protein đậu nành của chế phẩm Aspergilus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường cám-gạo
Để xác định thời gian thủy phân thích hợp nhất bằng cách tiến hành thủy phân đậu nành với tỷ lệ chế phẩm Aspergillus oryzae N2 4%, nhiệt độ 550C, ở các mức thời gian khác nhau là: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ. Tiến hành xác
353 3
định hàm lượng đạm tổng số và acid amin, để chọn ra thời gian thủy phân thích hợp. Kết quả thể hiện ở hình 4.3.
Hình 4.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến sự thay đổi hàm lượng đạm tổng số và hàm lượng acid amin
(số liệu có số mũ khác nhau biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa với p<0,05) Dựa vào kết quả được trình bày ở hình 4.3 cho thấy ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phân protein từ chế phẩm Aspergillus oryzae N2 tăng dần trong khoảng thời gian 24-72 giờ, hàm lượng đạm tổng số đạt giá trị cao nhất tại 72 giờ là (9,94 g/l). Sau đó quá trình thủy phân giảm dần nếu kéo dài thời gian thủy phân lên 96 giờ.
Tương tự cho thấy hàm lượng acid amin tăng theo thời gian thủy phân và đạt giá trị cao nhất ở 72 giờ (5,27 g/l). Nếu như kéo dài thời gian tới 96 giờ thì hàm lượng nitơ acid giảm chỉ còn (4,76 g/l).
Kết quả thu được ở hình 4.3 cho thấy thời gian thủy phân đạt giá trị thấp nhất tại 24 giờ, ở thời điểm này quá trình thủy phân chỉ mới bắt đầu xảy ra nên chưa được thủy phân hoàn toàn. Khi tăng thời gian thủy phân từ 24 giờ đến 72 giờ thì hiệu suất của quá trình thủy phân tăng, ở thời điểm này thì các enzyme của chế phẩm Aspergillus oryzae đã thủy phân protein của đậu nành triệt để hơn, nếu tiếp tục kéo dài thời gian thủy phân thì hiệu suất của quá trình giảm do lúc này hàm lượng cơ chất giảm làm cho vận tốc của enzyme giảm [16].
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của Jarun Chutmanop và cộng sự (2008) khi nghiên cứu sản xuất protease bởi
Aspergillus oryzae trong quá trình lên men trạng thái rắn sử dụng chất agroindustrial, thời gian thủy phân protein đâu nành thích hợp nhất là 72 -84 giờ, ở thời gian này nấm mốc Aspergillus oryzae sản sinh ra enzyme protein có hoạt lực cao nhất [23].
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy sự thủy phân đạt giá trị cao nhất tại thời gian thủy phân 72 giờ. Ở những thời gian thủy phân khác nhau thì sự sai khác có ý nghĩa p<0,05.
Qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng thời gian thủy phân protein đậu nành thích hợp nhất là 72 giờ, kết quả này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.2.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến khả năng thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường cám-gạo
Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường, mỗi hệ ezym chỉ hoạt động mạnh nhất ở vùng pH xác định gọi là pH tối thích của enzyme [16]. Trong sản xuất nước tương protease đóng vai trò quan trọng để thủy phân protein của nguyên liệu. Vì vậy phải chọn pH tối thích cho enzyme hoạt động mạnh. Ngoài ra pH có ảnh hưởng nhiều tới vận tốc phản ứng của enzyme do trung tâm hoạt động của enzyme gồm các nhóm có chức năng ion hóa, nếu thay đổi pH của môi trường thì ảnh hưởng tới trạng thái ion hóa của chúng [16].
Do đó chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng
thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2 ở các mức pH
khác nhau là 4,5; 5; 5,5; 6 và thủy phân ở nhiệt độ 550C trong 3 ngày. Sau đó xác định hàm lượng đạm tổng số, acid amin. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH lên khả năng thủy phân protein đậu nành được thể hiện ở hình 4.4
Hình 4.4. Ảnh hưởng của pH đến sự thay đổi hàm lượng đạm tổng số và hàm lượng acid amin
(số liệu có số mũ khác nhau biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa với p<0,05) Kết quả hình 4.4 cho thấy khả năng thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2 tăng từ 4,5 đến 5 và đạt giá trị lớn nhất tại pH = 5 với hàm lượng đạm tổng số (9,94 g/l). Nếu tăng pH lên 5,5 và 6 thì hàm lượng đạm tổng số giảm chỉ còn (9,15 g/l) và (8,59 g/l). Qua đó chúng tôi nhận thấy
khả năng thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2 đạt
cực đại ở pH môi trường là 5.
Kết quả hình 4.4 cho thấy từ pH 4,5 đến 5 hàm lượng acid amin tăng và đạt giá trị lớn nhất tại pH 5 (4,99 g/l). Nếu tiếp tục tăng độ pH lên 5,5 và 6 thì hàm lượng acid amin giảm chỉ còn (4,39 g/l) và (3,56 g/l), cho thấy khi thủy phân trong môi trường pH quá cao thì khả năng thủy phân protein giảm nên sản phẩm tạo thành cũng giảm.
