Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào của chủng nấm mốc phân lập từ quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống

Amylase là hệ các enzyme thủy phân tinh bột và các polysaccharid đơn chất tương tự như: dextrin, glicogen... Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác. Trong Công Nghệ Thực Phẩm amylase được ứng dụng: trong sản xuất bánh mì có tác dụng tăng độ ngọt và mùi vị của sản phẩm, trong sản xuất cồn để đường hóa tinh bột, chế biến dextrin với dịch đường để sản xuất thức ăn cho người già và trẻ con, dùng trong sản xuất mật ngô... Amylase chiếm khoảng 25% thị trường enzyme, đã thay thế hầu như hoàn toàn việc thủy phân tinh bột bằng hóa chất trong các ngành công nghiệp. Amylase được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (nấm mốc, nấm men, vi khuẩn) đến thực vật (đại mạch, khoai lang...) và động vật (gan, ruột, tụy...). Trong đó amylase thu nhận từ vi sinh vật có nhiều tính ưu việt do chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, thành phần môi trường nuôi cấy dễ kiếm và rẻ tiền. Đồng thời, chúng ta có thể dễ dàng điều khiển các điều kiện tối ưu của quá trình nuôi cấy. Điều đó cho phép thu được các enzyme theo mong muốn với hoạt tính cao.

Amylase được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật(nấm mốc, nấm men, vi khuẩn) đến thực vật (đại mạch, khoai lang ) và độngvật (gan, ruột, tụy ) Trong đó amylase thu nhận từ vi sinh vật có nhiều tính

ưu việt do chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, thành phần môi trườngnuôi cấy dễ kiếm và rẻ tiền Đồng thời, chúng ta có thể dễ dàng điều khiểncác điều kiện tối ưu của quá trình nuôi cấy Điều đó cho phép thu được cácenzyme theo mong muốn với hoạt tính cao

Rượu là sản phẩm đã được sản xuất từ rất lâu trong các hộ gia đình vớinguyên liệu để nấu rượu thường là gạo, nếp Mỗi loại nguyên liệu tạo thànhmột hương vị đặc trưng của rượu Để sản xuất rượu thì người ta thường sửdụng hỗn hợp vi sinh vật làm nhiệm vụ chuyển hoá tinh bột thành đường(nấm mốc) nhờ hệ enzyme amylase, sau đó chuyển đường thành rượu (nấmmen) và còn có một số vi khuẩn tạo hương cho sản phẩm

Dựa trên cơ sở này chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào của chủng nấm mốc phân lập từ quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống”

Nội dung của đề tài này là:

+ Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợpamylase ngoại bào cao từ quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống

+ Khảo sát một số yếu tố nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổnghợp amylase ngoại bào.

+ Khảo sát tính chất của chế phẩm enzyme thu được nhằm cung cấpnhững thông số kỹ thuật để áp dụng vào thực tế sản xuất hoặc để thực hiệnnhững nghiên cứu tiếp theo

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Tổng quan về rượu gạo lên men truyền thống

Rượu được làm từ nguyên liệu gạo là sản phẩm đã xuất hiện từ rất lâukhông chỉ ở nước ta mà còn ở một số nước Châu Á khác như: Trung Quốc,Hàn Quốc, Nhật Bản Mỗi nước có một phương thức sản xuất khác nhau tạonên các sản phẩm truyền thống có mùi vị đặc trưng riêng

Ở nước ta rượu gạo được sản xuất ra theo nhiều phương pháp khácnhau, trong đó phương pháp lên men rượu truyền thống bằng bánh men hiệnnay vẫn được dân gian sử dụng nhiều Phương pháp này có những đặc điểmkhác với những phương pháp khác như:

- Nấm mốc và nấm men được nuôi cấy và phát triển cùng một lúc trênmôi trường tinh bột sống và có thêm những vị thuốc bắc

- Nguyên liệu tinh bột không nhất thiết phải hồ hóa thành dung dịch màchỉ cần làm chín

- Quá trình đường hóa và rượu hóa tiến hành cùng một lúc

Phần lớn các vùng miền cả nước hiện nay vẫn thường gọi tên rượu đơn

thuần gắn với tên của địa phương sản xuất rượu (như rượu làng Vân, rượu Bầu

Đá, rượu Mẫu Sơn, rượu Xuân Thạnh, rượu Phú Lộc, rượu đế Gò Đen v.v ) Tất

cả các sản phẩm này có chất lượng khác nhau phụ thuộc nhiều vào nguồnnguyên liệu và nguồn bánh men ở địa phương nhưng nhìn chung đều có sơ đồsản xuất như hình 1.1

Hình 1.1: Quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống

 Thuyết minh quy trình

- Hiện nay, có hai phương pháp sản xuất rượu:

+ Có qua chưng cất (rượu trắng): nguyên liệu thường là gạo tẻ

+ Không qua chưng cất (rượu vang gạo): nguyên liệu thường là gạo nếp

 Nguyên liệu

Thường sử dụng các loại gạo có hàm lượng tinh bột cao thông dụngnhư gạo tẻ, gạo nếp

+ Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo [6]:

Gạo nếp: Nước 14%, Glucid 79.4%, Lipid 1.5% và protein 8.2% trong

đó Protein của gạo nếp chủ yếu là glutein (oryzaine) và glubuline ngoài ra

đường, cellulose và hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin.Ngoài ra còn chứa một số vitamin như B1, B2, B6, PP và E.

