Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm aspergillus oryzae N2 (koji tương) nuôi cấy trên môi trường bán rắn (cám gạo) trong quy trình sản xuất nước tương

Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 (koji tương) nuôi cấy trên môi trường bán rắn (cámgạo) trong quy trình sản xuất nước tươngNghiên cứu ứng dụng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 (koji tương) nuôi cấy trên môi trường bán rắn (cámgạo) trong quy trình sản xuất nước tươngNghiên cứu ứng dụng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 (koji tương) nuôi cấy trên môi trường bán rắn (cámgạo) trong quy trình sản xuất nước tươngchế phẩm Aspergillus oryzae N2 (koji tương) nuôi cấy trên môi trường bán rắn (cámgạo) trong quy trình sản xuất nước tươngNghiên cứu ứng dụng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 (koji tương) nuôi cấy trên môi trường bán rắn (cámgạo) trong quy trình sản xuất nước tương

MỤC LỤC

1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

3-MCPD : 3-monochloropropane-1,2-diol

A.oryzae : Aspergillus oryzae

FAO : Food and Agriculture Organization EMB : Eosin Methylene Blue

PCA : Plate Count Agar

EC : European Conmunity LSB : Least Significant Bit BGBL : Brilliant Green Bile Lactose SPSS : Statistical Package to the Social Sciences g/l : gam/lít

DANH MỤC BẢNG

3 3

DANH MỤC HÌNH

PHẦN 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nước tương là loại nước chấm chế biến từ đậu nành được tiêu dùng rộngrãi trên thị trường từ lâu đời và đã trở thành một loại nước chấm không thể thiếutrên thị trường Việt Nam Nguyên liệu chính để sản xuất nước tương là đậu nànhrất giàu đạm thực vật nên tốt cho sức khỏe người tiêu dùng [1]

Nước tương lên men có nguồn gốc từ thực vật là dịch thủy phân nguồnđạm có trong nguyên liệu Tác nhân thủy phân có thể là enzyme do vi sinh vật tiết

ra, có thể là acid như HCl (nước chấm hóa giải) Nước chấm lên men thuần túy lànước chấm cổ truyền ở các nước Á Châu Tuy nhiên thời gian thủy phân kéo dàihàng tháng, giá thành cao Vì vậy trong một thời gian dài nước tương được sảnxuất ở Việt Nam là nước chấm hóa giải Gần đây người ta phát hiện trong nướctương hóa giải bằng HCl có chứa nhiều 3-MCPD (3-monochloropropane-1,2-diol)

có khả năng gây ung thư, vì vậy có xu hướng quay trở về công nghệ truyền thống.Một số quy trình sản xuất nước chấm an toàn (về 3-MCPD) được sản xuất bằngcách kết hợp lên men và hóa giải đã được triển khai [7]

Một trong những tính năng đặc biệt của việc sử dụng Aspergillus oryzae

trong quá trình lên men truyền thống của Nhật Bản là việc sử dụng môi trườngnuôi cấy ở trạng thái rắn (hạt gạo, đậu nành, cám lúa mì) Quá trình lên men này

có nguồn gốc từ 3000-2000 năm trước tại Trung Quốc Công nghệ này đã đượcnhập khẩu vào Nhật Bản từ thế kỷ 13-15 [32]

Nhật Bản là một trong những quốc gia có những sản phẩm lên men truyềnthống lâu đời nhất, ứng dụng trong các sản phẩm đó là nhờ sự phát hiện ra loạimốc “koji” ngay từ rất sớm “Koji” là mốc cấy trên gạo, lúa mạch hoặc đậunành, nó hoạt động như một chất mồi cho quá trình lên men Truyền thống này

đã được thực hiện ít nhất 500 năm ở Nhật Bản và tạo ra nhiều sản phẩm có tiếngnhư rượu sake, tương miso, Tuy nhiên việc ứng dụng koji trong chế biến thựcphẩm vẫn còn lạ lẫm với Việt Nam và nhiều nước trên thế giới [44]

Xuất phát từ những thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm Aspergillus oryzae N2 (koji tương)

nuôi cấy trên môi trường bán rắn (cám-gạo) trong quy trình sản xuất nước tương”

PHẦN 2 TỔNG QUAN 2.1 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Đậu nành

2.1.1.1 Đặc điểm của đậu nành

Đậu nành là một cây trồng cạn ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Khó cóthể tìm được một loại cây trồng nào có giá trị kinh tế như cây đậu nành Sảnphẩm của nó làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệucho công nghiệp và là cây cải tạo đất tốt Vì thế cây đậu nành còn được gọi là

“ông hoàng của các loại cây họ đậu” [3]

Cây đậu nành có xuất xứ từ Trung Quốc, và được biết đến vào khoảng năm1700-1100 trước công nguyên hoặc sớm hơn rồi dần được du nhập vào Triều Tiên,Nhật Bản, Malayxia, các nước Đông Dương, trong đó có nước ta [14], [15]

Đậu nành tên khoa học là Glycine max thuộc họ đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidae) có nguồn gốc từ cây đậu nành hoang dại (Glycine ussurensis)

dạng thân leo, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới [29]

5 5

protein trong đậu nành còn cao hơn cả thịt, cá và cao gấp hai lần so với protein

có trong các loại đậu đỗ khác Ngoài ra, đậu nành còn là vị thuốc để chữa bệnh,đặc biệt là đậu nành hạt đen, có tác dụng tốt cho tim, thận, dạ dày và ruột, là sựlựa chọn cho những người bị bệnh đái tháo đường, thấp khớp,… Bên cạnh đó,

bã từ bột đậu nành đã ép lấy dầu có thể dùng làm nguyên liệu để chế biến thức

ăn tinh, hỗn hợp giàu đạm cho gia súc, gia cầm Mặt khác, thân lá của cây đậunành cũng có thể dùng làm thức ăn cho gia súc và gia cầm [15]

Đậu nành là cây lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất của thế giới,đứng hàng thứ tư sau cây lúa nì, lúa nước và ngô Do khả năng thích nghi khárộng nên đậu nành đã được trồng ở khắp năm châu, nhưng tập trung nhiều nhất

là châu Mỹ khoảng 73%, tiếp đến là châu Á khoảng 23%, Sản lượng đậu nànhhàng năm trên thế giới đạt khoảng 103-114 triệu tấn (FAO, 1992) Ở nước ta,diện tích gieo trồng đậu nành chỉ mới chiếm một tỷ lệ nhỏ trong tổng diện tíchgieo trồng (1,5-1,6%), và tập trung chủ yếu ở bốn vùng: các tỉnh miền núi vàtrung du phía Bắc, vùng đồng bằng sông Hồng, miền Đông Nam Bộ, vùng đồngbằng sông Cửu Long [7], [15]

2.1.1.2 Thành phần hóa học của đậu nành

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của hạt đậu nành [7]

Các thành

phần của hạt

đậu nành

Thành phần, % trọng lượng khô Protein

(%)

Lipid (%)

Tro (%)

Carbohydrat (%)

2.1.1.3 Đặc trưng cơ bản của các thành phần hóa học trong đậu nành

Đậu nành có thành phần dinh dưỡng cao, đậu nành là thức ăn vô cùng bổdưỡng Hàm lượng protein trung bình 35-45% và cao gấp đôi so với các loại đậu

khác Ngoài ra, trong hạt đậu nành còn có nhiều vitamin B hơn bất cứ loại đậunào, đậu nành cũng chứa nhiều vitamin A, D và các chất khoáng,… [4], [11].

• Protein

Đậu nành có nhiều protein hơn thịt, nhiều canxi hơn sữa bò và nhiều lecithinhơn trứng, các acid amin cần thiết mà cơ thể không tạo ra được cũng đều có đủtrong đậu nành Protein của đậu nành dễ tiêu hóa, không có các thành phần tạocholesterol, không có các dạng acid uric [3]

Ngày nay, người ta còn phát hiện thêm trong đậu nành có chứa chất lecithin,

có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, tăng thêm trí nhớ và tái sinh các mô, làmcứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể [4]

Trong thành phần protein đậu nành chủ yếu là globulin (85-95%) và gồm cácacid amin không thay thế như: tryptophan, isoleucine, leucine, phenylalanine,…Trong đó, hàm lượng của các acid amin chứa lưu huỳnh như: methionine,cystine,… của đậu nành rất gần với hàm lượng các chất này của trứng Hàmlượng của casein, đặc biệt là lizin rất cao [14]

Bảng 2.2 Thành phần các acid amin không thay thế trong đậu nành [29]

• Vitamin và khoáng chất

Trong hạt đậu nành chứa khá nhiều các loại vitamin, cả tan trong dầu và tantrong nước, đặc biệt, hàm lượng của vitamin B2 và B1 Ngoài ra, trong đậu nànhcòn có các loại vitamin như: PP, A, E, K, C, D,…[13]

Trong hạt đậu nành khô chứa 5% khoáng, trong số những nguyên tố khoáng đalượng hiện diện trong đậu nành điển hình nhất là muối của K tiếp đó tới các loạimuối khoáng của P, Mg, S, Ca, Cl, Na Hàm lượng trung bình của các nguyên tốkhoáng này nằm trong khoảng 0,2-2,1% Với những nguyên tố khoáng vi lượng thì

7 7

gồm có: Cu, Zn, Fe, Co, Pb, I, Se, Mn, Cd,… Hàm lượng của những nguyên tốkhoáng vi lượng này dao động khoảng 0,01-140 ppm [3], [15].

