1 và xử lý BĐN không tiệt trùng là 24 giờ trong nghiên cứu tiếp theo.