Gạo tẻ: Nước 13.84%, Glucid 77.55%, Protein 7.35%, Lipid 0.52%,cellulose 0.18% và muối khoáng 0.54%

Bánh men rượu được chế từ nhiều loại thảo dược (thuốc Nam, thuốcBắc) như cam thảo, quế chi, gừng, hồi, thạch xương bồ, bạch chỉ, xuyênkhung, rễ ớt Nhào trộn hỗn hợp với bột gạo, thậm chí cả bồ hóng và ủ ở

300C trong khoảng 1 tuần Trong suốt thời gian này sẽ có một số vi sinh vậtphát triển ở trong bánh men

Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu về hệ vi sinh vật có trong bánhmen thuốc bắc: N.T.P Dung và cộng sự (2005) [22] đã phân lập được từ bánhmen 119 chủng vi sinh vật bao gồm: 53 chủng mốc, 51 chủng men và 15chủng vi khuẩn Các chủng nấm mốc phân lập có nhiều tính chất tốt như

Amylomyces rouxii, Amylomyces aff Rouxii (một hình thức không điển hình

của Amylomyces rouxii), Rhizopus oligosporus và Rhizopus oryzae Các chủng nấm men phân lập được có đặc tính lên men tốt như Saccharomyces

Thanh và cộng sự (2008) [29] đã phân lập và định danh được 13 loài nấmmốc và nấm men, 23 loài vi khuẩn, bao gồm vi sinh vật sản xuất amylase (chủ

yếu là các loài nấm mốc Rhizopus oryzae, R.microsporus ngoài ra còn có các loài vi sinh vật khác như Absidiacorymbifera, Amylomyces sp.,

cerevisiae, Issatchenkia sp., Pichia anomala, Candida tropicalis, P.ranongensis, Clavispora lusitaniae), một số vi khuẩn sản sinh acid lactic

(Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, L.brevis, Weissella

confuse và W.paramesenteroides), các vi khuẩn sản sinh acid acetic

(Acetobacter orientalis, A.pasteurianus) và một vài loài Bacillus sản xuất amylase (Bacillus subtilis, B.circulans, B.amyloliquefaciens,

B.sporothermodurans).

Nấu chín: Gạo nguyên liệu được ngâm nhằm rửa sạch chất bẩn bám bênngoài hạt, đồng thời làm cho hạt gạo mềm, trương nở giúp dễ dàng cho quá

trình nấu Sau khi để ráo, gạo được cho vào nồi, thêm nước và nấu chín Tỉ lệgạo: nước khoảng 1: 1 theo thể tích.

 Làm nguội: Cơm sau khi nấu chín được trải đều trên một bề mặt

phẳng để làm nguội xuống nhiệt độ thích hợp cho việc trộn bánh men rượu.Bánh men rượu được trộn vào bằng cách bóp nhỏ, rắc đều lên bề mặt lớp cơmvới tỷ lệ thích hợp tùy theo hướng dẫn trên từng loại men Sau đó cho tất cảvào khạp lớn, đậy nắp để bắt đầu quá trình lên men rượu

 Lên men: Quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ thường (khoảng 28

-32oC) Sau 2 ngày đầu lên men, có thể bổ sung nước vào khối lên men với tỷ

lệ nước: cơm khoảng 3: 1, sau đó đậy nắp và tiếp tục lên men thêm khoảng 1ngày nữa

Chưng cất: Khi quá trình lên men kết thúc, ta tiến hành chưng cất để

thu được rượu thành phẩm Tùy theo yêu cầu của khách hàng mà ta có thểtiến hành pha trộn các loại rượu thu được ở các khoảng thời gian chưng cấtkhác nhau để tạo ra rượu có nồng độ cao thấp khác nhau

1.2.Tổng quan về amylase

1.2.1 Giới thiệu về amylase

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Cácenzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân Amylase thủy phân các phân tửtinh bột để cho ra nhiều sản phẩm khác nhau bao gồm những dextrin và cácpolyme kích thước nhỏ hơn được tạo thành từ các đơn vị glucose [30]

1.2.2 Phân loại amylase

Theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, người ta phân chiaamylase làm 3 loại: α-amylase, β-amylase và γ-amylase (hay còn gọiglucoamylase)

1.2.2.1 α-amylaseamylase

α-amylase (endo-1,4-α-D-glucan glucohydrolase, E.C.3.2.1.1) là mộttrong những enzym thương mại quan trọng nhất α-amylase xúc tác liên kếtthủy phân liên kết α-1,4 glucoside nội mạch ở bất kỳ vị trí nào trong phân tửtinh bột Với cơ chất là amylose, α-amylase cho sản phẩm thủy phân chủ yếu

là maltose (khoảng 87%) và một ít glucose (13%) Với cơ chất làamylopectin, α-amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 chứ không thủy phân liênkết 1,6 glucoside, sản phẩm tạo thành là các dextrin phân tử thấp không chophản ứng màu với iod, maltose, glucose và izomaltose.

α-amylase hầu như không tác dụng lên tinh bột nguyên thể mà chỉ tácdụng mạnh lên tinh bột đã hồ hóa Quá trình thủy phân xảy ra qua nhiều giaiđoạn:

- Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số liên kết trong phân

tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng dextrin, độ nhớt của hồ tinh bộtgiảm nhanh

- Giai đoạn hai (giai đoạn đường hóa): các dextrin vừa được tạo thành

bị thủy phân, tiếp tục tạo thành các dextrin có phân tử thấp hơn, maltose,izomaltose và glucose

Tuy nhiên thông thường trong một thời gian ngắn (30 - 60 phút), amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp và một ítđường maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặctrưng của nó

α-α-amylase tương đối bền với tác dụng nhiệt

α-amylase của nấm mốc có thể xúc tác thủy phân tinh bột ở 50 - 520C α-amylase của mầm hạt hoạt động tốt ở nhiệt độ 58 - 600C α-amylasecủa vi khuẩn có tính bền nhiệt cao, có thể giữ được hoạt tính ở 70 - 900C.Tính bền nhiệt của α-amylase là do sự có mặt của canxi trong phân tử enzym,

ở đây canxi giữ vai trò ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzym

α-amylase thường thể hiện hoạt tính trong vùng axit yếu, α-amylase củanấm mốc hoạt động mạnh ở pH 4.5 - 4.9; của vi khuẩn ở pH 5.9 - 6.1 Nếu

pH< 3, đa số α-amylase bị vô hoạt hoàn toàn, trừ α-amylase của Asperillus

niger có thể chịu được pH 2.5 - 3.8.

Những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp α-amylase có ý nghĩa

công nghiệp: Bacillus subtilis, Bacillus lichenifomis, Asperillus oryzae [1].