Bảng 2.3 Thành phần vitamin trong đậu nành [7]

Thành phần chính trong carbohydrates đậu nành là nhữngoligosaccharides và những polisaccharides phức tạp, trong đó carbohydratesphức tạp chiếm khoảng 86%

Bảng 2.5 Thành phần glucid trong đậu nành [7]

2.1.2 Tổng quan về chế phẩm Aspergillus oryzae

2.1.2.1 Đặc điểm nấm mốc Aspergillus oryzae

Mốc màu hoa cau mà nhân dân ta thường dùng để làm tương là mộtloài nấm sợi có tên khoa học là Aspergillus oryzae Đây cũng chính là loài màngười Nhật dùng để đường hóa gạo khi làm rượu Sake Người nghiên cứusớm nhất về loài nấm này là một nhà khoa học Nhật Bản tên là JokichiTakamine [46]

Giống nấm mốc dùng trong sản xuất nước chấm có thể là Aspergillus

oryzae, Aspergillus soyae, Aspergillus teriol, Aspergillus niger [7].

Aspergillus oryzae sinh trưởng dạng hệ sợi, bao gồm các sợi rất mảnh chiều

ngang 5-7 mm, phân nhánh nhiều, có vách ngăn chia sợi thành nhiều tế bào [8]

Nấm mốc Aspergilus oryzae sinh ra các enzyme như: amylose, invetose,

maltose, protease có khả năng phân giải tinh bột thành đường, protein thành các

acid amin Nấm mốc Aspergillus oryzae đã được ứng dụng rộng rãi để sản xuất

các sản phẩm lên men ở Châu Á, do đó protease từ loại này có tiềm năng ứngdụng trong sản xuất nước tương và các sản phẩm khác [36]

Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất

nước tương theo phương pháp vi sinh vật Trong công nghiệp người ta nhângiống nấm mốc này để sản xuất tương [41]

2.1.2.2 Giới thiệu về koji tương

 Khái niệm:

Koji là một trong những thành phần quan trọng nhất được coi là giống khởiđộng để sản xuất một số thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản Tên

khoa học của Koji là Aspergillus oryzae Koji có chứa một hệ các enzyme thủy

phân được tạo thành trong nấm mốc sinh trưởng trên các cơ chất chứa tinh bột.Các enzyme này (gluco amylo, α-amyloza, proteaza) thủy phân tinh bột và

9 9

protein thành các chất có trọng lượng phân tử thấp Tùy thuộc sản phẩm cuốicùng, các chủng nấm mốc khác nhau được sử dụng để sản xuất koji như:

Aspergillus oryzae, Aspergillus awamoki, Aspergillus kawachi, Aspergillus niger, [47].

Koji không thực sự là một loại nấm men, như nhiều người nhầm tưởng Koji

là mốc Aspegillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường cám-gạo, lúa mạch

hoặc đậu nành.Ở Nhật Bản koji được nuôi cấy tự nhiên và được gọi là koji-kin

Nó được sử dụng trong chế biến các sản phẩm như: nước tương, miso, mirin vàsake [48]

 Đặc điểm:

Koji có chứa một hệ các enzyme thủy phân được tạo thành trong nấmmốc sinh trưởng trên các cơ chất chứa tinh bột Các enzyme thủy phân này(glucoamylase, α-amylase, protease) để thủy phân tinh bột và protein thànhcác chất có trọng lượng phân tử thấp Koji được nuôi cấy từ hạt gạo, hạt lúa mìhoặc đậu nành Đó là một thành phần quan trọng trong việc sản xuất của các loạithực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản như sake, miso và shoyu Cácloại mốc koji khác nhau được sử dụng để sản xuất các loại thực phẩm khác

nhau Aspergillus oryzae là nấm mốc được sử dụng để sản xuất koji rộng rãi

nhất Đối với malt sản xuất bia, mốc koji cung cấp enzyme cần thiết để phân hủycác chất nền cho quá trình lên men thực phẩm [49]

Koji đậu nành là chế phẩm Aspergillus oryzae giàu hoạt lực protease

thường được sản xuất bằng cách nuôi cấy mốc trên các cơ chất như đậu nành,ngô, gạo hay cám mì có bổ sung trấu để tăng độ thoáng khí Chế phẩm

Aspergillus oryzae được ứng dụng phổ biến trong sản xuất nước chấm lên men

từ đậu nành [23]

Koji (Aspergillus oryzae) có lẽ đã được thuần hóa ít nhất 2.000 năm trước

đây Nó được sử dụng cho các sản phẩm sake, mirin, shochu, awamori (một thứcuống Okinawa), dấm gạo, nước tương và miso Không có gì ngạc nhiên khi nóđược tuyên bố thành kokkin (nấm quốc gia) do Hiệp hội Bia của Nhật Bản vàcác gen được bảo vệ chặt chẽ cho đến năm 2005 Bên cạnh đó, nó cũng được sửdụng rộng rãi ở Trung Quốc và Hàn Quốc để lên men các thực phẩm khác nhau

Để sử dụng Koji, bào tử được trộn vào cơm trắng (khoai tây, lúa mì và đậu nànhcũng được sử dụng, tùy thuộc vào mục đích), sau đó được ủ trong một khoảngthời gian, ở một môi trường ấm áp 300C Các Koji biến tinh bột trong gạo thànhđường (một quá trình được gọi là đường hóa) và tạo thành một loạt các acid béo

và acid amin trong đó có glutamate, là cơ sở cho các "vị thứ năm," umami Hỗnhợp Koji lúa này được gọi là kome-Koji [50].

Khi koji được sử dụng trong chế biến thức ăn, protease sẽ phân hủyprotein để sản xuất acid amin bao gồm glutamate Acid amin này cho ra umami,tạo hương vị thơm ngon cho món ăn Các hương vị của umami kết hợp với thịhiếu khác vòng tạo ra hương vị của món ăn Amylase phá vỡ tinh bột để tạothành các loại đường đơn giản như glucose khi làm amazaké [51]

Mặt khác, lúa mì rang và đậu nành hấp chín đã khử chất béo thường đượcngười Nhật sử dụng để sản xuất koji Đáng chú ý, trong lúa mì rang và đậu nànhhấp chín có chứa protease và amylase có chất lượng vượt trội Nước tương koji,

có màu xanh đậm, mùi thơm, vị ngọt và hơi đắng Trong giai đoạn lên men koji,protein phá vỡ các chuỗi axit amin bằng enzyme phân giải protein, đặc biệt bởiprotease trung tính và kiềm Polysaccharides được thủy phân thànholigosaccharides, disaccharides và monosacarit, chủ yếu là do amylase của nấmmốc tiết ra, lipid cũng được thủy phân bởi các lipase có trong koji [21]

 Phân loại:

Theo hình dáng sản xuất: Koji được sản xuất ra dưới dạng bánh thì gọi

là mochi-koji, còn dưới dạng hạt thì gọi là bara-koji Quá trình sản xuất

ra koji gọi là sei-koji Nấm này còn được dùng ở Nhật Bản để sản xuất tươngNhật từ đậu nành, dạng đặc gọi là miso (soybean paste), dạng loãng gọi là shoyu(soy sauce) [52]

Theo màu sắc: Koji được phân loại với 3 dạng màu sắc khác nhau: kuro (màuđen), shiro (màu trắng) và Kii (màu vàng) Các loại koji khác nhau về màu sắc

do quá trình sản xuất được nuôi cấy bởi các loại nấm mốc khác nhau như:

Aspergillus oryzae tạo koji vàng, Aspergillus awamoki và Aspergillus niger tạo

mốc koji đen, Aspergillus kawachi tạo mốc koji trắng [54].

- Koji vàng (kii koji): đã tồn tại ở Nhật Bản nhiều năm Nó đã được sử dụng

nhiều trong sản xuất thực phẩm Kii-koji rất nhạy cảm với nhiệt độ và thích hợp với khí hậu lạnh, Kii-koji hiếm khi được sử dụng Đầu những năm 1990, việc sử dụng Kii-koji đang dần tăng lên, nhưng trên một cơ sở rất hạn chế Một loạt các

nguyên vật liệu có thể được sử dụng kết hợp với Kii-koji: gạo (kome), khoai

lang, lúa mạch (mugi) Shochu sản xuất với Kii-koji thường có màu sắc đẹp và

mùi trái cây [53]

11 1

1

Hình 2.2 Koji vàng (kii koji) [53]

- Koji đen (kuro koji): Trong lịch sử, kuro - koji có nguồn gốc ở Okinawa để sảnxuất rượu Awamori, ngày nay nó vẫn được sử dụng hầu hết để sản xuấtAwamori Kuro-koji bền hơn Kii koji màu vàng, phù hợp với khí hậu cận nhiệtđới Mặc dù có thể tạo ra hương vị đặc biệt, hầu hết các nhà sản xuất cuối cùngcũng loại bỏ kuro - koji vì lý do vệ sinh Kuro-koji kết hợp phổ biến với khoailang, shochu và Awamori [53]

Hình 2.3 Koji đen (kuro koji)[53]

- Koji trắng (shiro koji): Shiro koji được phát hiện vào năm 1923 khi GenichiroKawachi (người đã giới thiệu kuro-koji ) chứng kiến một sự biến đổi trong kuro-koji Điều này dẫn đến việc nghiên cứu sâu hơn cho đến khi ông có thể xác địnhlàm thế nào để nuôi cấy nó độc lập Cuối cùng Shiro-koji thay thế kuro-koji đểngăn chặn các điều kiện vệ sinh khủng khiếp gây ra bởi kuro-koji Các nhà sảnxuất nhận ra một số lợi ích từ việc sử dụng shiro-koji: độ bền, dễ dàng phổ biếnrộng rãi và đẩy mạnh quá trình đường hóa Shiro-koji shochu có đặc điểm là dễuống, nhẹ và sạch [53]

Hình 2.4 Koji trắng (shiro koji) [54]

• Phđn loại theo nguyín liệu sản xuất có 3 loại: koji gạo, koji lúa mì vă kojiđậu nănh [55].