Kết quả thu được ở hình 4.3 cho thấy hàm lượng đạm tổng số và hàm lượng acid amin thu được thay đổi theo pH của quá trình thủy phân. Vì pH ảnh hưởng tới vận tốc phản ứng của enzyme, do trung tâm hoạt động của enzyme gồm các nhóm có chức năng ion hóa, nếu thay đổi pH của môi trường sẽ dẫn
373 3
đến sự thay đổi trạng thái ion hóa của chúng nên làm thay đổi hoạt động thủy phân của chúng [16].
Kết quả phân tích ANOVA cũng chỉ rõ khả năng protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2 đạt giá trị cao nhất ở pH 5. Hàm lượng đạm tổng số của các mẫu tạo thành ở các môi trường pH thủy phân khác nhau có sự sai khác ở mức có ý nghĩa p<0,05.
Theo Lê Nguyễn Đoan Duy và cộng sự thì Aspergillus oryzae N2 sinh
tổng hợp protease đạt hoạt tính tổng cao nhất điều kiện môi trường bao gồm 70% cám : 25% trấu : 5% gelatin bổ sung làm cơ chất cảm ứng, bổ sung 1 mL
(trên 40 mL môi trường) huyền phù bào tử Aspergillus oryzae với mật số 5.106
cfu/mL, độ ẩm 60%, nhiệt độ ủ 450C, thời gian 42 giờ. Chế phẩm protease thể
hiện hoạt tính cao nhất trong khoảng pH dung dịch đệm là 5 và thủy phân protein tốt nhất, với 50 phút trong 1ml dung dịch enzyme thì hàm lượng protein tạo thành là 0,082 mg/ml [2].
Kết quả của chúng tôi cũng trùng hợp với kết quả nghiên cứu của Wilfred F.M, Roling khi nghiên cứu sản xuất nước tương lên men truyền thống ở Indonesia (1995) [38].
Dựa trên cơ sở kết quả nghiên cứu thu được chúng tôi chọn pH tối thích cho quá trình thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2 là 5 để sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.
4.2.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2 nuôi cấy trên môi trường cám- gạo
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân. Với mọi phản ứng hóa học khi nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng. Đối với enzyme trong giới hạn chưa biết khi nhiệt độ tăng vận tốc phản ứng sẽ tăng, tuy nhiên khi nhiệt độ tăng tới một mưc độ nào đó sẽ tác dụng ngược trở lại làm giảm vận tốc phản ứng do enzyme bị biến tính [16].
Nhiệt độ thích hợp sẽ giúp cho sự phát triển và chuyển hóa của vi sinh vật tối ưu, làm tăng nhanh tốc độ khuếch tán vật chất từ đậu nành ra môi trường thủy phân, tạo điều kiện cho chế phẩm Aspergillus oryzae N2 thủy phân protein đậu nành cao. Do đó muốn khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự thủy phân protein đậu nành của chế phẩm Aspergillus oryzae N2, chúng tôi tiến hành thực hiện thủy phân ở các mức nhiệt độ khác nhau: 450C, 500C, 550C và 600C, với các điều kiện thủy phân đã khảo sát ở các thí nghiệm trên, xác định hàm lượng đạm
tổng số và acid amin để chọn ra nhiệt độ thủy phân thích hợp. Kết quả thể hiện ở hình 4.5.
Hình 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự thay đổi hàm lượng đạm tổng số và hàm lượng acidamin
(số liệu có số mũ khác nhau biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa với p<0,05) Kết quả ở hình 4.5 cho thấy khả năng thủy phân tăng khi nhiệt độ tăng và đạt giá trị cực đại tại nhiệt độ 550C với giá trị đạm tổng số đạt được là (9,94 g/l), sau đó
khả năng thủy phân giảm khi tăng nhiệt độ lên 600C, do hoạt động xúc tác của
enzyme giảm khi tăng nhiệt độ. Nguyên nhân sự giảm hoạt độ của enzyme có thể được giải thích là do enzyme protease có bản chất là protein nên khi nhiệt độ tăng đến mức cao làm cho protein bị biến tính làm cho vận tốc phản ứng sẽ giảm xuống đồng thời làm cho hoạt độ xúc tác của enzyme cũng bị giảm chỉ còn (7,42 g/l).
Tương tự kết quả ở trên, kết quả hàm lượng acid amin tạo thành cũng phụ thuộc vào khả năng thủy phân protein, hàm lượng acid amin đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 550C (5,13 g/l).
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy ở nhiệt độ 550C đạt giá trị cao nhất
và ở các mức nhiệt độ khác nhau thì sự sai khác có ý nghĩa p<0,05.
Theo kết quả nghiên cứu của Ruann Janser Soares de Castro và Helia Harumi Sato khi nghiên cứu protease từ Aspergillus oryzae cho rằng đặc tính sinh hóa và ứng dụng Biocatalyst như là một chất tiềm năng cho hoạt động chống oxi hóa trong sản xuất thủy phân protein, kết luận ở nhiệt độ 550C là nhiệt độ thủy phân tốt nhất [22].
Từ kết quả nghiên cứu về khả năng thủy phân protein đậu nành từ chế phẩm Aspergillus oryzae N2 ở trên chúng tôi chọn nhiệt độ 550C để nghiên cứu tiếp theo.