1.2.2.2 β-amylaseamylase

β-amylase (α-1,4-glucan maltosehydrolase, EC 3.2.1.2) là một enzymexúc tác sự thủy phân liên kết α–1,4 glucoside của phân tử tinh bột và cácpolisaccarit tương tự

β-amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên thể, chỉ tác dụng lên tinhbột đã hồ hóa Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khikhông có canxi

β-amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, β-amylase bị vôhoạt hoàn toàn ở nhiệt độ 700C, song trong dịch nấu nhiệt độ tối thích lại là 60

Đa số glucoamylase đã biết đều thể hiện hoạt tính tối đa ở vùng pH 3.5– 5.5 Nhiệt độ hoạt động tối thích của glucoamylase 50 - 600C Hầu hết cácglucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 700C Những chủng vi sinhvật có khả năng sinh tổng hợp glucoamylase có ý nghĩa công nghiệp [1]:

+ Nấm mốc: Aspergillus (Asp Awamori, Asp Niger), Rhizopus.

+ Nấm men: Endomycopsis.

1.2.3 Nguồn thu nhận amylase

Trong thiên nhiên enzyme có ở hầu hết ở mọi thực vật, động vật và visinh vật Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài vi sinh vật mới lànhững đối tượng có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase,

do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong nhữngđiều kiện xác định

1.2.3.1 Nguồn thực vật

Ở thực vật, amylase thường tìm thấy nhiều ở các cơ quan dự trữ Người

ta thu nhận α-amylase từ các hạt hòa thảo nảy mầm như thóc hoặc đại mạch,β-amylase từ củ khoai lang [1] Amylase thu được từ nước chiết của một sốđối tượng thực vật khi sử dụng trong sản xuất làm cho sản phẩm có mùi vịđặc trưng riêng Do vậy, được sử dụng rộng rãi trong một số ngành côngnghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm [10] Vào năm 1999, tác giả CaoVăn Nguyên và Nguyễn Quốc Khang đã tách chiết thành công amylase từ hạtcây Quina [7]

.2.3.2 Nguồn động vật

Ở các loài động vật, phần lớn amylase được tiết ra từ tuyến nước bọt vàtuyến tụy Amylase cũng có trong các tụy tạng như gan, ruột Ngoài ra,amylase còn có trong huyết thanh

Để thu amylase người ta thường dùng các giống nấm mốc Aspergillus,

Rhizopus Nhiều loại thuộc các giống này (Asp Oryzae, Asp.niger, Asp usamii, Asp awamori, Asp batalae, Rhizopus delemar, Rh tonnesis, Rh neveus, Rh japonicum, Rh fonkinensis, Rh topninensis) và một số loài của Neurospora và Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ không những chỉ α-

amylase mà cả glucoamylase [9]

 Amylase từ nấm men và giả nấm men

Amylase cũng được thu nhận từ nấm men và giả nấm men thuộc các

giống Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Ikuo Matsui và cộng sự(1990) [19], Helena Ebertová (1964) [18], Dr Y Hattori (1961) [14])

 Amylase từ vi khuẩn

Amylase có thể được thu nhận từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau.Collins BS, Kelly CT cùng cộng sự (1993) [12] phân lập chủng

Thermomonospora curvata NCIB 10081, Chung Yc và Kobayashi T (1995)

[13] cũng tìm được chủng T profundus DT 5432 đều có khả năng sinh

α-amylase ngoại bào cao

1.2.4 Sản xuất chế phẩm amylase từ vi sinh vật [1]

1.2.4.1 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống

Chọn chủng thích hợp là bước đầu tiên khi muốn sản xuất enzym từ visinh vật Sau khi sàng lọc từ hàng trăm chủng và loài vi sinh vật khác nhau,chủng có hiệu suất sinh enzym cao, không lây bệnh, không sinh độc tố, thểhiện khả năng ổn định sinh học cao sẽ được lựa chọn

Người ta có thể tiến hành phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thểdùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thayđổi đặc tính di truyền của vi sinh vật tạo thành các dạng biến chủng có khảnăng tổng hợp đặc biệt cao một loại enzyme nào đó Bằng nhiều phương phápkhác nhau hiện nay trên thế giới người ta đã tạo và đưa vào sản xuất hàng loạtbiến chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cao hơn hẳn chủng gốcban đầu như: phương pháp gây đột biến, biến nạp, tiếp hợp gen, tải nạp

Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần khiết,

đã được kiểm tra đầy đủ về đặc tính sinh hóa và cần đặc biệt lưu ý đến điềukiện bảo quản giống Sỡ dĩ phải bảo quản giống vì trong quá trình giữ giống

có thể giống sẽ bị thoái hóa do bị biến dị ngẫu nhiên hoặc do giống vẫn tiếptục phát triển nên môi trường nuôi cấy tích tụ các sản phẩm trao đổi chất cóthể có ảnh hưởng không tốt đến những đặc tính của giống Một số phươngpháp bảo quản giống thông thường là: phương pháp cấy truyền, phương pháplàm khô, phương pháp đông khô, phương pháp làm lạnh đông trong nitơ lỏng

1.2.4.2 Lựa chọn môi trường nuôi vấy vi sinh vật tổng hợp amylase

Thành phần môi trường thích hợp cho một chủng vi sinh vật sinhamylase trước hết phải đáp ứng sự tăng tưởng của chủng đó Tuy nhiên,

không phải lúc nào sự phát triển tốt của vi sinh vật cũng đảm bảo hiệu suấtsinh enzyme tốt Thông thường, hiệu suất sinh enzyme tốt nhất trong môitrường mà vi sinh vật phát triển một cách vừa phải

Thành phần môi trường bao gồm:

- Nguồn cacbon (tinh bột, glucose, rỉ đường, siro ngô, cám mỳ ),

- Nguồn nitơ (protein thủy phân, gelatin, casein, các nuối amoni ),

- Các chất kích thích sinh trưởng (cao nấm, nước chiết ngô )

- Và muối khoáng

Nguồn cacbon thường là carbonhydrat Tùy vào chủng vi sinh vật màcác nguồn carbonhydrat khác nhau có khả năng kích thích hoặc ức chế quátrình sinh tổng hợp amylase