• Giống đưa văo sản xuất phải có câc điều kiện như sau [5]:

- Ảnh hưởng tốt đối với hương thơm

- Hoạt lực của men protease cao

- Sức phât triển mạnh vă chống tạp khuẩn tốt

- Không sinh độc tố aflatoxin

2.1.2.2 Ứng dụng

Nấm Aspergillus oryzae lă loăi mốc chính trong quâ trình chế tạo tương

vă nước tương do Aspergillus oryzae lín men ngon hơn câc tương khâc, vì

loại mốc năy có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thănh đường lăm cho

tương có vị ngọt Hai loăi không độc lăm tương lă Aspergillus oryzae vă Aspergillus sojae có hình thâi vă mău sắc rất giống với 2 loăi rất nguy hiểm

lă Aspergillus flavus vă Aspergillus parasiticus sản sinh ra độc tố Aflatoxin gđy bệnh ung thư [41] Aspergillus oryzae tham gia văo quâ trình sản xuất

tương vă rựu vang [28]

Bộ gen di truyền của Aspergillus oryzae hiện đê được phđn tích vă biết rất

kỹ văo năm 2001 Nấm năy có thể dùng trong công nghiệp để sản xuất nhiềuloại enzyme khâc nhau (amylase, protease, lipase, hemicellulase, cellulase,oxidoreductase, phytase, pectinesterase…) [41]

Người nghiín cứu sớm nhất về loăi nấm năy lă một nhă khoa học NhậtBản tín lă Jokichi Takamine Năm 1894 ông lấy được bằng sâng chế về quâ

trình sản xuất men đường hóa, trình băy phương phâp nuôi nấm sợi Aspergillus

trín câm vă dùng cồn để chiết xuất ra men amylase (men đường hóa tinh bột).Sau đó Takamine đê chứng minh được men năy có thể ứng dụng trong y học vẵng nhận được Bằng sở hữu trí tuệ Mặc dù nghề lăm tương ở Việt Nam vă nghềlăm sake ở Nhật Bản đê có từ lđu đời, nhưng việc chiết rút ra enzyme vă sảnxuất chế phẩm enzyme thì Takamine lă người đi tiín phong [41] Chế phẩm năyđược ứng dụng phổ biến trong quâ trình sản xuất nước chấm lín men từ đậunănh, câ hoặc từ thịt nhằm thúc đẩy quâ trình lín men, tăng chất lượng của sảnphẩm vă đảm bảo vệ sinh an toăn thực phẩm [18]

Nấm mốc Koji đẩy mạnh quâ trình lín men của cđy họ đậu trong đó cótương miso vă nước tương [28]

13 1

3

Hình 2.5 Hình ảnh nấm mốc Aspergilus oryzae [56]

Khi mốc phát triển điều khắp và chằng chịt là lúc các enzyme đang tiếnhành phân giải protein trong hạt đậu thành các acid amin tự do và một phầnđường [41]

2.2 GIỚI THIỆU VỀ NƯỚC TƯƠNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT NƯỚC TƯƠNG

2.2.1 Giới thiệu về nước tương

2.2.1.1 Đặc điểm của nước tương

Nước tương là một món ăn dạng lỏng, chủ yếu là acid amin với muối, cóhương vị đặc trưng Trong bữa ăn dùng để chấm hoặc trong nấu nướng dùng làmgia vị Nước tương còn được gọi là xì dầu hoặc xắng sáu [20] Nước tương đãđược thêm vào trong các món ăn truyền thống của nhiều khu vực Đông Á và trởthành nền văn hóa Đông Nam Á Nước tương được sử dụng rộng rãi như ở Thái,Trung Quốc, Hàn Quốc và món ăn Nhật Bản Mặc dù xuất hiện ở nhiều nước,nhưng nước tương sản xuất trong các nền văn hóa khác nhau và các vùng khácnhau thì có sự khác nhau trong hương vị, mùi thơm và độ mặn [35]

Nước tương là một chất lỏng mặn, màu nâu sẫm với một hương thơmriêng biệt Nó là đại diện gia vị mặn trong nấu ăn Phương Đông, nhưng nó ngàycàng phổ biến ở nhiều khu vực khác trên thế giới Công nghiệp hóa đã làm thayđổi quá trình sản xuất, thay đổi các nguyên liệu được sử dụng, tiêu chuẩn hóasản phẩm và sửa đổi phần nào đặc tính của nó [42]

Các thành phần chính của nước tương là đậu nành, bột mì, muối vànước Trung tâm của quá trình sản xuất là quá trình lên men phức tạp, theo đócacbonhydrate lên men thành rượu và acid lactic, các protein bị phá vỡ thành

các peptide và acid amin Các phản ứng đó tạo ra màu sắc, độ đặc và mùithơm của nước tương Quá trình sản xuất nước tương được chia thành 3 giai

đoạn: chuẩn bị chế phẩm Aspergillus oryzae, ngâm nước muối lên men và

tinh chế sản phẩm [42]

Hình 2.6 Hình ảnh nước tương [57]

Nước tương đậu nành là một trong những gia vị lâu đời nhất trên thế giới

và đã được sử dụng ở Trung Quốc trong hơn 2.500 năm Nó được làm từ mộthỗn hợp lên men của đậu nành nghiền, muối và các enzyme Nước tương là dịchthủy phân nguồn đạm có trong nguyên liệu [41]

Tác nhân thủy phân có thể là enzyme do vi sinh vật tiết ra, có thể là acidnhư HC1 (nước chấm hóa giải) Nước tương được sản xuất từ các nguyên liệugiàu protein bằng hai phương pháp: vi sinh vật và hóa học

Nước tương lên men thuần túy là nước tương cổ truyền ở các nước Áchâu Tuy nhiên thời gian thủy phân kéo dài hàng tháng, giá thành cao Vì vậytrong một thời gian dài hầu hết nước tương được sản xuất ở Việt Nam là nướcchấm hóa giải Các phương pháp lên men phải mất đến sáu tháng để hoàn thànhvới vị và hương thơm hài hòa Các loại nước chấm không ủ chỉ mất hai ngày đểthực hiện và thường mờ nhạc về hương vị và mùi thơm Nước tương đậu nành

đã được sử dụng để tăng cường hương vị của nhiều loại thực phẩm, bao gồm thịt

5

Gần đây người ta phát hiện trong nước chấm (nước tương) hóa giải bằngHC1 có chứa nhiều 3-MCPD (3-monochloropropane-l,2diol) có khả năng gâyung thư Vì vậy, có xu hướng quay trở về công nghệ truyền thống Một số quytrình sản xuất nước chấm an toàn (về 3-MCPD) giá thành chấp nhận được bằngcách kết hợp lên men và hóa giải đã được triển khai [7], [8].

2.2.1.2 Giá trị dinh dưỡng của nước tương

Vai trò của nước tương: Nghiên cứu của Đại học Quốc gia Singapore chỉ

ra rằng loại xì dầu sẫm màu của Trung Quốc chứa chất chống oxi hóa cao gấp

10 lần của rựu vang đỏ Xì dầu không chứa các isoflavon có lợi cho sức khỏe,

mà thông thường gắn liền với các sản phẩm từ đậu nành Nó cũng khá mặn vìthế không phù hợp với những người phải ăn kiêng muối [28]

Khi nói đến giá trị dinh dưỡng của nước tương quan trọng nhất là hàmlượng đạm toàn phần và hàm lượng acid amin Tỷ lệ hàm lượng acid amin đốivới đạm toàn phần cho biết mức độ thủy phân triệt để nguồn protein từ nguyênliệu và tỷ lệ này càng cao càng tốt Thành phần hóa học của nước tương thay đổitùy theo nguyên liệu, khâu phối chế và phương pháp sản xuất Nước tương đượcxem là ngon khi đảm bảo được yêu cầu về màu sắc, hương thơm, vị ngọt củađạm và đường

Bảng 2.6 Thành phần hóa học của nước tương [58]

2.2.2 Phương pháp sản xuất nước tương

Để sản xuất tương có tới 2 phương pháp công nghệ: công nghệ sản xuấttheo phương pháp lên men và phương pháp thủy phân bằng acid

2.2.2.1 Phương pháp lên men vi sinh vật

Quá trình sản xuất nước tương được tạo ra chủ yếu bằng sự thủy phânprotein, gluxit trong nguyên liệu nhờ hệ enzyme protease và amylase tạo ra từnấm mốc giống Mốc giống dưới dạng bào tử được cấy vào khối nguyên liệu đãhấp chín và ủ tạo chế phẩm nấm mốc koji (có lượng enzyme đạt tối ưu) Khi giaiđoạn nuôi mốc kết thúc, làm tơi nguyên liệu đã lên mốc, pha trộn dung dịch

Nguyên liệuNgâm qua đêmHấp 1000C, 30 phútLên menủLọc

Nước tương

Giống Aspergillus oryzae

Nguyên liệuNgâm qua đêmHấp 1000C, 30 phútLên menỦLọcNước tươngGiống Aspergillus oryzae

Nguyên liệuNghiềnThủy phânTrung hòaPhối chếThanh trùngLọc

Nước tương

Na2CO3HCl

Gia vị, muối, màu, chất bảo quản

nước muối và lên men trong khoảng 3 đến 6 tháng Trong quá trình lên men có

bổ sung các dạng nấm men, vi khuẩn lactic nhằm tạo hương vị tốt cho sản phẩm.Sau quá trình lên men dịch thủy phân được tách ra nhờ phương pháp lọc ép.Dịch sau khi lọc được thanh trùng, hoàn thiện sản phẩm và đóng chai [1]

Hình 2.7 Sơ đồ quy trình sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men[43]

Ưu điểm:

- Nước tương không chứa độc tố 3 – MCPD

- Chọn một số chủng Aspergillus oryzae có hoạt tính α-amylase và

protease cao, không sinh aflatoxin, lên men ổn định

Nhược điểm:

- Hiệu suất thủy phân thấp

- Thời gian sản xuất kéo dài (2-3 tháng)

- Chiếm nhiều mặt bằng

2.2.2.2 Phương pháp hóa học (thủy phân bằng acid)

Ngoài phương pháp lên men, nước tương còn được sản xuất bằng cáchthủy phân acid (dùng acid thủy phân protein) Sản phẩm tạo ra được gọi là nướctương hóa học Sản phẩm này hoàn toàn khác so với nước tương được sản xuấtbằng phương pháp lên men [1]

17 1

7

Hình 2.8 Sơ đồ quy trình sản xuất nước tương bằng phương pháp hóa học [43]

Đầu tiên nguyên liệu được ngâm, nấu ở nhiệt độ 110-1210C với HCl 16% trong khoảng 12-24 giờ Sau khi sôi, để nguội hoàn toàn lọc rửa dịch thủyphân sau đó trung hòa bằng NaOH hoặc Na2CO3 đến pH 5,0-6,0 (thấp hơn pH5,0 có vị chua, cao hơn pH 6,0 có vị đắng, mùi nồng) Thêm muối, cô đặc đếnhàm lượng đạm cần thiết (tiêu chuẩn đạm: 10-22g/l) Sau đó đem thanh trùng,

15-vô chai, bảo quản và phân phối tiêu thụ [1]

- Hóa chất gây hư hao nhà xưởng, thiết bị

- Công nghệ sản xuất gây ô hiễm môi trường và người trực tiếp sản xuất

- Sản phẩm tạo ra có chứa độc tố 3-MCPD vượt mức cho phép

2.3 BẢN CHẤT CỦA QUÁ TRÌNH LÊN MEN NƯỚC TƯƠNG

2.3.1 Cơ sở khoa học của phương pháp lên men

Đối với phương pháp sản xuất nước chấm lên men, cơ sở khoa học của nó làlợi dụng hệ men của vi sinh vật phát triển trên nguyên liệu giàu đạm nuôi chúng, đểrồi thủy phân protein thành các dạng acid amin và các dạng peptid khác có trongnguyên liệu thành nước chấm [20] Do vậy trong quá trình sản xuất phải nuôi mốccho tốt, để có nhiều men thủy phân triệt để protein có trong nguyên liệu, nâng caohiệu suất lợi dụng nguyên liệu, hạ giá thành sản phẩm [5]

2.3.2 Sản phẩm của quá trình thủy phân

Chất lượng nước tương thay đổi tùy theo nguyên liệu, tỷ lệ phôi chế,phương pháp chế biến Trong nước chấm lên men còn chứa khá nhiều đường

do tác dụng của men amylase của mốc lên tinh bột Nước chấm còn chứa mộtlượng chất béo, một số vitamin, muôi ăn và các nguyên tố vi lượng khác Vìvậy, các loại nước chấm nếu được sản xuất theo đúng quy trình kỹ thuật vàđược bảo quản tốt sẽ có màu sắc đẹp, hương vị thơm và có vị ngọt của đạm

và đường [10]

Nước tương có chứa nhiều acid amin thiết yếu như: valine, tryptophan,lysine và histidine và cũng chứa vitamin (đặc biệt là vitamin B6) và chất chốngoxi hóa (isoflavone) [30]

2.3.2.1 Acid amin

Trong nước tương có nhiều acid amin như arginin, methionin, tryptophan,tyrosin, valin, serin, glycin, hystidin, alanin, glutamic, asparagin Những acidamin này cùng với di, tri, tetra - peptid làm cho nước tương có vị ngọt của đạm

và mùi thơm mùi thịt Nước tương sản xuất theo phương pháp lên men hầu nhưgiữ được tất cả các acid amin có trong đậu nành [10]

2.3.2.2 Đường

Trong nước tương có các loại đường glucoza, fructoza, maltoza, pentoza,dextrin Đường có vai trò quan trọng trong việc hình thành màu sắc nước tương [10]

2.3.2.3 Acid hữu cơ

Các acid hữu cơ có trong nước tương quan hệ mật thiết với nhau tạohương vị đặc trưng của nước tương Trong đó, acid lactic chiếm hàm lượngnhiều nhất (chiếm khoảng 1,6%) Acid lactic tác dụng với nước tương tạo hợpchất lactat như lactat phenol Ngoài ra còn có acid acetic 0,2%, acid sucinic

19 1

9

0,087 – 0,16%, acid formic 0,05% Muối của các acid này tham gia tạo vị chonước tương [10].

2.3.2.4 Chất màu

Màu của nước tương chủ yếu do đường kết hợp với acid amin tạo nên.Màu của nước tương lên men được hình thành dần dần từ màu vàng đến màunâu nhạt, cuối cùng là nâu đậm

Sự hình thành màu của nước tương phụ thuộc vào nồng độ đường, acidamin và nhiệt độ Nếu tăng cường phản ứng giữa acid amin với đường thì không

có lợi vì tạo ra melanoid Melanoid là chất mà cơ thể khó hấp thu và khi nồng độcủa nó cao sẽ làm giảm hương vị của sản phẩm Mặt khác, quá trình hình thànhsản phẩm màu này gây tổn thất lớn acid amin Để hạn chế quá trình này, ta chọnnguyên liệu có hàm lượng đường thấp, tránh nâng cao nhiệt độ và kéo dài thờigian thủy phân [10]

2.3.2.5 Thành phần hương thơm

Mùi của nước tương là do tổng hợp của rất nhiều chất khác nhau tạothành Mùi của nước tương có thể phân ra acid hữu cơ, rượu, aldehyde, thànhphần hương thơm có lưu huỳnh, phenol Cụ thể là các hợp chất như:acetaldehyde, propandehyde, butadehyde, valeraldehyde, allyl mecaptan,methyel mecaptan, isobutan adehyde, dimelthyl capmetan, etyloleat, rượuethylic, acid acetic, acid petanoic, acid propionic, acid benzoic, benzaldehyde

có hương thơm ngũ cốc rang [10]

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống là một trong các loạisản phẩm lên men phổ biến của các dân tộc trên thế giới Đó là một sản phẩmđược sản xuất thủ công mang sắc thái kinh nghiêm và bản sắc riêng của từngdân tộc [7]

Việt nam là một trong những nước Châu Á giàu các sản phẩm lên mennhư: nước mắm, mắm tôm, tương, nước tương, rượu Ngày càng đóng vai tròquan trọng trong nền văn hóa ẩm thực của người Việt Trong đó, nước tương làmột loại gia vị rất thông dụng ở Việt Nam Nó không chỉ dùng làm nước chấm

mà nó còn có vai trò như một loại gia vị, giúp cho món ăn có vị ngon và vị mặnnhẹ, tạo mùi thơm đặc trưng cho món ăn [13]

Từ năm 2000-2001, phòng vi sinh – Viện sinh học nhiệt đới đã nghiêncứu cải thiện quy trình công nghệ sản xuất nước tương từ đậu nành lên men với

chủng nấm mốc Aspergillus oryzae đã được chon lọc có hoạt lực α amylase và protease cao, không sinh aflatoxin Chủng Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên

đậu nành, ủ trong thùng làm bằng sợi thủy tinh dung tích 5000 – 1000 lít, nên íttốn mặt bằng [6]

Kết quả của Nguyễn Tiến Sĩ (2007), cho thấy việc sử dụng nguyên liệubánh dầu đậu nành cho nước tương có chất lượng tốt nhất và có lợi nhất về giátrị kinh tế Nguyên liệu sau khi ủ được xay nhuyễn có tác dụng làm tăng khảnăng phân cắt của amylase đối với các hợp chất đường trong bánh dầu đậu nành.Quy trình có bổ sung bromelin có tác dụng làm tăng giá trị dinh dưỡng của nướctương và lượng enzyme bổ sung thích hợp nhất là 10g/kg [13]