Nguồn nitơ có thể là các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ Nguồn nitơ hữu

cơ cũng có thể là các nguyên liệu giàu protein như cao ngô, bột đậu tương,khô đậu, khô lạc Ngoài ra một số acid amin, các bazơ nitơ cũng được bổsung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Ngoài nguồn cacbon và nitơ, các nguyên tố khoáng cũng ảnh hưởng rõrệt đến đến quá trình sinh tổng hợp enzyme Các nguyên tố này bao gồmnguyên tố vi lượng (Fe, Cu, Zn, Co ) và nguyên tố đa lượng Chúng thường

có trong nước hoặc trong thành phần hữu cơ khác của môi trường nên khôngcần bổ sung hoặc chỉ bổ sung ở dạng vết

1.2.4.3 Phương pháp nuôi cấy thu nhận enzym từ vinh vật

Để thu được enzyme có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật khácnhau về nguyên tắc Phương pháp bề mặt và phương pháp nuôi bề sâu haycòn gọi là phương pháp chìm, trong môi trường chìm có thể có phương phápnuôi chìm hai bước:

+ Nuôi cấy trên bề mặt ( môi trường cám gạo)

+ Nuôi cấy chìm (môi trường dung dịch lỏng )

+ Nuôi cấy chìm hai bước

 Phương pháp nuôi bề mặt

Trong phương pháp nuôi bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt môitrường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng Các chất dinhdưỡng này thường là các nguyên liệu tự nhiên như cám, các chất thải bỏ củacông nghệ thực phẩm hoặc hỗn hợp của nhiều chất Trong môi trường dinhdưỡng người ta thường cho thêm các chất cảm ứng cần thiết cho sự sinh tổnghợp enzyme nào đó hoặc một số chất dinh dưỡng bổ sung nguồn nitơ,photpho như nước chiết ngô, khoai tây, dịch tự phân nấm men Để đảm bảo

độ xốp của môi trường cần có các chất làm xốp như trấu với tỷ lệ 10 - 20%.Trước khi gieo cấy vi sinh vật, môi trường cần được thanh trùng để đảm bảokhông bị nhiễm vi sinh vật lạ trong khi nuôi

Phương pháp nuôi bề mặt thường thích hợp để nuôi các loại nấm mốc

vì khả năng phát triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm

 Phương pháp nuôi chìm

Trong phương pháp nuôi chìm vi sinh vật phát triển trong môi trườnglỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục, nguồn cacbon thường dùng trongphương pháp này là tinh bột, các chất thải bỏ có đường như rỉ đường và cácvật liệu khác Còn nguồn nitơ người ta hay dùng các nguồn nitơ hữu cơ nhưcao ngô, dịch men bia thủy phân, khô lạc Ngoài ra trong thành phần môitrường cũng cần được bổ sung thêm các chất khoáng Môi trường nuôi cấychìm cần được thanh trùng sau đó làm nguội rồi mới nhân giống Phươngpháp nuôi cấy chìm được sử dụng phổ biến trong sản xuất men bánh mì,protein đơn bào từ nấm men, các enzyme, các acid amin

 Phương pháp nuôi chìm hai bước

Theo phương pháp này các tế bào vi sinh vật được nuôi trong thiết bị

để phát triển tối đa, sau đó được chuyển tới thiết bị lên men sinh tổng hợpenzyme, trong đó thành phần môi trường khác với điều kiện phát triển của visinh vật Phương pháp này có nhiều thuận lợi trong việc kiểm tra và tạo điềukiện tốt cho các pha riêng biệt đó là pha sinh trưởng (trophophase) và pha chếtạo enzyme (idiophase), vì vậy hiệu suất cao

1.2.4.4 Nguyên tắc tách và tinh chế enzyme

Các chế phẩm enzym được sử dụng trong công nghiệp dưới nhiều dạngkhác nhau:

- Canh trường nuôi cấy vi sinh vật trong đó có enzyme được sử dụngtrực tiếp dưới dạng thô Không cần tách tạp chất nếu các tạp chất đó khônggây hại đáng kể đến sản phẩm và kỹ thuật sản xuất

- Trường hợp cần sử dụng enzyme tinh khiết, người ta sẽ tinh chế cácchế phẩm enzyme thô với nhiều mức độ khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng

Enzyme dễ dàng bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của nhiều tác nhân

Do đó, để tránh làm biến tính protein trong quá trình tinh chế enzyme, cầntiến hành nhanh trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian ngắn và môi trường

có pH thích hợp

Không có quy trình chung nào để chiết xuất và tinh chế nhiều loạienzyme khác nhau Tuy nhiên, quá trình tách và tinh chế enzyme thường tuântheo các bước sau:

- Phá vỡ tế bào và chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp đối vớienzyme nội bào hoặc ly tâm tách sinh khối đối với enzym ngoại bào

- Dịch enzyme thu được có thể chứa nhiều loại enzyme, protein khônghoạt động và các tạp chất Vì vậy, để thu được một loại enzyme nào đó ởdạng tinh khiết có thể tiến hành theo nhiều phương pháp như sau:

+ Tách enzym nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ như aceton, rượuetylic hoặc các dung dịch muối trung tính như (NH4)2SO4, NaCl

+ Sắc ký lọc gel hoặc trao đổi ion: kết quả của phương pháp này là cácprotein khác nhau sẽ được tách ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau,trong đó phần chiết chứa enzyme cần thu có nồng độ cao nhất

Sau khi làm sạch cần sấy khô enzyme để bảo quản lâu dài Phươngpháp sấy thường được dùng để sấy enzyme là sấy thăng hoa hoặc sấy chânkhông Các chế phẩm thương mại có thể ở dạng dung dịch bổ sung thêm chấtbảo quản, chất này thường là NaCl

1.2.5 Ứng dụng của amylase

1.2.5.1.Trong sản xuất rượu

Đối với công nghiệp rượu cồn, các enzyme đường hóa có một vai tròquan trọng Chế phẩm enzyme dùng trong sản xuất rượu thường ở dạng thô,không cần thiết phải tinh chế

Nguồn enzyme thường là Aspergillus oryzae, Aspergillus usami,

Aspergillus awamori.