Năm 2009, bằng việc tối ưu hóa quy trình sản xuất, các tác giả Võ ThịHạnh và Lê Thị Bích đã đưa ra được công nghệ sản xuất nước tương sạch,không chứa độc tố 3- MCPD Quy trình mới này rút ngắn được thời gian sảnxuất từ 3-4 tháng xuống 15-30 ngày mà vẫn cho sản phẩm có chất lượng ổnđịnh, mùi vị thơm ngon tự nhiên [40]

Nghiên cứu của Đặng Hồng Ánh (2011), hoàn thiện công nghệ và thiết bịsản xuất nước chấm từ đậu nành bằng công nghệ vi sinh vật Đề tài đã đạt đượcmột số thành công từ việc lựa chọn các chủng vi sinh vật phù hợp, cải tiến, hoànthiện các công đoạn nuôi tạo chế phẩm nấm mốc giống, chế độ nuôi ủ mốc cóchứa hàm lượng enzyme cao, công đoạn lên men, hoàn thiện sản phẩm cũng nhưcác cải tiến trong hệ thống thiết bị sản xuất [1]

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 2008, Amal Fayyad đã nghiên cứu phân lập Aspergillus oryzae và

tạo ra nước tương có hương vị mới Mục đích của nghiên cứu này là để phân lập

và giới thiệu Aspergillus oryzae sử dụng trong sản xuất nước tương, các enzyme của Aspergillus oryzae có vai trò thiết yếu trong quá trình lên men Tiến hành

khảo sát nước tương ở các điều kiện như: pH là 4,16, 4,65, 4,25, nồng độethanol là 0,11%, 0,57%, 0,92% (v/v), nồng độ NaCl là 14,04%, 16,38%, 15,4%(w/v) Có thể kết luận rằng nồng độ muối cao là rất cần thiết để ngăn chặn hoạtđộng của các vi sinh vật trong sản phẩm [26]

Theo Pornpimol Muangthai và cộng sự (2009), đã cải tiến việc sản xuấtnước tương để tạo ra nước tương có chất lượng tốt và an toàn từ đậu pigeon vàđậu nành Mục tiêu của nghiên cứu này là để tạo ra sản phẩm nước tương có

21 2

1

hàm lượng muối thấp từ sự kết hợp của đậu pigeon và đậu nành Quá trình nàyđược chia làm hai giai đoạn Giai đoạn đầu tiên, nước tương đậu nành đã đượcchuẩn bị từ 6 công thức khác nhau bằng cách thay đổi tỷ lệ đậu pigeon và đậunành là: 100: 0 (F1), 80:20 (F2), 60:40 (F3), 40:60 (F4), 20:80 (F5) và 0: 100(F6) Hàm lượng koji sử dụng là 20 (w/v), lên men trong 90 ngày Công thức tốtnhất được lựa chọn để nghiên cứu thêm trong giai đoạn hai Trong giai đoạnnày, nước tương đậu nành đã được chuẩn bị bởi sự biến thiên của hàm lượngnatri clorua là: 18%, 16%, 14%, 12% và 10% Từ giai đoạn 1, tỷ lệ đậu pigeon

để thay thế đậu nành tốt nhất là 60:40 được sử dụng như là công thức trong giaiđoạn 2 Trong giai đoạn 2, theo dõi hoạt động amylase, acid lactic và acid acetictrong khoảng thời gian từ 0, 10, 20, 30, 45, 60, 75 và 90 ngày, kết quả theo dõichứng minh rằng giảm muối trong quá trình lên men không ảnh hưởng xấu đếnquá trình lên men [23]

Tarek Elbashiti và cộng sự (2010), nghiên cứu phân lập và nhận dạng

Aspergillus oryzae và sản xuất nước tương Mục đích của nghiên cứu này là để

phân lập Aspergillus oryzae nuôi cấy từ gạo, đậu nành và lúa mì để sử dụng

trong sản xuất nước tương với hương vị mới của húng tây và thì là Quá trìnhchuẩn bị lên men nước tương gồm hai giai đoạn Đầu tiên là Koji, đã đượcchuẩn bị bằng cách phân lập rồi trộn với đậu nành đã được nghiền mịn hấp chín,

ủ trong ba ngày Giai đoạn thứ hai chuẩn bị nước muối Các dữ liệu thu đượcđược phân tích bằng chương trình SPSS Các kết quả phân tích của nước tươngđậu nành khuyến khích việc thêm rau thì là hoặc thyme đã tạo ra một mùi thơmđặc trưng cho sản phẩm cuối cùng [25]

Ta Yeong Wu và cộng sự (2010), nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lênmen moromi có sục khí liên tục đến sản phẩm nước tương Trong nghiên cứunày Ta Yeong Wu và cộng sự đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pHđến chất lượng nước tương lên men Kết quả thu được ở nhiệt độ 450C, pH=5,5thì hàm lượng đạm tổng số thu được là cao nhất [39]

Tin Mar Lynn và cộng sự (2013), nghiên cứu về sản xuất nước tương lên

men bằng Aspergills oryzae và Aspergillus oryzae flavus Ngâm 2 kg đậu nành

trong nước qua đêm, sau đó nấu trong nồi hấp ở 1210C trong 30 phút, để nguội

rồi trọn 2 kg bột mì và thêm Aspergillus oryzae vào, ủ trong 5 ngày Thực hiện tương tụ như trên cho nấm mốc Aspergillus flavus Kết quả nước tương lên men

từ nấm mốc Aspergillus oryzae có hàm lượng protein cao hơn và có nhiều acid

amin hơn [30]

Shoupeng Wan và cộng sự (2013), tiến hành nghiên cứu sự phát triển củanước tương bằng đậu nành hữu cơ Trong nghiên cứu này Shoupeng Wan và

cộng sự đã tiến hành ngâm các loại đậu nành trong 7giờ, hấp ở nhiệt độ 1210Ctrong 15 phút và trộn với lúa mì ran với hàm lượng là 5,5% so với nguyên liệu

đậu nành, rồi trộn với Aspergillus oryzae 0,3% và nuôi cấy trong 36 giờ Bổ

sung nước muối với tỷ lệ 2:1 và tiến hành lên men Kết quả thu được là nướctương lên men với nguyên liệu là đậu nành hữu cơ cho hàm lượng protein caohơn đậu nành không hữu cơ [37]

Changlu Ma và cộng sự (2014), nghiên cứu công nghệ xử lý gluten trongnước tương với hàm lượng muối thấp và lên men trạng thái rắn Thí nghiệm chothấy tỷ lệ bột mì, cám và nước tốt nhất là 3: 4: 3: 6 để xử lý gluten trong nướctương Cuối cùng, thử nghiệm cho thấy hàm lượng amino nitơ cao nhất khi pH

là 7, nồng độ của dung dịch nước muối là 12% và tỷ lệ rắn-lỏng là 1: 0,6 là phùhợp nhất cho quá trình lên men [31]

23 2

3

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đậu nành

Đậu nành được mua tại siêu thị Big C của thành phố Huế Đậu nành phải

có màu vàng, hình oval Đậu nành sau khi mua về được loại bỏ tạp chất, hạt nứt,

hư hỏng do sâu bọ, sau đó được ngâm và xay mịn

3.1.2 Chế phẩm Aspergilus oryzae N2

Chế phẩm Aspergillus oryzae N2 được cung cấp từ nguồn của phòng thínghiệm vi sinh, Khoa Cơ khí-Công nghệ, trường Đại học Nông Lâm Huế Gồm

có 3 loại sau:

- Chủng Aspergillus oryzae N2 thuần khiết

- Chế phẩm Aspergillus oryzae N2 được nuôi cấy trên môi trường bánrắn cám-gạo

- Chế phẩm Aspergillus oryzae N2 được nuôi cấy trên môi trường bánrắn cám-trấu

Chế phẩm Aspergillus oryzae N2 được nuôi cấy theo các điều kiện sau:

Bảng 3.1 Điều kiện nuôi cấy chế phẩm Aspergillus oryzae N 2

Các điều kiện

Chế phẩm Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường cám-gạo

Chế phẩm Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường cám-trấu

Đậu nànhNgâm 7-8 giờXay mịnHấp tiệt trùng (1210C, 15 phút)

Phối trộn

Chế phẩm Aspergillus oryzae N2 (3%, 4%, 5%, 6%) so với khối lượng nguyên liệu

Nước tiệt trùngThủy phân

Thêm nướcNước tiệt trùng (tỷ lệ 1:1; 2:1; 3:1; 4:1 so với nguyên liệu)Muối (10%, 15%, 20%, 25% so với nguyên liệu)

Lên menLọcThanh trùng (70-800C, 1,5 đến 2 giờ)

Nước tương

3.2.1 Khảo sát khả năng thủy phân protein đậu nành của 3 chế phẩm

Aspergillus oryzae N2 (Aspergillus oryzae N2 thuần khiết, Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường cám-gạo, Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường cám-trấu)

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự thủy phân protein đậu

nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2

- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm Aspergillus oryzae N2 đến khả năngthủy phân protein của đậu nành

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân protein đậu nành

của chế phẩm Aspergillus oryzae N2.

- Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân protein đậu nành của chế

phẩm Aspergillus oryzae N2

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân protein đậu nành của

chế phẩm Aspergillus oryzae N2

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến chất lượng nước tương

- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nước bổ sung

- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng muối bổ sung

3.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM

Tham khảo quy trình sản xuất nước tương lên men của một số nước trênthế giới [1] và quy trình sản xuất nước tương ở mục 2.2.2.1 của phần tổng quan,chúng tôi đã tiến hành bố trí thí nghiệm theo sơ đồ dưới đây

25 2

5

Hình 3.1 Quy trình sản xuất nước tương ở quy mô phòng thí nghiệm

3.3.1 Khảo sát khả năng thủy phân protein đậu nành của 3 chế phẩm

Aspergillus oryzae N2 (Aspergillus oryzae N2 thuần khiết, Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường cám-gạo, Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường cám-trấu)

Ở thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các chế

phẩm Aspergillus oryzae N2 trên các môi trường bán rắn tới khả năng thủy phân

của protein đậu nành Chúng tôi tiến hành như sau: cấy chế phẩm Aspergillus

cám-trấu và chế phẩm Aspergillus oryzae N2 thuần khiết cho vào nguyên liệu với tỷ

lệ là 6%, thủy phân ở nhiệt độ 550C, pH = 5 [10] Quan sát sự thủy phân đậunành của chúng trong 4 ngày và tiến hành xác định đạm tổng số, acid amin

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến sự thủy phân protein đậu

nành của chế phẩm nấm Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường

cám-gạo

3.3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm Aspergillus oryzae N 2 (nuôi cấy trên môi trường cám-gạo) đến khả năng thủy phân protein đậu nành

Ở thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát cho từng tỷ lệ chế phẩm

Tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 550C, pH=5 Quan sát sự thủy phân đậu nànhcủa chúng trong 4 ngày và tiến hành xác định đạm tổng số, acid amin

3.3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân protein đậu nành từ chế phẩm Aspergillus oryzae N 2 nuôi cấy trên môi trường cám-gạo

Tiến hành thủy phân protein đậu nành trong điều kiện thích hợp tại cácmức thời gian thủy phân khác nhau là: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ Tiến hànhthủy phân ở nhiệt độ 550C, pH = 5 với tỷ lệ mốc 4% so với nguyên liệu Quansát sự thủy phân đậu nành của chúng trong 3 ngày và tiến hành xác định đạmtổng số, acid amin

3.3.2.3 Ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân protein đậu nành từ chế phẩm Aspergillus oryzae N 2

Sau khi xác định được tỷ lệ chế phẩm Aspergillus oryzae N2 (4%) và thờigian (72 giờ), thực hiện thủy phân đậu nành ở các điều kiện thích hợp đó với cácmức pH ban đầu khác nhau: 4,5; 5; 5,5 và 6 Tiến hành thủy phân ở nhiệt độ

550C Quan sát sự thủy phân đậu nành của chúng trong 3 ngày và tiến hành xácđịnh đạm tổng số, acid amin

3.3.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N 2 nuôi cấy trên môi trường cám-gạo

Tiến hành thủy phân protein đậu nành từ các điều kiện thích hợp đã khảo sát

ở trên với các mức nhiệt độ khác nhau: 45, 50, 55 và 600C Quan sát sự thủy phânđậu nành của chúng trong 3 ngày và tiến hành xác định đạm tổng số, acid amin

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men

3.3.3.1 Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung vào nguyên liệu đến quá trình lên men

Mẫu sau khi đã thủy phân với các điều kiện tối thích đã khảo sát ở trênđược đem đi bổ sung lượng nước muối so với lượng nguyên liệu ở các tỷ lệ khác

27 2

7

nhau là: 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, thực hiện lên men trong thời gian 15 ngày, ở nhiệt độ

300C, hàm lượng muối 15%, cứ 5 ngày xác định hàm lượng đạm tổng số, acidamin một lần

3.3.3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng muối bổ sung vào nguyên liệu đến quá trình lên men

Tiến hành lên men mẫu ở nhiệt độ 300C, lượng nước bổ sung so vớinguyên liệu 2:1, lượng nước muối cho vào lên men ở các mức độ khác nhau là:10%, 15%, 20% và 25% so với nguyên liệu, cứ 5 ngày xác định hàm lượng đạmtổng số, acid amin một lần

3.3.4 Đánh giá chất lượng của sản phẩm nước tương

Sản phẩm nước tương thu được sẽ được đem đi lọc, thanh trùng ở

70-800C trong1,5-2 giờ và tiến hành xác định các chỉ tiêu vi sinh vật, chỉ tiêu cảmquan, chỉ tiêu hóa học

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Phương pháp hóa học

3.4.1.1 Phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số

 Nguyên tắc:

Khi đốt nóng sản phẩm đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu

cơ bị oxi hóa Carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O Còn nitơ sau khi đượcgiải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trongdung dịch Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng NaOH, đồng thời cất và thu NH3bằng một lượng dư H2SO4 0,1N còn lại bằng dung dịch NaOH 0,1N chuẩn, qua

đó tính ddwwocj lượng nitơ có trong mẫu nguyên liệu thí nghiệm

 Tiến hành: xem chi tiết ở muc 3.1, phụ lục 3

• Tính kết quả:

Hàm lượng nitơ toàn phần X1 tính bằng g/l theo công thức:

Trong đó:

V1: số ml dung dịch H2SO4 0,1N cho vào bình hứng

V2: số ml dung dịch NaOH 0,1N để chuẩn độ acid dư

V: dung tích bình định mức

v: thể tích nước tương lấy để vô cơ (ml)

v’: số ml mẫu pha loãng cho vào mấy cất đạm

0,0014: số gam nitơ tương ứng với 1ml NaOH 0,1N

V1: số ml dung dịch H2SO4 0,1N cho vào bình hứng

V2: số ml dung dịch NaOH 0,1N để chuẩn độ acid dư

V: thể tích nước tương lấy để vô cơ

0,0014: số gam nitơ tương ứng với 1ml NaOH 0,1N

9

0,0007: lượng nitơ ứng với 1ml NaOH, g

V0: dung tích bình định mức, ml

V1: thể tích dug dịch lấy để chuẩn độ, ml

V: thể tích nước tương lấy để định mức [9]

- Cách tiến hành: phụ lục 3

- Tính kết quả: Đếm tất cả số khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ

Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 để tính kết quả Mật độ tổng vi khuẩn hiếukhí trong 1g mẫu hay 1ml mẫu được tính như sau:

Trong đó: A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1ghay 1ml mẫu

N: Tống số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

Ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong đĩa

fi: Độ pha loãng tương ứng [17]

3.4.2.2. Định lượng Coliform và E.coli bằng phương pháp Most probable

number

 Nguyên tắc

Mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp nhaukhác nhau 10 lần) Mẫu được đồng nhất và pha loãng thành các nồng độ thíchhợp rồi được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khíDurham Mỗi ống có nồng độ pha loãng được ủ từ 3 ống lặp lại Theo dõi sựsinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là

các ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗinồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng vi sinh vật tươngứng hiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu [11].

 Địa điểm và người thử

Phòng thí nghiệm đánh giá cảm quan, khoa Cơ khí – Công nghệ

Mẫu đậu nước tương được đựng trong ly nhựa

Cốc nước thanh vị 30 cái thể tích 50 ml, thìa nhựa 30 cái, 20 cây viết

- Tiến hành buổi thử:

Tiến hành chia 30 người thử thành 2 nhóm, mỗi nhóm 15 người

Người thử sẽ được mời quan sát cấu trúc, màu sắc của sản phẩm nướctương, ngửi mùi, nếm thử vị và đánh giá mức độ ưa thích, hài lòng của mình đốivới sản phẩm nước tương và trả lời vào phiếu đánh giá cảm quan (xem chi tiết ởphụ lục 3)

Sử dụng thang 9 điểm để đánh giá mức độ ưa thích:

1

Với kết quả nhận được tiến hành xử lý số liệu và đưa ra mức độ ưa thíchcủa người tiêu dùng đối với sản phẩm nước tương [19].