Aspergillus awamori tạo được nhiều glucoamilase hoạt động nhưng lại

có lượng amylase kém hơn Aspergillus oryzae 3 - 4 lần Nhờ có glucoamylase hoạt động cao mà lượng chế phẩm từ Aspergillus awamori cần thiết để dùng

đường hóa giảm bớt đi 2 – 2.5 lần Thường, người ta dùng hỗn hợp 4 phần

canh trường bề mặt của Aspergillus awamori và 1 phần canh trường bề mặt của Aspergillus oryzae để bổ sung lẫn nhau.

Để đường hóa tinh bột có trong nguyên liệu, lượng chế phẩm enzymephải chiếm khoảng 6 – 6.5% lượng tinh bột

Ở các nhà máy rượu Việt Nam thường dùng chế phẩm enzyme từ

Aspergillus usami vì trong chúng thường chứa nhiều glucoamylase hoạt động.

Trong sản xuất rượu, vai trò của glucoamylase rất quan trọng, vìglucoamylase có thể đường hóa tinh bột đến cùng

Hiện nay các chế phẩm amylase của nấm mốc đã thay thế hoàn toànmalt trong công nghiệp rượu

1.2.5.2 Trong sản xuất bia

Trong công nghiệp bia, do ngoài yêu cầu đường hóa sản phẩm còn cầnnhiều yêu cầu khác nữa như vị của dịch lên men, khả năng tạo bọt, giữ bọt, do

đó sự đường hóa chỉ cần tiến hành đến mức vừa phải

Trước đây, người ta dùng malt làm nguyên liệu hạt chủ yếu Hiện nay,người ta đã thay từ 20 - 50% malt bằng các nguyên liệu không phải malt nhưđại mạch chưa nảy mầm hoặc tinh bột ngô đã khử chất béo và dùng các chếphẩm amylase của vi sinh vật, có trường hợp người ta đã thay thế tới 80 -

Để đạt được mục đích này, người ta dùng chế phẩm Aspergillus oryzae.

Khi dùng 50% nguyên liệu phi malt thì phải cho khoảng 1% canh trường

Aspergillus oryzae khô và một ít acid lactic để tạo pH cần thiết cho enzyme

+ Giảm chi phí về năng lượng và lao động

+ Tăng hiệu suất do mức độ thủy phân tinh bột sâu sắc hơn

1.2.5.3 Trong công nghiệp sản xuất glucose và mật tinh bột

Chúng ta đều biết từ tinh bột có thể thu được các phẩm vật đường khác nhau.Khi thủy phân tinh bột bằng acid cũng như bằng enzyme của malt sẽthu được mật glucose hay mật maltose Mật thu được bằng phương phápenzyme (mật maltose) thường chứa nhiều dextrin Mật maltose thường đượcdùng trong sản xuất bánh kẹo và trong sản xuất sản phẩm ăn kiêng cho trẻ con

và người bệnh

Trong sản xuất glucose và mật tinh bột, amylase được ứng dụng rộngrãi và chiếm vị trí quan trọng Với chế phẩm amylase từ vi sinh vật, ngoài mậtmaltose, người ta còn có thể thu được glucose tinh khiết

Việc sử dụng amylase để thủy phân tinh bột trong sản xuất các loại mật

và đường glucose có những ưu điểm cao hơn hẳn phương pháp thủy phân bằngacid vì enzyme có tính đặc hiệu cao có thể cho sản phẩm thuần khiết Hơn nữa,quá trình sản xuất lại đơn giản, dễ điều khiển và cho hiệu suất cao hơn

Hiện nay, ở nhiều nước (Nhật, Mỹ, Canda) người ta đã sử dụng các chếphẩm glucoamylase để sản xuất đường glucose và đã giải quyết được hàngchục vạn tấn glucose hàng năm

Các chế phẩm enzyme glucoamylase dùng để sản xuất glucose khôngcần chứa enzyme glucosiltransferase (là enzyme thường có mặt vớiglucoamylase trong canh trường) vì các enzyme này sẽ gây nên sự tạo thành

các oligosaccharid có liên kết 4 - 6 làm giảm hiệu suất đường glucose và làmcho sản phẩm có vị đắng, do đó cần chọn các chủng vi sinh vật tổng hợpmạnh glucoamylase nhưng lại không tổng hợp glucosiltransferase Người tacũng có thể làm vô hoạt glucosiltransferase có trong các chế phẩmglucoamylase chịu acid bằng cách acid hóa.

Những nấm mốc chứa nhiều glucoamylase là Aspergillus awamori, Rhizopus.

Ngoài ra, amylase còn được dùng trong công nghiệp bánh mỳ [17] vàcông nghiệp giấy [11]

1.3 Tổng quan nấm mốc và đặc tính amylase của nấm mốc

1.3.1 Đặc điểm hình thái và sinh sản của nấm mốc [2]

Nấm mốc là tên chung chỉ các loài nấm hiển vi có cấu tạo sợi, chúng thuộcloại thực vật hạ đẳng có bào tử, không có diệp lục, không có khả năng tổng hợpchất hữu cơ từ khí cacbonic mà sử dụng chất hữu cơ có sẵn để sinh sống

Nấm mốc chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí Vì vậy,chúng thường phát triển trên bề mặt của cơ chất dưới dạng lún phún hình sợi,lớp màng nhện hay khối sợi bông

Nhiều nấm có giá trị lớn trong công nghiệp, chúng được sử dùng trongviệc sản xuất axit hữu cơ, men, chất kháng sinh, vitamin thực phẩm Trái lại,nhiều loại nấm cũng gây nhiều thiệt hại trong việc bảo quản thực phẩm vàhàng công nghiệp khác

 Cấu tạo của nấm

- Đa số nấm có hình sợi phân nhánh, đan kết lại với nhau thành một khốisợi, từng sợi riêng lẻ gọi là sợi nấm và cả toàn bộ các sợi gọi là hệ sợi nấm

- Có hai loại sợi nấm: Sợi nấm có màng ngăn ngang và sợi nấm không

có màng ngăn ngang, trong trường hợp sau toàn bộ hệ sợi nấm chỉ là một tếbào phân nhánh phức tạp

Sợi nấm có màng ngăn Sợi nấm không có màng ngăn

- Một số sợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào cơ chất và hút cácchất dinh dưỡng từ trong đó (khuẩn ty cơ chất), trong khi đó một phần hệ sợinấm phát triển trên bề mặt của cơ chất (khuẩn ty ký sinh) Ở nhiều loài, cácsợi của hệ sợi nấm nằm bên ngoài cơ chất là cơ quan sinh sản Ở một số nấmkhác sợi nấm đan kết lại dày đặc với nhau tạo thành quả thể.