3.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Sử dụng phần mềm phân tích phương sai SPSS 20 (Statistical Package

to the Social Sciences) để xử lý số liệu

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PROTEIN ĐẬU NÀNH CỦA

3 CHẾ PHẨM ASPERGILLUS ORYZAE N2 (ASPERGILLUS ORYZAE N2 THUẦN KHIẾT, ASPERGILLUS ORYZAE N2 NUÔI CẤY TRÊN MÔI

TRƯỜNG CÁM-GẠO, ASPERGILLUS ORYZAE N2 NUÔI CẤY TRÊN

MÔI TRƯỜNG CÁM-TRẤU)

Để lựa chọn chế phẩm Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên các môi trườngbán rắn khác nhau có khả năng thủy phân protein tốt nhất và ứng dụng trong quytrình sản xuất nước tương Chúng tôi tiến hành như sau: bổ sung các chế phẩm

trường cám-gạo, môi trường cám-trấu và Aspergillus oryzae N2 thuần khiết chovào nguyên liệu với tỷ lệ là 6%, thủy phân ở nhiệt độ 550C, pH = 5 và quan sát

sự thủy phân đậu nành của chúng trong 4 ngày và tiến hành xác định hàm lượngđạm tổng số, acid amin của mẫu Kết quả được thể hiện ở hình 4.1

Hình 4.1 Ảnh hưởng của các chế phẩm Aspergillus oryzae N 2 nuôi cấy trên các môi trường bán rắn khác nhau tới sự thay đổi hàm lượng đạm

tổng số và acid amin

(số liệu có số mũ khác nhau biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa với p<0,05)Qua hình 4.1 cho thấy việc sử dụng chế phẩm nấm mốc ở các môi trường bánrắn khác nhau thì hàm lượng đạm tổng số và hàm lượng acid amin thu được sẽ khácnhau Trong đó, hàm lượng đạm tổng số đạt giá trị cao nhất là (7,75 g/l) tại môitrường bán rắn cám-gạo và thấp nhất là (5,55 g/l) tại môi trường cám-trấu

Tương tự kết quả thu được hàm lượng acid amin đạt giá trị cao nhất (4,15g/l) khi sử dụng nấm mốc nuôi cấy trên môi trường cám-gạo và đạt giá trị thấpnhất (3,13 g/l) khi sử dụng nấm mốc nuôi cấy trên môi trường cám-trấu

Theo kết quả phân tích ANOVA cũng chỉ rõ rằng khả năng thủy phân

protein đậu nành đạt giá trị cao nhất với chế phẩm Aspergillus oryzae N2 nuôicấy trên môi trường bán rắn cám-gạo Mức độ thủy phân và sản phẩm thủy phânthu được ở các môi trường bán rắn khác nhau là khác nhau, có sự sai khác có ýnghĩa ở mức p<0,05

33 3

3

Theo kết quả nghiên cứu của Xianli Gao và cộng sự về so sánh tính chấthóa lý của Koji thuần khiết và Koji hỗn hợp (2010), thì hàm lượng đạm tổng số,acid amin và tổng lượng đường của sản phẩm nước tương lên men bởi koji hỗnhợp cao hơn so với koji thuần khiết [27]

Năm 2008, Amal Fayyad nghiên cứu phân lập Aspergillus oryzae và tạo

ra nước tương có hương vị mới Kết quả nước tương sản xuất từ gạo cho hàmlượng protein và đạm tổng số cao hơn so với nước tương được chế biến từ đậunành và nước tương trên thị trường [26]

Trên cơ sở kết quả thu được chúng tôi chọn chế phẩm Aspergillus oryzae

N 2 được nuôi cấy trên môi trường bán rắn cám gạo thích hợp nhất cho quá trìnhthủy phân protein đậu nành, để dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

4.2 KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN PROTEIN ĐẬU NÀNH CỦA CHẾ PHẨM

ASPERGILLUS ORYZA N2 NUÔI CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG CÁM-GẠO

4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm Aspergillus oryzae N2 (nuôi

cấy trên môi trường cám-gạo) đến khả năng thủy phân protein đậu nành

Chế phẩm Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường bán rắn cámgạo ở nghiên cứu trên được sử dụng để nghiên cứu tỷ lệ chế phẩm dùng trongquá trình thủy phân protein đậu nành.Việc sản xuất nước tương thường bao gồm

hai giai đoạn, giai đoạn chuẩn bị chế phẩm Aspergillus oryzae và giai đoạn lên men Đáng chú ý, chế phẩm Aspergillus oryzae chứa protease và amylase có

chất lượng và độ hoạt động cao Trong giai đoạn lên men, protein bị phá vỡthành các chuỗi axit amin bằng enzyme phân giải protein, đặc biệt bởi proteasetrung tính và kiềm Polysaccharides được thủy phân thành oligosaccharides,disaccharides và monosacarit, chủ yếu là do amylase của nấm mốc tiết ra, lipid

cũng được thủy phân bởi các lipase có trong chế phẩm Aspergillus oryzae [21].

Do đó tỷ lệ chế phẩm Aspergillus oryzae sử dụng là yếu tố rất quan trọng để

thủy phân protein Tỷ lệ chế phẩm phải đủ thì khả năng thủy phân proteinnguyên liệu mới cao Để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm nấm mốc đếnkhả năng thủy phân protein đậu nành chúng tôi tiến hành như sau: bổ sung chếphẩm nấm mốc với 4 tỷ lệ khác nhau là: 3%, 4%, 5% và 6% so với tổng nguyênliệu, thủy phân ở nhiệt độ 550C, quan sát sự thủy phân protein đậu nành trong 4ngày và tiến hành xác định hàm lượng đạm tổng số, acid amin của mẫu Kết quảđược thể hiện ở hình 4.2

Hình 4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm Aspergillus oryzae N 2 đến sự thay đổi

hàm lượng đạm tổng số và acid amin

(số liệu có số mũ khác nhau biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa với p<0,05)

Qua hình 4.2 cho thấy tỷ lệ chế phẩm Aspergillus oryzae N2 bổ sung ảnhhưởng rõ rệt đến hàm lượng đạm tổng số thu được Khi tăng tỷ lệ chế phẩm

Aspergillus oryzae N2 từ 3%-6% thì hàm lượng đạm tổng số đạt giá trị lớn nhất

(9,38 g/l) tại tỷ lệ 4%, tuy nhiên nếu tiếp tục tăng tỷ lệ chế phẩm Aspergillus

và (7,75 g/l)

Tương tự kết quả thu được hàm lượng acid amin đạt giá trị lớn nhất tại tỷ

lệ 4% (4,76 g/l), nếu tiếp tục tăng tỷ lệ chế phẩm lên 5% và 6% thì hàm lượngacid amin giảm lần lượt là (4,34 g/l) và (4,16g/l)

Kết quả thu được ở hình 4.2 cho thấy với tỷ lệ mốc giống/nguyên liệucàng cao thì hoạt lực enzyme có trong khối nguyên liệu càng giúp cho quá trìnhthủy phân diễn ra càng nhanh và đạt hiệu quả cao [1], nhưng với hàm lượng chếphẩm quá cao hàm lượng enzyme giảm và hiệu suất thủy phân giảm vì hàmlượng chế phẩm bổ sung cao sẽ xảy ra sự canh tranh của chúng trong cơ chất.Với lượng chế phẩm mốc thấp (4%) thì sợi mốc phát triển kém hơn và lượngenzyme tạo thành cũng kém hơn sau 4 ngày nuôi [16]

Theo kết quả phân tích ANOVA cũng chỉ rõ khả năng thủy phân proteinđậu nành đạt giá trị cao nhất với tỷ lệ chế phẩm bổ sung là 4% Sản phẩm thủyphân thu được ở các tỷ lệ chế phẩm là có sự khác nhau có ý nghĩa p<0,05

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu hoàn thiệncông nghệ và thiết bị sản xuất nước tương bằng công nghệ vi sinh của ĐặngHồng Ánh kết quả thu được tỷ lệ nấm mốc 4% thì khả năng thủy phân proteinmạnh nhất [1]

Trên cơ sở kết quả thu được, chúng tôi chọn tỷ lệ chế phẩm Aspergillus

phân protein là 4% Kết quả này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

4.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân

protein đậu nành của chế phẩm Aspergilus oryzae N2 nuôi cấy trên môi

trường cám-gạo

Để xác định thời gian thủy phân thích hợp nhất bằng cách tiến hành thủy

phân đậu nành với tỷ lệ chế phẩm Aspergillus oryzae N 2 4%, nhiệt độ 550C, ởcác mức thời gian khác nhau là: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ Tiến hành xác

35 3

5

định hàm lượng đạm tổng số và acid amin, để chọn ra thời gian thủy phân thíchhợp Kết quả thể hiện ở hình 4.3.

Hình 4.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến sự thay đổi hàm lượng đạm

tổng số và hàm lượng acid amin

(số liệu có số mũ khác nhau biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa với p<0,05)Dựa vào kết quả được trình bày ở hình 4.3 cho thấy ảnh hưởng của thời

gian đến khả năng thủy phân protein từ chế phẩm Aspergillus oryzae N2 tăngdần trong khoảng thời gian 24-72 giờ, hàm lượng đạm tổng số đạt giá trị caonhất tại 72 giờ là (9,94 g/l) Sau đó quá trình thủy phân giảm dần nếu kéo dàithời gian thủy phân lên 96 giờ

Tương tự cho thấy hàm lượng acid amin tăng theo thời gian thủy phân vàđạt giá trị cao nhất ở 72 giờ (5,27 g/l) Nếu như kéo dài thời gian tới 96 giờ thìhàm lượng nitơ acid giảm chỉ còn (4,76 g/l)

Kết quả thu được ở hình 4.3 cho thấy thời gian thủy phân đạt giá trị thấpnhất tại 24 giờ, ở thời điểm này quá trình thủy phân chỉ mới bắt đầu xảy ra nênchưa được thủy phân hoàn toàn Khi tăng thời gian thủy phân từ 24 giờ đến 72giờ thì hiệu suất của quá trình thủy phân tăng, ở thời điểm này thì các enzyme

của chế phẩm Aspergillus oryzae đã thủy phân protein của đậu nành triệt để hơn,

nếu tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân thì hiệu suất của quá trình giảm do lúcnày hàm lượng cơ chất giảm làm cho vận tốc của enzyme giảm [16]

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu củaJarun Chutmanop và cộng sự (2008) khi nghiên cứu sản xuất protease bởi