- Cấu tạo tế bào nấm không khác với cấu tạo tế bào của các vi sinh vậtkhác Màng tế bào cấu tạo bởi cellulose hay các chất gần giống với cellulose,

ở nhiều loại nấm trong màng tế bào có chứa chitin Trong tế bào chất cókhông bào và các chất khác Các chất dự trữ thường gặp ở nấm là glicogen,hạt volutin và các giọt mỡ Tế bào nấm có 1, 2 hoặc nhiều hạch (nhân) Ởnấm hiện tượng nhiều hạch là rất phổ biến

Hình 1.2: Khuẩn lạc của Aspergillus awamori và Mucor miehei

 Sinh sản của nấm mốc

Một số đặc điểm nổi bật của nấm là có nhiều hình thức sinh sản vànhiều loại cơ quan sinh sản Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử mọc rasợi nấm và sau đó là hệ sợi nấm Mặc dù vậy, bất cứ một đoạn sợi nấm hoặcmột mảnh nào của hệ sợi nấm cũng có thể dùng để sinh sản được Các đoạnnày khi rơi trên môi trường dinh dưỡng thì phát triển và tạo thành một hệ sợinấm mới (Hình 1.3)

Hình 1.3: Hình dạng bào tử của một số chủng nấm mốc

1.3.2 Khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào

Đa số các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp amylase ngoạibào, điển hình là:

+ Aspergillus oryzae: là mốc có màu vàng, bào tử hở, được sử dụng

rộng rãi trong sản xuất tương và nước chấm Đặc điểm của nó là có hệenzyme amylase và protease

+ Aspergillus awamori: là mốc màu xám đen giàu hệ enzyme amylase

và được ứng dụng rộng rãi trong công nhgiệp sản xuất rượu

+ Aspergillus usamii: là mốc màu xám trắng, rất giàu enzyme amylase.

Hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất rượu

Ngoài ra, vẫn còn có một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp

amylase ngoại bào cao như: Aspergillus niger, Mucor rouxii [8]

Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp enzymeamylase từ nấm mốc H Pedersen và J Nielsen (1999) [16] đã nghiên cứu

“Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến việc sản xuất a amylase của Aspergillus oryzae trong điều kiện nuôi dưỡng liên tục”, Febe Francisvà cộng sự (2002)

[15] “Sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng để đánh giá thông số trong quy

trình sản xuất α-amylase bởi Aspergillus oryzae” Trong khi đó Morten

Carlsenvà cộng sự (1996) [21] đã ngiên cứu “Sự phát triển và sản xuất

α-amylase từ Aspergillus oryzae trong quá trình lên men liên tục ”.

1.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi vi sinh vật đến quá trình sinh tổng hợp amylase của nấm mốc [9]

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp amylase ngoạibào của nấm mốc như độ ẩm môi trường, thời gian, không khí, nhiệt độ, pH

 Ảnh hưởng của độ ẩm(w) môi trường

Tốt nhất cho sự hình thành enzym của nấm mốc Asp.oryzae là 58

-60% Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45%nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển.Điều này thật sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích.Cần thông khí liên tục trong suốt thời kỳ sinh trưởng của nấm mốc và còn phụthuộc vào kích thước, chiều dày của lớp môi trường nuôi

 Ảnh hưởng độ ẩm tương đối của không khí

Độ ẩm cho phép từ 80% trở lên đến mức bão hoà tức là 100%W đềuthích hợp cho nấm mốc phát triển Trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩmkhông khí bão hoà để tránh cho môi trường khỏi bị khô

 Ảnh hưởng của không khí

Trong quá trình sinh trưởng của mình vi sinh vật tiêu thụ 25 - 35% chấtdinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2 Vìvậy, cần phải tải nhiệt này bằng thông gió với thông khí vô trùng có độ ẩmtương đối khoảng 100% Chế độ thông khí có thể liên tục, gián đoạn tùy thuộcvào chiều dày môi trường nuôi

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sản xuất amylase là liên quanđến sự phát triển của vi sinh vật Với nấm mốc, hầu hết những nghiên cứu sảnxuất amylase cho thấy nhiệt độ nằm trong vùng giới hạn từ 25 - 370C Lượngamylase tối thích là đạt được ở 30 - 370C đối với Aspergillus oryzae [27] [20].

Ảnh hưởng của thời gian nuôi nấm mốc

Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn thường được xác địnhbằng thực nghiệm Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng sinh vật và sựngừng tổng hợp enzyme mà có thể làm ngừng sinh trưởng của nấm mốc vàobất kỳ lúc nào cần thiết Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vìthường làm giảm hoạt lực của enzyme Hầu hết các chủng nấm mốc

Aspergillus oryzae có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng giờ thứ 24

-36

Ảnh hưởng của pH

pH thích hợp cho nấm mốc là môi trường acid yếu khoảng 5.5 - 6.5.Các môi trường tự nhiên từ cám, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nênkhông cần điều chỉnh Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặcmất hẳn Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sángkhuếch tán trong một vài thế hệ

1.3.4 Đặc tính amylase của nấm mốc [9]

α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bịthương tổn Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân amylase là glucose vàmaltose

α-amylase của nấm mốc không tấn công liên kết α-1,6 glucoside củaamylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thườngkhông giống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là4.0 - 4.8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4.5 - 5.8)

Amylase của nấm mốc khá bền với acid so với amylase từ các nguồn

khác amylase của Aspergillus oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis Ở pH 3.6 và 00C, α-amylase củamalt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút, α-amylase vi khuẩn bị bất hoạtđến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hình như khônggiảm nhiều Trong dung dịch, α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH 5.0 - 5.5,α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH 2.5 -2.8.Ở 0oC và