Aspergillus oryzae trong quá trình lên men trạng thái rắn sử dụng chất

agroindustrial, thời gian thủy phân protein đâu nành thích hợp nhất là 72 -84

giờ, ở thời gian này nấm mốc Aspergillus oryzae sản sinh ra enzyme protein có

hoạt lực cao nhất [23]

Kết quả phân tích ANOVA cho thấy sự thủy phân đạt giá trị cao nhất tạithời gian thủy phân 72 giờ Ở những thời gian thủy phân khác nhau thì sự saikhác có ý nghĩa p<0,05

Qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng thời gian thủy phân proteinđậu nành thích hợp nhất là 72 giờ, kết quả này được sử dụng cho các nghiêncứu tiếp theo

4.2.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân protein đậu nành của

chế phẩm Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường cám-gạo

Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường, mỗi hệ ezymchỉ hoạt động mạnh nhất ở vùng pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme[16] Trong sản xuất nước tương protease đóng vai trò quan trọng để thủy phânprotein của nguyên liệu Vì vậy phải chọn pH tối thích cho enzyme hoạt độngmạnh Ngoài ra pH có ảnh hưởng nhiều tới vận tốc phản ứng của enzyme dotrung tâm hoạt động của enzyme gồm các nhóm có chức năng ion hóa, nếu thayđổi pH của môi trường thì ảnh hưởng tới trạng thái ion hóa của chúng [16]

Do đó chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng

thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N 2 ở các mức pHkhác nhau là 4,5; 5; 5,5; 6 và thủy phân ở nhiệt độ 550C trong 3 ngày Sau đóxác định hàm lượng đạm tổng số, acid amin Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pHlên khả năng thủy phân protein đậu nành được thể hiện ở hình 4.4

Hình 4.4 Ảnh hưởng của pH đến sự thay đổi hàm lượng đạm tổng số

và hàm lượng acid amin

(số liệu có số mũ khác nhau biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa với p<0,05)Kết quả hình 4.4 cho thấy khả năng thủy phân protein đậu nành của chế

phẩm Aspergillus oryzae N2 tăng từ 4,5 đến 5 và đạt giá trị lớn nhất tại pH = 5với hàm lượng đạm tổng số (9,94 g/l) Nếu tăng pH lên 5,5 và 6 thì hàm lượngđạm tổng số giảm chỉ còn (9,15 g/l) và (8,59 g/l) Qua đó chúng tôi nhận thấy

khả năng thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2 đạtcực đại ở pH môi trường là 5

Kết quả hình 4.4 cho thấy từ pH 4,5 đến 5 hàm lượng acid amin tăng vàđạt giá trị lớn nhất tại pH 5 (4,99 g/l) Nếu tiếp tục tăng độ pH lên 5,5 và 6 thìhàm lượng acid amin giảm chỉ còn (4,39 g/l) và (3,56 g/l), cho thấy khi thủyphân trong môi trường pH quá cao thì khả năng thủy phân protein giảm nên sảnphẩm tạo thành cũng giảm

Kết quả thu được ở hình 4.3 cho thấy hàm lượng đạm tổng số và hàmlượng acid amin thu được thay đổi theo pH của quá trình thủy phân Vì pH ảnhhưởng tới vận tốc phản ứng của enzyme, do trung tâm hoạt động của enzymegồm các nhóm có chức năng ion hóa, nếu thay đổi pH của môi trường sẽ dẫn

37 3

7

đến sự thay đổi trạng thái ion hóa của chúng nên làm thay đổi hoạt động thủyphân của chúng [16].

Kết quả phân tích ANOVA cũng chỉ rõ khả năng protein đậu nành của chế

phẩm Aspergillus oryzae N2 đạt giá trị cao nhất ở pH 5 Hàm lượng đạm tổng sốcủa các mẫu tạo thành ở các môi trường pH thủy phân khác nhau có sự sai khác

ở mức có ý nghĩa p<0,05

Theo Lê Nguyễn Đoan Duy và cộng sự thì Aspergillus oryzae N2 sinhtổng hợp protease đạt hoạt tính tổng cao nhất điều kiện môi trường bao gồm70% cám : 25% trấu : 5% gelatin bổ sung làm cơ chất cảm ứng, bổ sung 1 mL

(trên 40 mL môi trường) huyền phù bào tử Aspergillus oryzae với mật số 5.106

cfu/mL, độ ẩm 60%, nhiệt độ ủ 450C, thời gian 42 giờ Chế phẩm protease thểhiện hoạt tính cao nhất trong khoảng pH dung dịch đệm là 5 và thủy phânprotein tốt nhất, với 50 phút trong 1ml dung dịch enzyme thì hàm lượng proteintạo thành là 0,082 mg/ml [2]

Kết quả của chúng tôi cũng trùng hợp với kết quả nghiên cứu của WilfredF.M, Roling khi nghiên cứu sản xuất nước tương lên men truyền thống ởIndonesia (1995) [38]

Dựa trên cơ sở kết quả nghiên cứu thu được chúng tôi chọn pH tối thích

cho quá trình thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N 2 là

5 để sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo

4.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân protein đậu

nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường

cám-gạo

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân Với mọi phảnứng hóa học khi nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng Đối với enzyme trong giớihạn chưa biết khi nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng sẽ tăng, tuy nhiên khi nhiệt độtăng tới một mưc độ nào đó sẽ tác dụng ngược trở lại làm giảm vận tốc phản ứng

tổng số và acid amin để chọn ra nhiệt độ thủy phân thích hợp Kết quả thể hiện ởhình 4.5.

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự thay đổi hàm lượng đạm tổng số

và hàm lượng acid amin

(số liệu có số mũ khác nhau biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa với p<0,05)Kết quả ở hình 4.5 cho thấy khả năng thủy phân tăng khi nhiệt độ tăng và đạtgiá trị cực đại tại nhiệt độ 550C với giá trị đạm tổng số đạt được là (9,94 g/l), sau đókhả năng thủy phân giảm khi tăng nhiệt độ lên 600C, do hoạt động xúc tác củaenzyme giảm khi tăng nhiệt độ Nguyên nhân sự giảm hoạt độ của enzyme có thểđược giải thích là do enzyme protease có bản chất là protein nên khi nhiệt độ tăngđến mức cao làm cho protein bị biến tính làm cho vận tốc phản ứng sẽ giảm xuốngđồng thời làm cho hoạt độ xúc tác của enzyme cũng bị giảm chỉ còn (7,42 g/l)

Tương tự kết quả ở trên, kết quả hàm lượng acid amin tạo thành cũng phụthuộc vào khả năng thủy phân protein, hàm lượng acid amin đạt giá trị cao nhất

ở nhiệt độ 550C (5,13 g/l)

Kết quả phân tích ANOVA cho thấy ở nhiệt độ 550C đạt giá trị cao nhất

và ở các mức nhiệt độ khác nhau thì sự sai khác có ý nghĩa p<0,05

Theo kết quả nghiên cứu của Ruann Janser Soares de Castro và Helia

Harumi Sato khi nghiên cứu protease từ Aspergillus oryzae cho rằng đặc tính

sinh hóa và ứng dụng Biocatalyst như là một chất tiềm năng cho hoạt độngchống oxi hóa trong sản xuất thủy phân protein, kết luận ở nhiệt độ 550C là nhiệt

độ thủy phân tốt nhất [22]

Từ kết quả nghiên cứu về khả năng thủy phân protein đậu nành từ chế

phẩm Aspergillus oryzae N 2 ở trên chúng tôi chọn nhiệt độ 550C để nghiên cứutiếp theo

4.3 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN

4.3.1 Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung vào nguyên liệu đến quá trình lên men

Trong sản xuất nước tương, sau khi thủy phân, khối mốc được phối trộncùng nước muối Trong dịch muối, các hệ enzyme có trong khối mốc hoạt động,thủy phân tinh bột, protein thành các dạng đường, acid amin Việc bổ sung tỷ lệnước ảnh hưởng mạnh tới chất lượng sản phẩm cuối Nếu bổ sung quá nhiều

39 3

9

nước dẫn đến hàm lượng chất dinh dưỡng trong dịch lên men giảm, chất lượnggiảm Nếu bổ sung quá ít nước, hoạt lực enzyme trong khối dịch giảm, dẫn đếnchất lượng cũng giảm, đồng thời giá thành sản phẩm tăng lên do sẩn phẩm thuhồi được thấp [1].

Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát lượng nước bổ sung ở các tỷ lệ nước

so với nguyên liệu : 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 Lên men ở nhiệt độ 300C trong 15 ngày,

cứ 5 ngày tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu như: đạm tổng số, acid amin

Bảng 4.1 Kết quả ảnh hưởng tỷ lệ nước bổ sung đế sự thay đổi

Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung đến sự thay đổi

hàm lượng acid amin

Thời gian (ngày) 1:1 2:1 Acid amin 3:1 4:1

bị chậm nên các chỉ tiêu dinh dưỡng của nước tương thấp

Với tỷ lệ lượng nước bổ sung là 3:1 và 4:1 thì dịch loãng, màu không đẹp,các chỉ tiêu chất lượng giảm

Qua bảng 4.1 và 4.2 chúng tôi nhận thấy hàm lượng đạm tổng số và hàmlượng acid amin đạt giá trị cao nhất tại tỷ lệ nước bổ sung 2:1 so với nguyên liệu