α-pH 2.5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồnkhác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đốivới tác động nhiệt Nhiệt độ tối thích của amylase nấm mốc thường là 500C và

bị vô hoạt ở 700C

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu cơm sau khi ủ bánh men được lấy theo từng giai đoạn ở các cơ sởsản xuất ở tỉnh Thừa Thiên Huế:

Giai đoạn 1: cơm sau khi ủ bánh men 1 ngày

Giai đoạn 2: cơm sau khi ủ bánh men 2 ngày

Giai đoạn 3: cơm sau khi ủ bánh men 3 ngày

2.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

- Hóa chất vô cơ: HCl, KCl, NaNO3, MgSO4.7H2O, Na2HPO4,NaH2PO4

- Hóa chất hữu cơ: Tinh bột hòa tan, glycerol, focmol, saccharose

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5417 – Nhật

- Bể điều nhiệt kèm máy lắc Grant – Nhật

- Tủ ấm Incubator MiR.262 – Nhật

- Tủ lạnh Sanyo medicool – Nhật

- Máy so màu Biowate – Nhật

- Tủ cấy Labgard – Nhật

- Máy đo pH Hanna – Ý

- Cân phân tích của hang Sartorius – Đức

- Pipetman: Germany

2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân tích hóa sinh

2.3.1.1 Phương pháp xác định hoạt độ amylase

- Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp tạo màu với dung dịch Iod [25]

 Nguyên tắc :

Dùng tinh bột làm cơ chất Xác định hoạt độ phân giải tinh bột củaenzyme trên cơ sở định lượng tinh bột còn sót lại trong phản ứng màu vớithuốc thử Iod bằng cách xác định độ hấp thụ ánh sáng (OD) được đo trên máyquang phổ, bước sóng 660nm

Mẫu kiểm tra:

 Định nghĩa hoạt độ :

Một đơn vị hoạt độ amylase được định nghĩa là lượng enzyme có tác dụng

làm giảm 1% màu xanh (được biểu thị bởi mật độ quang) của dung dịch tinhbột 2% ở 500C, trong 10 phút

 Tính kết quả :

Trong đó:

ODKT: Mật độ quang của mẫu KTODPƯ: Mật độ quang của mẫu PƯ10: thời gian phản ứng (phút)

2.3.1.2 Xác định khả năng sinh tổng hợp Enzyme ngoại bào (Amylase) bằng phương pháp đục lỗ đĩa thạch

Bất hoạt enzyme bởi 2ml HCl 0.01M

Enzyme đã bất hoạt 100µl dung dịch tinh bột 2%

Tạo màu với 100µl dung dịch Iod 0.02N

Đo ODKT ở bước sóng 660nm

 Tiến hành:

Đổ 18ml dung dịch có chứa 0.2% tinh bột và 2% agar Đục lỗ sau khithạch đông và cho vào đó 0.1 ml dung dịch enzyme, giữ ở 500C Sau 2 - 3 giờđem nhuộm với Lugol rồi quan sát đường kính phần môi trường trong suốt ởchỗ enzyme tác dụng [3]

2.3.2 Phương pháp vi sinh vật [2]

2.3.2.1 Phân lập một số chủng nấm mốc

Quá trình phân lập giống được tiến hành theo sơ đồ sau:

Nguyên liệu đem phân lập là mẫu rượu được lấy ở từng giai đoạn saukhi ử bánh men tại các cơ sở sản xuất hộ gia đình, mẫu vật được hòa loãngbằng nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều Lấy 20µl dịch nước muối có chứa

vi sinh vật dàn đều trên môi trường Czapek (NaNO3 0.35%, KH2PO4 0.15%,MgSO4.7H2O 0.05%, KCl 0.05%, FeSO4 0.01%, saccaroza 3%, agar 2%) Saukhi nuôi ở 350C trong 24 đến 48 giờ, trên đĩa thạch đã xuất hiện các khuẩn lạc

vi sinh vật khác nhau Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này và dùng que cấylấy cẩn thận từng khuẩn lạc khác nhau cấy sang đĩa thạch khác Tiến hànhphân lập nhiều lần để tách riêng từng khuẩn lạc

2.3.2.2 Xác định hình thái, cấu tạo khuẩn lạc, tế bào của nấm mốc

Sử dụng phương pháp nuôi cấy nấm ở trên phiến kính để xác định hìnhthái, cấu tạo khuẩn lạc, tế bào của nấm mốc

 Chuẩn bị :

- Phiến kính dùng để nuôi cấy nấm phải thật trong, sạch

Nguồn phân lập Xử lý mẫu Pha loãng Môi trường phân lập

Nuôi trong tủ ấm

Khảo sát các đặcđiểm khuẩn lạc

Tuyển chọn và thu nhận

các chủng VSV làm đối

tượng nghiên cứu

- Khung thủy tinh hình chữ U đường kính nhỏ hơn 1cm hoặc có thểdùng khung nhôm có đường kính tương tự để thay thế Khung phải để vừa lọttrong lòng đĩa peptri.

- Đĩa peptri phải thật sạch

- Dung dịch glycerol 20%

- Dung dịch focmol

 Tiến hành theo các bước như sau :

+ Bước 1: Đổ vào đĩa peptri khoảng 10ml glycerol 20%.

+ Bước 2 : Đặt vào đó một giá đỡ hình chữ U sau đó đặt phiến kính lên trên + Bước 3: Nhỏ một giọt môi trường Czapek lên trên phiến kính.

+ Bước 4: Tiến hành cấy mốc lên trên giọt môi trường đó, sau đó đậy

nắp lại

+ Bước 5: Nuôi ở tủ ấm ở nhiệt độ 300C, 3 - 4 ngày

+ Bước 6: Đem phiến kính đã nuôi nhúng vào dung dịch focmol.

+ Bước 7: Soi kính hiển vi ở độ phóng đại 40x.

2.3.2.3 Phương pháp nuôi cấy bằng cách “bấm ngọn”.

Phương pháp này dùng để tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năngsinh tổng hợp amylase

 Nguyên tắc :

Chủng vi sinh vật vừa phân lập được nuôi cấy trên môi trường thíchhợp có bổ sung tinh bột để chúng phát triển thành khuẩn lạc Các enzyme đặctrưng được chúng tiết ra môi trường xung quanh dưới dạng vòng tròn trongsuốt bao quanh khuẩn lạc gọi là vòng thủy phân Căn cứ vào tỷ lệ đường kínhvòng thủy phân và đường kính của khuẩn lạc để đánh giá khả năng hình thànhenzyme của chủng vi sinh vật (còn gọi là hoạt tính enzyme của chủng vi sinhvật đó)

 Tiến hành:

Đặt các đĩa peptri có chứa môi trường thạch đã được vô trùng lên mặt

chóng đưa nhẹ que cấy có vi sinh vật vào hộp cấy dứt khoát một điểm xuốngmôi trường Đem nuôi cấy ở 28 - 300C sau 3 - 5 ngày theo dõi sự phát triển.Lấy ra, cho dung dịch Lugol tráng đều trên bề mặt thạch để trong 15 phút rồigạn bỏ đi, quan sát vòng thủy phân.

2.3.2.4 Phương pháp xác định số lượngbào tử

Dùng một loạt ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước muối sinh lý 0.85%

Từ ống nghiệm có chứa bào tử nấm mốc đã hòa trong nước muối sinh lý tadùng pipetman hút 1ml dịch bào tử (độ pha loãng của hỗn hợp dịch là 1/10)cho vào ống nghiệm thứ nhất Lắc đều xong từ ống nghiệm thứ nhất lại lấy 1mlhỗn hợp dịch bào tử cho sang ống thứ hai Cứ làm như vậy cho đến ống cuốicùng Ta được hỗn dịch có độ pha loãng từ 1/100, 1/1000, 1/10000 Tùy theomức độ đậm đặc của bào tử mà ta tiến hành hòa loãng ở nồng độ thích hợp, sau

đó ta dùng pipetman hút 1ml dịch bào tử đã pha loãng rồi trang ra đĩa môitrường thích hợp Nuôi ở tủ ấm ở nhiệt độ 300C cho đến khi trên bề mặt môitrường xuất hiện bào tử thì đem ra đếm bào tử Thường sau khi nuôi cấy mỗiđĩa có số khuẩn lạc từ 20 - 100 là vừa, khuẩn lạc nhiều quá sẽ ảnh hưởng tớikhả năng đếm, ít quá sẽ ảnh hưởng tới độ chính xác

2.3.2.5 Phương pháp nuôi cấy trên bề mặt (môi trường cám gạo) để thu nhận enzyme

Trong phương pháp nuôi bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt môitrường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng

Cấy 500µl dịch bào tử nấm mốc vào bình tam giác 100ml có chứa 10ggạo và 10ml dịch khoáng (thành phần và tỷ lệ khoáng giống môi trườngCzapek) đã thanh trùng và nuôi ở tủ ấm ở chế độ thích hợp

2.3.3 Phương pháp tách chiết enzyme

Cho 40ml dung dịch đệm Sorenshen (pH 7) vào trong môi trường bán rắn

đã nuôi nấm mốc, nghiền nhỏ Sau đó ly tâm ở 40C, 14000 vòng/phút trong 10phút

2.3.4 Phương pháp xác định tính chất của enzyme

2.3.4.1 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của enzyme

Ủ enzyme và cơ chất (tinh bột 2%) ở nhiệt độ cần khảo sát trong 10phút Sau đó xác định hoạt độ bằng phương pháp tạo màu với dung dịch Iod ởcùng nhiệt độ

2.3.4.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến phản ứng của enzyme.

Điều chỉnh pH của dung dịch cơ chất sao cho pH cuối cùng của hỗnhợp phản ứng enzyme và cơ chất có giá trị cần khảo sát Xác định hoạt độ củaenzyme theo phương pháp tạo màu với dung dịch Iod ở pH đó

2.3.5 Phương pháp phân tích phương sai ANOVA để xử lý số liệu.

Sử dụng phương pháp phân tích phương sai (Anova) để xác định sự saikhác giữa các trung bình [5] Kết quả phân tích phương sai được tóm tắt trênbảng sau:

Bảng 2.1.Bảng phân tích phương sai một nhân tố

Nguồn biến

động (source

of variation)

Độ tự do(Degree offreedom)

Tổng bìnhphương(sum ofsquares)

Trung bìnhbình phương(Meansquare

Ftính

Fbảng(α= 0.05hoặc 0.01)

SSA: Tổng bình phương các nghiệm thức (biểu thị sự sai khác do trungbình các nghiệm thức khác nhau)

SSE: Tổng bình phương sai số ngẫu nhiên (biểu thị sự sai khác trongcác mẫu của nghiệm thức)

SST0 : Tổng bình phương toàn bộ

MSA= aSSA-1; MSE=NSSE-1

Nếu Ftính > Fbảng thì kết luận các số trung bình khác nhau ở mức ý nghĩa

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào cao

3.1.1 Kết quả phân lập các chủng nấm mốc trong quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống

Tiến hành phân lập chủng nấm mốc trong các giai đoạn của quá trìnhlên men rượu theo phương pháp truyền thống trên địa bàn Thừa Thiên Huếtrên môi trường Czapek, ở 300C Kết quả chúng tôi phân lập được 10 chủngnấm mốc được ký hiệu từ R1 - R10 với một số đặc điểm của khuẩn lạc, đặcđiểm bào tử được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc phân lập

được sau 5 ngày nuôi

Stt Ký hiệu

Màu vàng nhạt khi bào

tử non, màu vàng nâukhi bào tử già

3 R3 Hình tròn có mép rìa hình tia,

dạng sợi

Màu trắng khi bào tửnon, màu xanh lá câyđậm khi bào tử gà

4 R4 Hình tròn có mép rìa hình tia,

7 R7 Hình tròn, dạng sợi

Màu trắng khi bào tửnon, màu xanh lá câynhạt khi già